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문제 정의
- DNFB는 histamine, tumor necrosis factor (TNF)-α, vascular endothelial growth factor (VEGF) 같은 다양한 pro-inflammatory cytokines이나mediators를 분비하는 것으로 알려져 있다. 두시 추출물을 이용한 하태독법 실시 후 아토피 유사 피부염을유발하여 일어나는 전염증효소, 염증전사인자, 염증효소, 염증세포의 apoptosis 변화를 면역조직학적 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구는 두시 추출물을 이용한 하태독법 실시 후 DNFB를 Ng/Nga 생쥐의 피부 국소부위에 반복적으로 처리하여 아토피 유사 피부염을 유발한 후 일어나는 전염증효소, 염증전사인자, 염증효소, 염증세포의 apopto-sis 변화를 관찰하여 하태독법의 아토피 유사 피부염의 항염증효과를 확인하고자 하였다.
- 하태독법의 항염증작용을 통한 아토피 유사 피부염의 조절효과를 조사하기 위해 행해진 본 연구는, 태령 3주에 두시 추출물로 하태독을 한 Nc/Nga 생쥐에 DNFB를 이용하여 아토피 유사 피부염을 유발한 후 피부의 면역조직학적 변화를 관찰하였다. 하태독법을 통하여 상피 세포 과형성, 과립백혈구와 림프구의 침윤 증가, 모세혈관 분포 증가 같은 피부 손상은 유의하게 완화되었다.
제안 방법
- 0.05% 3,3'-diaminobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05 M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다.
- 2%) 얻어 사용하였다. 3주령 Nc/Nga 생쥐 DT군에 3일동안 두시 추출물 20 ㎎/㎏을 경구투여하는 하태독법을 실시하였다.
- Anti-digoxigenin-perox-idase에 1시간 동안 반응시킨 후 DAB를 처리하였다. Eosin으로 대조염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- 우선 생쥐 등쪽 부위 피부를 면도한 다음 5% sodium dodeecyl sulfate (SDS: Sigma, USA) 1 ㎖을 면봉으로 20회 문질러서 각질층의 lipid lamella를 제거하고 acetone/olive (4 : 1)에 희석된 1% 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) 100 ㎕로 감작시켰다. 감작 후 7일과 14일째 2% DNFB 100 ㎕을 도포하여 아토피 유사 피부염을 유발하였다 (Fig. 1). 피부염 유발 72시간 후 sodium pentobarbital 용액으로 마취 후 처치하였다.
- 중앙실험동물 (한국)에서 분양받은 태령 3주된 13~15 g Nc/Nga 수컷 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군 (Ctrl군), 아토피 유사 피부염 유발군 (AE군), 하태독 처리 후 아토피 유사 피부염 유발군 (DT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다. 하태독법 실시 4주 후에 아토피 유사 피부염을 유발하였다.
- 이러한 태독을 제거하는 방법으로 하태독법을 사용하였는데, 이는 각각의 약재를 물에 달여 신생아에게 소량을 먹이는 방법이다10). 동의보감에서는 하태독법에 두시를 달인 물을 사용하고 있으며16), 본 연구에서는 이를 참고하여 두시 추출물 사용하여 하태독법을 시행하였다.
- 얻어진 등 쪽 피부를 10% NBF에 실온에서 24시간동안 고정한 후 통상적인 방법으로 paraffin에 포매하고 5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속절편은 Phloxine-tartrazine 염색하여 표본을 제작하였다. 본 연구과정은 부산대학교 동물실험윤리위원회 승인을 받아 시행되었으며 (IACUC number: PNU-2014-0732), 실험실 동물의 관리와 사용에 대해서는 NIH 가이드라인에 따라 시행되었다.
- 본 연구는 두시 추출물을 이용하여 하태독법을 시행한 NC/Nga 생쥐에서 아토피 유사 피부염을 유발한 후 항염증 효과 확인을 통해 하태독법 효능을 평가하였다. 기존 연구들과는 달리 본 연구는 실제 임상적 상황과 유사하도록 하태독법을 먼저 시행한 후 아토피 유사 피부염을 유발하여 염증 경감의 정도를 확인했다는 점이 가장 큰 차이점이다.
- 본 연구는 피부염을 인위적으로 유발하는 DNFB를 Ng/Nga 생쥐의 피부 국소부위에 반복적으로 처리한 후 아토피 유사 피부염을 유발하여 아토피 피부염 유사 동물모델을 만들었다11). DNFB는 histamine, tumor necrosis factor (TNF)-α, vascular endothelial growth factor (VEGF) 같은 다양한 pro-inflammatory cytokines이나mediators를 분비하는 것으로 알려져 있다.
- 본 연구에서는 먼저 외부 형태의 변화를 관찰하여 피부 손상 정도를 파악하였다. 반복적으로 DNFB를 감작한 결과 등 쪽 피부 각질층이 손상되었고 습진이 나타났으며, 가장자리 부근에서는 혈병도 관찰되었다.
- 45 μm syringe filter로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다. 시료의 분석은 HPLC를 이용하였으며 각 시료의 주요성분에 대한 sample choromatogram 결과는 Fig. 2에서 제시하였다. 분석결과 daidzin, daidzein, genistin, genistein이 검출되었다 (Fig.
- 피부염 유발 72시간 후 sodium pentobarbital 용액으로 마취 후 처치하였다. 얻어진 등 쪽 피부를 10% NBF에 실온에서 24시간동안 고정한 후 통상적인 방법으로 paraffin에 포매하고 5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속절편은 Phloxine-tartrazine 염색하여 표본을 제작하였다.
- 면역조직화학 결과와 반전 처리된 TUNEL assay의 결과는 image Pro Plus (Media cybernetics, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화 (means ± standard error) 하였다. 영상분석은 각 군의 표본에서 임의로 선정된 상피와 진피유두를 x400배율에서 촬영한 다음 positive pixels/전체 pixel (10,000,000 pixels)로 이루어졌다. 통계는 SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc.
- 하태독법 실시 4주 후에 아토피 유사 피부염을 유발하였다. 우선 생쥐 등쪽 부위 피부를 면도한 다음 5% sodium dodeecyl sulfate (SDS: Sigma, USA) 1 ㎖을 면봉으로 20회 문질러서 각질층의 lipid lamella를 제거하고 acetone/olive (4 : 1)에 희석된 1% 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) 100 ㎕로 감작시켰다. 감작 후 7일과 14일째 2% DNFB 100 ㎕을 도포하여 아토피 유사 피부염을 유발하였다 (Fig.
- 6 mL/min, 시료 주입량은 15 μL로 설정하였다. 이동상은 0.5% formic acid가 포함된 water (v/v; A)와 acetonitrile (B)로 구성하였고, 기울기 용리법을 이용하여 분석을 진행하였다 (기울기 용리 조건: initiation-5 min-2% B, 12 min-10% B, 20 min-25% B, 27 min-25% B, 25 min-80% B, 37 min-80% B, 40 min-30% B, 45 min-2% B). Palmitine, Berberine (ChemFaces, Wuhan, China) 및 Liquritin, Liquritigenin (Sigma-Aldrich, USA) 등의 지표물질 각 10 mg을 증류수 100 mL에 녹여 지표물질 혼합액을 제조하였다.
- 지표성분의 정량분석을 위해서 binary solvent delivery pump (G1312A), auto sampler (G1329A), column oven (G1316A), diode array detector (DAD; G1315D), vacuum degasser (G1322A) 등으로 구성된 HPLC system (Agilent technologies 1200 series; Agilent Technologies, CA, USA)을 사용하였다. 컬럼은 Capcell PAKMGII C18 (3.
- 피부를 절개하여 혈관의 직경 차이와 모세혈관 분포 차이를 확인하였다. 진피 쪽 혈관을 관찰한 결과, AE군에서 혈관분포가 증가한 반면, DT군에서는 감소하였다 (Fig.
- 대조군 (Ctrl군), 아토피 유사 피부염 유발군 (AE군), 하태독 처리 후 아토피 유사 피부염 유발군 (DT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다. 하태독법 실시 4주 후에 아토피 유사 피부염을 유발하였다. 우선 생쥐 등쪽 부위 피부를 면도한 다음 5% sodium dodeecyl sulfate (SDS: Sigma, USA) 1 ㎖을 면봉으로 20회 문질러서 각질층의 lipid lamella를 제거하고 acetone/olive (4 : 1)에 희석된 1% 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) 100 ㎕로 감작시켰다.
대상 데이터
- 5% formic acid가 포함된 water (v/v; A)와 acetonitrile (B)로 구성하였고, 기울기 용리법을 이용하여 분석을 진행하였다 (기울기 용리 조건: initiation-5 min-2% B, 12 min-10% B, 20 min-25% B, 27 min-25% B, 25 min-80% B, 37 min-80% B, 40 min-30% B, 45 min-2% B). Palmitine, Berberine (ChemFaces, Wuhan, China) 및 Liquritin, Liquritigenin (Sigma-Aldrich, USA) 등의 지표물질 각 10 mg을 증류수 100 mL에 녹여 지표물질 혼합액을 제조하였다. 시료 용액은 0.
- 시료 용액은 0.45 μm syringe filter로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다.
- 중앙실험동물 (한국)에서 분양받은 태령 3주된 13~15 g Nc/Nga 수컷 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군 (Ctrl군), 아토피 유사 피부염 유발군 (AE군), 하태독 처리 후 아토피 유사 피부염 유발군 (DT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다.
- 컬럼은 Capcell PAKMGII C18 (3.0 × 150 mm, 3.0 μm; Shiseido, Tokyo, Japan)을 사용하였고, 컬럼 온도는 35 ℃, 유속은 0.6 mL/min, 시료 주입량은 15 μL로 설정하였다.
데이터처리
- 면역조직화학 결과와 반전 처리된 TUNEL assay의 결과는 image Pro Plus (Media cybernetics, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화 (means ± standard error) 하였다.
- 통계는 SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc., USA)로 처리되었으며, one-way ANOVA 시행을 통해 유의성 (P<0.001)을 검증하고 Duncan’s mul-tiple range test로 사후 검증하였다.
이론/모형
- Apoptosis 변화를 조사하기 위해 in situ apoptosis de-tection kit (Apoptag, Intergen, USA)를 이용한 TUNEL (terminal deoxynucleotid transferase-mediated dUTP-bio-tin nick-end labelling) 방법을 실시하였다. 먼저 조직 절편을 proteinase K에 5분간 proteolysis 시킨 다음 equi-libration buffer에서 20초간 처리하였다.
- . 본 연구결과에서 염증 매개물질의 발현 감소가 염증성 세포 사멸로 인한 것인지 확인하기 위해 TUNEL assay를 실시하였다. DNFB에 의해 피부염이 유도된 군에서는 apoptotic cell이 거의 관찰되지 않았으나, 두시 추출물로 하태독법을 실시하고 피부염을 유발시킨 군에서는 약 2배 많은 apoptotic cell이 관찰되었다 (Fig.
- 출산 후 이러한 태독 (胎毒)을 제거하는 방법으로 두시법 (豆豉法), 감초법 (甘草法), 황련법 (黃連法), 주밀법 (朱蜜法) 등의 하태독법 (下胎毒法)을 사용하였다.
성능/효과
- AE군의 상피각질층, 상피 기저부, 진피 유두에서NF-κB p65 양성반응은 세포 핵 주변에서 강하게 나타났으며, DT군이 AE군에 비해 낮게 관찰되었다.
- 본 연구결과에서 염증 매개물질의 발현 감소가 염증성 세포 사멸로 인한 것인지 확인하기 위해 TUNEL assay를 실시하였다. DNFB에 의해 피부염이 유도된 군에서는 apoptotic cell이 거의 관찰되지 않았으나, 두시 추출물로 하태독법을 실시하고 피부염을 유발시킨 군에서는 약 2배 많은 apoptotic cell이 관찰되었다 (Fig. 5). 따라서 두시 추출물을 이용한 하태독법은 염증성 세포의 사멸을 유도하여 염증 매개물질의 분비와 전사인자의 발현을 유의적으로 감소시키고 아토피 피부염의 증상을 경감시킬 것으로 기대된다.
- . DNFB에 의해 피부염이 유도된 군에서는 iNOS가 상당히 높게 발현되었으나, 두시 추출물로 하태독법을 실시하고 피부염을 유발시킨 군에서는 유의적으로 iNOS 발현이 감소하였다 (Fig. 4).
- 또한 하태독법을 실시한 군에서 NF-κB p65, iNOS, COX-2 양성반응이 아토피 유도 피부염을 유도한 군보다 현저히 낮았다. TUNEL assay 결과, 피부염만 유발한 군보다 하태독법을 실시한 후 피부염을 유발한 군에서 apoptosis가 유의적으로 증가했다. 이러한 결과들은 하태독법이 과도한 염증 반응을 유발하는 세포들을 조절함으로써 염증 매개 물질 분비가 감소되고 염증 반응에 의한 피부 손상 역시 감소시킬 수 있음을 의미한다.
- 3). 따라서 두시 추출물을 이용한 하태독법은 피부 보호 효과, 피부 신생혈관 형성 억제, 상피층의 세포 과형성 및 기저층에서의 면역세포 침윤 억제를 통한 항염증 효과를 나타내는 것으로 생각된다.
- 또한 DNFB로 피부염을 유발한 군에서는 피부 상피 부위에 세포가 과형성되어 상피층 두께가 매우 두껍게 형성되어 있었으며, 피부 기저층에는 과립백혈구와 림프구와 같은 면역세포의 침윤이 증가되어 있었다.
- 또한 하태독법을 실시한 군에서 NF-κB p65, iNOS, COX-2 양성반응이 아토피 유도 피부염을 유도한 군보다 현저히 낮았다.
- 또한, 상피각질층, 상피 기저부, 진피 유두에서 관찰되는 iNOS 양성반응은 세포질 가장자리에서 강하게 나타났으며, AE군에 비해 DT군이 적은 것으로 관찰되었다. 영상분석결과 DT군에서는 AE군에 비해 62% 감소했다 (Fig.
- 본 연구에서는 먼저 외부 형태의 변화를 관찰하여 피부 손상 정도를 파악하였다. 반복적으로 DNFB를 감작한 결과 등 쪽 피부 각질층이 손상되었고 습진이 나타났으며, 가장자리 부근에서는 혈병도 관찰되었다. 그러나 담두시 추출물로 하태독법을 실시하고 피부염을 유발시킨 군에서는 피부 손상 정도가 현저히 낮았다 (Fig.
- . 본 연구에서 DNFB로 피부염을 유발한 후 피부 진피층의 모세혈관 분포를 조사하여 매우 많은 모세혈관들이 형성되었음을 확인하였다. 반면 두시 추출물로 하태독법을 실시하고 피부염을 유발시킨 군에서는 모세혈관이 상대적으로 적게 형성되어 있었다 (Fig.
- 본 연구에서 DNFB에 의해 피부염이 유도된 군에서는 NF-κB가 세포핵에서 상당히 높게 발현되었으며, COX-2의 발현도 상당히 높았다.
- 2에서 제시하였다. 분석결과 daidzin, daidzein, genistin, genistein이 검출되었다 (Fig. 2).
- 상피 기저부, 진피 유두에서 관찰되는 COX-2 양성반응은 세포질에서 강하게 나타났으며, AE군에 비해 DT군이 적은 것으로 관찰되었다. 영상분석결과 DT군에서는 AE군에 비해 51% 감소하였다 (Fig.
- 상피 기저부, 진피 유두에서 관찰되는 COX-2 양성반응은 세포질에서 강하게 나타났으며, AE군에 비해 DT군이 적은 것으로 관찰되었다. 영상분석결과 DT군에서는 AE군에 비해 51% 감소하였다 (Fig. 4).
- 또한, 상피각질층, 상피 기저부, 진피 유두에서 관찰되는 iNOS 양성반응은 세포질 가장자리에서 강하게 나타났으며, AE군에 비해 DT군이 적은 것으로 관찰되었다. 영상분석결과 DT군에서는 AE군에 비해 62% 감소했다 (Fig. 4).
- 진피 유두에서 관찰되는 apoptotic body는 AE군에 비해 DT군이 많은 것으로 관찰되었다. 영상분석결과 DT군에서는 AE군에 비해 68% 증가했다 (Fig. 5).
- AE군의 상피각질층, 상피 기저부, 진피 유두에서NF-κB p65 양성반응은 세포 핵 주변에서 강하게 나타났으며, DT군이 AE군에 비해 낮게 관찰되었다. 영상분석결과 DT군에서는 AE군에 비해 70% 감소하였다 (Fig. 4).
- 외부 형태 변화를 관찰한 결과, DNBF로 아토피 유사 피부염을 유발한 AE군의 피부 대부분 지역에서 각질층이 손상된 습진 (eczema)이 나타났으며, 일부 가장자리지역에서는 탈락과정에 있는 혈병 (blood clot)과표피 잔재도 관찰되었다. 이에 반해 하태독법을 시행한 후 피부염을 유발한 DT군은 피부손상이 적은 것으로 관찰되었다 (Fig.
- 외부 형태 변화를 관찰한 결과, DNBF로 아토피 유사 피부염을 유발한 AE군의 피부 대부분 지역에서 각질층이 손상된 습진 (eczema)이 나타났으며, 일부 가장자리지역에서는 탈락과정에 있는 혈병 (blood clot)과표피 잔재도 관찰되었다. 이에 반해 하태독법을 시행한 후 피부염을 유발한 DT군은 피부손상이 적은 것으로 관찰되었다 (Fig. 3).
- 피부를 절개하여 혈관의 직경 차이와 모세혈관 분포 차이를 확인하였다. 진피 쪽 혈관을 관찰한 결과, AE군에서 혈관분포가 증가한 반면, DT군에서는 감소하였다 (Fig. 3).
- 하태독법의 항염증작용을 통한 아토피 유사 피부염의 조절효과를 조사하기 위해 행해진 본 연구는, 태령 3주에 두시 추출물로 하태독을 한 Nc/Nga 생쥐에 DNFB를 이용하여 아토피 유사 피부염을 유발한 후 피부의 면역조직학적 변화를 관찰하였다. 하태독법을 통하여 상피 세포 과형성, 과립백혈구와 림프구의 침윤 증가, 모세혈관 분포 증가 같은 피부 손상은 유의하게 완화되었다. 이는 한의학에서 말하는 두시의 청열 기능이 열이 발생할 수 있는 부분들을 제어할 수 있다는 가능성을 보여준다.
후속연구
- 5). 따라서 두시 추출물을 이용한 하태독법은 염증성 세포의 사멸을 유도하여 염증 매개물질의 분비와 전사인자의 발현을 유의적으로 감소시키고 아토피 피부염의 증상을 경감시킬 것으로 기대된다.
- 이러한 결과들은 하태독법이 과도한 염증 반응을 유발하는 세포들을 조절함으로써 염증 매개 물질 분비가 감소되고 염증 반응에 의한 피부 손상 역시 감소시킬 수 있음을 의미한다. 향후 후속연구를 통하여 하태독법의 염증조절 기전과 임상연구를 위한 안정성 및 유효성 검증이 필요할 것으로 생각된다.
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