본 연구에서는 보리싹을 이용하여 항산화 활성 및 RAW 264.7 세포에서의 항염증 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 보리싹 에탄올 추출물의 DPPH라디칼 소거활성은 1,000 μg/ml 농도에서 92.82±0.62%로 나타났으며, RC50 값은 442.34±5.54 μg/ml이었다. 보리싹 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 17.55 μg/ml, 13.98 μg/ml로 나타났다. 또한 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에서 TNF-α와 PGE2 생성량은 LPS처리에 따라 증가하였으며, 보리싹 추출물 250, 500 μg/ml의 농도에서 유의적인 감소를 보였다. LPS에 의해 증가된 iNOS, COX-2 단백질 발현에 대해 보리싹 추출물 250 μg/ml의 농도에서 현저히 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 보리싹은 항산화 및 항염증 효과를 가진 천연물 소재로 활용 가능할 것으로 생각된다.
본 연구에서는 보리싹을 이용하여 항산화 활성 및 RAW 264.7 세포에서의 항염증 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 보리싹 에탄올 추출물의 DPPH라디칼 소거활성은 1,000 μg/ml 농도에서 92.82±0.62%로 나타났으며, RC50 값은 442.34±5.54 μg/ml이었다. 보리싹 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 17.55 μg/ml, 13.98 μg/ml로 나타났다. 또한 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에서 TNF-α와 PGE2 생성량은 LPS처리에 따라 증가하였으며, 보리싹 추출물 250, 500 μg/ml의 농도에서 유의적인 감소를 보였다. LPS에 의해 증가된 iNOS, COX-2 단백질 발현에 대해 보리싹 추출물 250 μg/ml의 농도에서 현저히 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 보리싹은 항산화 및 항염증 효과를 가진 천연물 소재로 활용 가능할 것으로 생각된다.
Barley (Hardeum vulgare L.) sprout has received much attention in recent years as a functional food in many countries, especially in Korea and Japan. It has been reported that barley sprouts are comprised of 52.6% polysaccharides, 34.1% proteins, and 4.97% fats, along with a variety of vitamins, min...
Barley (Hardeum vulgare L.) sprout has received much attention in recent years as a functional food in many countries, especially in Korea and Japan. It has been reported that barley sprouts are comprised of 52.6% polysaccharides, 34.1% proteins, and 4.97% fats, along with a variety of vitamins, minerals, and polyphenols. The purpose of this study was to assess the anti-oxidant and anti-inflammatory activities of the ethanol extracts of barley sprouts. We examined the inhibitory effect of barley sprout extracts (BSE) on inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression, and nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) and cytokine production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 mouse macrophage cells. BSE contains high amounts of phenolics and flavonoids and exhibits potent anti-oxidative activity, as depicted by the DPPH radical-scavenging experiment. The concentration of total phenols was 17.55 μg/ml, and flavonoids, 13.98 μg/ml. We also investigated the anti-inflammatory activities of BSE in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Tumor necrosis factor-alpha and PGE2 production, which had increased as a result of treatment with LPS, were significantly inhibited by BSE in a dose-dependent manner. BSE also significantly suppressed LPS-induced production of NO, and this was accompanied by a decrease in the expression of the iNOS and COX-2 proteins. These results indicate that barley sprouts may be a highly valuable natural product owing to its high-quality functional components as well as its anti-oxidant and anti-inflammatory activities.
Barley (Hardeum vulgare L.) sprout has received much attention in recent years as a functional food in many countries, especially in Korea and Japan. It has been reported that barley sprouts are comprised of 52.6% polysaccharides, 34.1% proteins, and 4.97% fats, along with a variety of vitamins, minerals, and polyphenols. The purpose of this study was to assess the anti-oxidant and anti-inflammatory activities of the ethanol extracts of barley sprouts. We examined the inhibitory effect of barley sprout extracts (BSE) on inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression, and nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) and cytokine production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 mouse macrophage cells. BSE contains high amounts of phenolics and flavonoids and exhibits potent anti-oxidative activity, as depicted by the DPPH radical-scavenging experiment. The concentration of total phenols was 17.55 μg/ml, and flavonoids, 13.98 μg/ml. We also investigated the anti-inflammatory activities of BSE in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Tumor necrosis factor-alpha and PGE2 production, which had increased as a result of treatment with LPS, were significantly inhibited by BSE in a dose-dependent manner. BSE also significantly suppressed LPS-induced production of NO, and this was accompanied by a decrease in the expression of the iNOS and COX-2 proteins. These results indicate that barley sprouts may be a highly valuable natural product owing to its high-quality functional components as well as its anti-oxidant and anti-inflammatory activities.
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문제 정의
또한, 염증 억제 약물들의 작용기전은 arachidonic acid를 PGE2로 전환시키는 효소인 COX-2의 활성저해와 관계가 깊다[38, 40]. 따라서 보리싹 추출물이 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포질 내에서의 iNOS와 COX- 2 단백질의 발현양을 조사하였다. 음성 대조군은 LPS (100 ng/ml) 처리로 인해 iNOS 단백질의 발현이 증가한 것을 확인하였으며, 보리싹 추출물을 각각 농도 별로 처리 하였을 때 250 μg/ml 에서부터 농도 의존적으로 iNOS의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
이에 본 연구에서는 보리싹 추출물을 이용하여 DPPH radi- cal 소거활성 및 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량을 조사하여 항산화 효과를 확인하고, LPS로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 cell을 통해 NO, PGE2의 활성과 함께 iNOS, COX-2의 단백질 발현에 미치는 보리싹의 항염증 효과를 확인하여 보리싹을 이용한 기능성 바이오 소재 개발을 위한 기초자료로 제공 및 응용하고자 한다.
제안 방법
단백질이 이동된 membranee fast green solution으로 transfer의 유무를 확인한 후, 5% non-fat skim milk solution 으로 blocking하였다. 4℃에서 일차 항체의 발현 정도를 검토하기 위하여 TST (Tris-Buffered Saline and Tween 20) 용액에 1:1, 000으로 희석하여 24시간 반응시킨 후 TST로 3회 세척하였다. 계속하여 이차항체를 2시간 TST 용액에 1:2000으로 희석하여 반응시키고 다시 TST로 3회 세척하였다.
DPPH radical에 대한 각 시료의 환원력을 측정하기 위해 99% 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 800 μl와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH용액 200 μl를 가하여 실온에 30분 방치한 후 biotekmicroplate spectrophotometer (Bio- tek instruments)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 유리 라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50 값으로 나타내었다.
병리적인 반응을 유도한다[43]. NO 생성 저해에 대한 보리싹 추출물의 효과를 알아보기 위해 lipopolysaccharide (LPS)로 NO의 생성을 유도한 뒤 50, 100, 250, 500 μg/ml 농도의 보리싹 추출물을 처리하고 생성된 NO의 양을 측정하였다 (Fig. 1A). LPS 처리군은 LPS 무첨가 군에 비하여 NO 생성량이 증가하는 것을 확인하였고, 보리싹 추출물을 농도별로 처리한 결과 모두 농도 유의적으로 NO 생성량이 감소하는 것을 확인 하였다.
7 cell을 DMEM배지를 이용하여 1×106 cells/ml 농도로 6 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후, 시료를 농도별로 처리하고 LPS (100 ng/ml)를 첨가하여 다시 24시간 배양시켰다. TNF-α의 생성량은 Commercial competitive en- zyme immunoassay kit (PEPROTECH, USA)을 이용하여 측정하였다. TNF-α antibody가 coating된 96well plate에 세포배양 상등액 100 μl를 첨가하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 wash buffer를 이용하여 수세한 후 Biotin conjugate (15 mM sodium azide) 100 μl를 첨가하여 다시 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음 수세한다.
, Columbus, Ohio, USA)을 5 mg/ml 농도로 10 μl를 각 well에 처리하고 incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 상등액을 제거하고 각 well에 100 μl의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 biotekmicroplate spectrophotometer로 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.
보리싹 추출물을 대상으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 알아보기 위해 합성 항산화제로 알려진 BHA와 비교하여 조사하였다. 보리싹 추출물의 DPPH radical 소거능은 Table 1에 나타내었고, DPPH radical을 50% 저해하는 시료의 농도를 RC50값으로 나타내었다.
COX-2는 염증과 같은 병적인 환경에서 대식세포, 단핵구, 조골세포 등에서 분비되며 조직이 손상되면 염증을 매개하는 물질들이 다량 생성되어 통증이 유발되게 된다[42]. 보리싹 추출물이 염증 매개물질을 억제할 수 있는지 알아보기 위해 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포를 대상으로 PGE2 및 TNF-α 생성량을 조사하였다(Fig. 2B). 먼저 PGE2의 경우에는 Raw 264.
이는 색소 화합물인 플라보노이드와탄닌이 주성분으로 항산화, 항균, 항암, 충치예방 등의 생리기능을 가지는 것으로 알려져 있다[2]. 본 실험에서는 보리싹 추출물에 존재하는 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 각각 tannic acid, quercetin을 기준 물질로 하여 측정하였다(Table 2). 그 결과, 보리싹 추출물의 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량은 각각 17.
제공받아 사용하였다. 시료는 불순물을 제거하기 위해 수세한 후 건조하여 사용하였고, 무게의 10배량(w/v)의 70% 에탄올을 가하여 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출 하였다. 추출액은 여과지(Whatman NO.
즉 각 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 ml에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 ml에 2배 희석한 Folin 시약 2 ml을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 ml을 넣고 1시간 반응 시킨 후 biotekmicroplate spectrophotometer (Biotek instruments)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이때 tannic acid를 이용한 표준곡선은 5, 10, 25, 50, 75, 100 μg/ml가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
각 시료 추출물의 유리 라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50 값으로 나타내었다. 이때 활성비교를 위하여 합성 항산화제인 butylated hydroxyl anisole (BHA)를 사용하여 항산화 효과를 측정하였다.
Karki [14] 등이 연구한 메밀순 추출물의 NO 생성량은 50, 100 μg/ml 농도에서 약 52, 45 μM이였으며, 보리싹 추출물은 26, 22 μM이었다. 이러한 NO 생성 저해가 세포독성에 기인하는 것인지를 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 세포독성을 확인하였다(Fig. 1B). 그 결과 보리싹 추출물의 50 μg/ml 에서 500 μg/ml의 전 농도 범위에서 100% 이상의 생존율을 보여 세포 생장에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
즉 각 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 ml에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 ml에 2배 희석한 Folin 시약 2 ml을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 ml을 넣고 1시간 반응 시킨 후 biotekmicroplate spectrophotometer (Biotek instruments)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이때 tannic acid를 이용한 표준곡선은 5, 10, 25, 50, 75, 100 μg/ml가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
계속하여 이차항체를 2시간 TST 용액에 1:2000으로 희석하여 반응시키고 다시 TST로 3회 세척하였다. 증류수로 한번 더 세척하고 membrane에 ECL detection kit (WSE-7120s, ATTO Co., Tokyo, Japan)의 발색시약 Ⅰ과 Ⅱ를 1:1로 섞은 후에 혼합액을 도포하고, X-ray film (CP-G plus, Agfa Health- care Ltd, New Orleans, LA, USA)에 노출하여 현상한 후 film 상에서 iNOS, COX-2의 발현정도를 관찰하였다.
3 ml를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 biotekmicroplate spectro- photometer (Biotek instruments)를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin을 사용하였으며, 표준물질의 검량선과 비교하여 함량을 구하였다.
대상 데이터
1% naphthylethylendi- amine in 25% phosphoric acid) 100 μl를 혼합하여 96 well plates에서 10분간 반응시킨 후 biotekmicroplate spectropho- tometer를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO2 - 표준곡선은 NaNO2를 농도별로 조제하여 사용하였다.
대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포주는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받았으며, 10% FBS (fetal bovine serum)와 1% antibiotics (penicillin/streptomycin)를 첨가한 Dulbeco’s modified Eagle’s medium high glucose (DMEM) (Welgene, Daegu, Korea)배지를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ incubator에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다. 세포는 D60 culture dish (1×106 cells/dish) 및 6 well plate (5×105 cells/dish)에 주입하여 부착시키고, 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후, lipopolysaccharide (LPS) 100 ng/ml를 첨가하여 24시간 배양시킨 후 실험에 이용하였다.
본 실험에서 사용한 보리싹은 (주)에이팜(Daegu, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 시료는 불순물을 제거하기 위해 수세한 후 건조하여 사용하였고, 무게의 10배량(w/v)의 70% 에탄올을 가하여 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출 하였다.
활성화된 RAW 264.7 세포로부터 생성되는 염증 매개 물질인 PGE2의 양을 측정하기 위해 Commercial competitive en- zyme immunoassay kit (Cayman Chemicals, San Diego, CA, USA)를 구입하여 실험하였다. Raw 264.
데이터처리
모든 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의성 검사는 SPSS TM version 21 (SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 one-way ANOVA 를 실시하였고, 대조구인 분화 Control에 대한 시료 처리구의 통계적 유의성은 Duncan’s multiple range test로 검증하였다. p<0.
이론/모형
RAW 264.7 세포로부터 생성되는 활성질소종인 nitric ox- ide (NO)의 양은 Green 등[5]의 방법을 이용하여 세포 배양액 중 존재하는 NO2 -형태를 Griess Reagent와 반응시켜 측정하였다. RAW 264.
보리싹 추출물이 염증반응에서 발현하는 인자들의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 Western bolt을 실시하였다. RAW 264.
시료 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno법 [33]을 이용하여 측정하였다. 각 시료 추출물 0.
시료의 세포증식과 독성을 측정하기 위해 Green 등의 방법 [4]에 따라 3-(3, 4-dimethyl- thiazolyl-2)-2, 5-diphenyl tetrazo- lium bromide (MTT) assay를 실시하였다. MTT assay는 미토콘드리아의 탈 수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT가 불용성의 보라색 formazan으로 환원되는 원리를 이용한 방법으로, 생성된 formazan의 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다.
총 폴리페놀 함럄은 Folin-Denis법[3]을 응용하여 측정하였다. 즉 각 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 ml에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 ml에 2배 희석한 Folin 시약 2 ml을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 ml을 넣고 1시간 반응 시킨 후 biotekmicroplate spectrophotometer (Biotek instruments)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
성능/효과
40 μg/mg으로 나타났다. 5종 보리와 비교해본 결과 본 논문에서 연구한 보리싹 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량(폴리페놀: 17.55 μg/mg, 플라보노이드: 13.98 μg/mg)이 더 높은 편임을 알 수 있었다.
1A). LPS 처리군은 LPS 무첨가 군에 비하여 NO 생성량이 증가하는 것을 확인하였고, 보리싹 추출물을 농도별로 처리한 결과 모두 농도 유의적으로 NO 생성량이 감소하는 것을 확인 하였다. Karki [14] 등이 연구한 메밀순 추출물의 NO 생성량은 50, 100 μg/ml 농도에서 약 52, 45 μM이였으며, 보리싹 추출물은 26, 22 μM이었다.
2A). TNF-α 생성은 LPS 무처리군에 비하여 LPS 처리구에서 200배 이상 크게 증가하였으며, 보리싹 추출물을 250, 500 μg/ml 농도로 처리하였을 때 TNF-α의 생성이 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 2B).
1B). 그 결과 보리싹 추출물의 50 μg/ml 에서 500 μg/ml의 전 농도 범위에서 100% 이상의 생존율을 보여 세포 생장에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
본 실험에서는 보리싹 추출물에 존재하는 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 각각 tannic acid, quercetin을 기준 물질로 하여 측정하였다(Table 2). 그 결과, 보리싹 추출물의 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량은 각각 17.55±0.53, 13.98±6.91 μg/mg으로 나타났다. Kim [17] 등이 연구한 발아 벼 부위별 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량과 비교하였을 때 발아 벼 11.
3). 또한, COX-2 단백질 역시 LPS 처리로 인해 그 발현량이 증가하였으며, 보리싹 추출물 50, 100 μg/ml 에서는 COX-2의 발현의 변화가 거의 없었지만 250 μg/ml에서 COX-2의 발현이 크게 억제되는 것을 확인 할 수 있었다. Karki [14] 등과 Kim [22] 등은 NO 저해 활성이 높게 나타난 메밀순과 왕주똥나무잎 추출물에서 iNOS 단백질 발현을 저해한다고 보고하였으며, 보리싹 추출물의 NO 생성과 iNOS 단백질 발현 저해와 유사한 경향을 확인하였다.
2B). 먼저 PGE2의 경우에는 Raw 264.7 세포에 100 ng/ml의 LPS를 처리했을 때, 처리 하지 않은 군에 비해 PGE2의 생성량이 급격히 증가되었으며, 보리싹 추출물을 250, 500 μ g/ml의농도로 처리 했을 때 250 μg/ml에서는 미미하였지만, 500 μ g/ml에서 PGE2의 생성량이 현저하게 감소하였다(Fig. 2A). TNF-α 생성은 LPS 무처리군에 비하여 LPS 처리구에서 200배 이상 크게 증가하였으며, 보리싹 추출물을 250, 500 μg/ml 농도로 처리하였을 때 TNF-α의 생성이 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다(Fig.
따라서 보리싹 추출물이 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포질 내에서의 iNOS와 COX- 2 단백질의 발현양을 조사하였다. 음성 대조군은 LPS (100 ng/ml) 처리로 인해 iNOS 단백질의 발현이 증가한 것을 확인하였으며, 보리싹 추출물을 각각 농도 별로 처리 하였을 때 250 μg/ml 에서부터 농도 의존적으로 iNOS의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 또한, COX-2 단백질 역시 LPS 처리로 인해 그 발현량이 증가하였으며, 보리싹 추출물 50, 100 μg/ml 에서는 COX-2의 발현의 변화가 거의 없었지만 250 μg/ml에서 COX-2의 발현이 크게 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.
후속연구
또한, Park [36] 등과 Huang [7] 등의 연구에서는 철쭉나무와 자소 잎 추출물이 COX-2 단백질의 발현 저해를 통해 염증성 사이토카인(PGE2, TNF-a)이 감소됨을 확인하였다. 향후 보리싹 추출물의 항염증 활성을 중심으로 기전 연구와 활성성분 규명에 대한 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것이다.
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