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문제 정의
- lactis 등의 유산균들이 발효에 관여한다는 것을 밝혀냈다13). 이에 본 연구에서는 삼정환의 천연발효 과정에서 추출한 상기 유산균을 접종하여 발효시켰으며 이러한 발효과정에서 나타나는 미생물의 변화와 항산화 활성을 관찰하였다.
- lactis임을 밝혀냈다12). 이에 본 연구에서는 상기 2종의 유산균을 숙성 전 삼정환에 재접종하여 발효되는 동안 나타나는 미생물의 변화와 발효 특성 및 항산화 활성에 미치는 영향 등을 살펴봄으로써 삼정환 발효의 표준화와 나아가 발효 한약의 표준 정량화에 기여하고자 하였다.
- 9%로 가장 높게 측정되며 유의성 있는 결과를 나타내 투약의 적절한 농도였음을 확인해볼 수 있었다. 한약재들의 항산화작용이 항비만, 항지질작용과 큰 연관성18)을 갖고 있으므로 발효삼정환항산화 기전에 대한 이해를 통해 추후 항비만, 항지질작용을 규명하기 위한 연구로 이어질 수 있다. 본 연구는 기존의 연구를 통해 삼정환의 발효에 주로 관여하는 상기 유산균들을 삼정환 발효에 재접종하여 무접종군과의 발효대사물의 차이를 비교해보았으며 이를 통해 추후 발효삼정환의 제품화 시 발효에 사용할 유산균 선별을 위한 초석을 다졌으나 접종군에서의 발효대사물 함량의 뚜렷한 효능차이가 보이지는 않아 추후 지속적인 연구를 통하여 발효대사물들 간의 차이와 발효기전에 대한 이해를 통해 항비만, 항지질 효과에 대한 규명이 필요할 것으로 여겨진다.
제안 방법
- 2% Na2CO31 ml에 시료 50 μl, 50% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 50 μl를 혼합한 후 실온에서 10분간 반응시키고 720 nm에서 UV ELISA microplate reader를 이용해 흡광도를 측정하였다.
- 배양은 30℃에서48시간 배양하였고 이후 MRS agar와 M17 agar plate에서 자란 콜로니 중 무작위로 10개씩 선발하여 순수배양하였다. Genomic DNA를 추출하였고 DNA의 염기서열 분석은 Macrogen Inc. (Seoul, Korea)에 의뢰하였으며, 분석된 염기서열은 미국 국립생명정보센터(National Center for Biotechnology Information)에서 BLAST 분석하여 동정하였다.
- HepG2 세포에 삼정환 추출물을 처리한 후 H2O2를 처리하여 세포독성을 일으켜 접종군 및 무접종군 간의 농도별 세포생존율을 비교하였다. 발효 전 삼정환 단독투여군, 유산균 접종군, 유산균 미접종균 모두에서 무처리 대조군에 비해 세포생존율이 상승하는 경향을 보였다.
- 1) 1종과 Lactococcus lactis subsp. lactis (NC 002662.1) 1종을 각각 한 종씩 선택하여 MRS broth에서 37℃, 24시간 동안 활성시킨 후 접종하였다. 유산균을 접종한 삼정환은 전통 숙성 과정 환경과 유사한 25℃를 유지하며 선행연구13) 에서 급격한 미생물의 변화가 일어난 시점인 1주일간의 발효 후 시료로 사용하였다.
- 발효 후 무접종군과 접종군 간의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량의 차이를 비교하였다. 발효전 삼정환의 총 폴리페놀 함량은 1.
- 발효 후 삼정환의 생리활성의 변화를 비교해보기 위해 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량을 분석하였다. 발효음식에서 페놀화합물들은 유산균의 대사과정을 통해 발생하며 항산화활성 및 여러 인체에 유익한 작용을 하는 대사물질로 알려져 있다17).
- 발효과정 중 pH 변화를 측정하기 위하여 1 g의 시료를 9 ml의 0.85% NaCl로 희석한 후 pH를 측정하였다.
- 희석된 시료는 선발 배지에 100 μl씩 분주하여 도말 후 배양하였다. 발효삼정환 내 총 유산균 수를 분석하기 위해 MRS agar (Difco) 배지를 사용하였으며 Lactobacillus 속의 세균 수를 분석하기 위해 LBS agar (MB Cell)를 사용하였고 Lactococcus 속의 세균 수를 분석하기 위해서는 M17 agar (Difco)를 사용하였다. 배양은 30℃에서 48시간 배양하였고 생균 수는 생성 콜로니 개수(colony forming units per gram, CFU/g)로 나타냈다.
- 발효삼정환의 항산화 활성 및 간세포 보호 효과에 대해 알아보기 위해 HepG2 cell을 배양하여 처리후 DPPH free radical 소거능을 측정하였다. 발효 후 접종군은 59.
- 삼정환 발효 중 free radical 소거활성의 변화를 확인하기 위해 free radical인 DPPH (Sigma-Aldrich)에 대한 환원력을 측정하였다. DPPH는 ethanol에 용해시켜 0.
- 상심자, 지골피, 창출을 각각 20:1:1 중량 비율로 혼합하여 삼정환을 조제한 후 유산균을 접종하였다. 유산균은 천연 발효삼정환에서 분리한 Lactobacillus brevis (NC 008497.
- 삼정환의 구성재료인 상심자, 지골피, 창출은 동국대학교 일산한방병원에서 구입하였으며 상심자는 분쇄하여 즙으로 제조하였고 지골피, 창출은 분쇄하여 건조시료를 사용하였다. 상심자, 지골피, 창출을 각각 20:1:1 중량 비율로 혼합하여 옹기에 담아 통풍이 잘 되고 25℃가 유지되는 서늘한 곳에서 5주간 발효시켰다.
- 유산균 생균 수와 더불어 발효 정도 차이를 비교하기 위해 pH도 함께 비교하였다. 발효 전 삼정환에서 pH는 4.
- 유산균 접종 후 발효 전과 미접종군과의 pH와 총 유산균 수를 비교함으로써 발효 정도를 파악하였다. 발효 전 삼정 환의 pH는 4.
- , Lactococcus sp.의 생균 수를 조사하였다. 발효 전 총 균 수는 7.
- 발효음식에서 페놀화합물들은 유산균의 대사과정을 통해 발생하며 항산화활성 및 여러 인체에 유익한 작용을 하는 대사물질로 알려져 있다17). 이를 비교하여 발효대사물 생성정도를 비교하였다. 발효 후 총 폴리페놀 함량은 접종군에서는 1.
- 5 mM H2O2를 처리한 다음 24시간 배양하였다. 이후 EZ-Cytox 시약을 이용하여 cell viability를 측정하였다.
- 희석된 시료는 선발 배지에 100 μl씩 분주하여 도말 후 배양하였다. 전체 유산균 수를 배양하기 위해 MRS agar (Difco, Franklin, NJ, USA) 배지를 사용하였고, Lactobacillus 속의 유산균을 배양하기 위해 LBS agar (MB Cell, Los Angeles, CA, USA) 를 사용하였으며 Lactococcus 속의 유산균을 배양하기 위해서는 M17 agar (Difco)를 사용하였다. 배양은 30℃에서48시간 배양하였고 이후 MRS agar와 M17 agar plate에서 자란 콜로니 중 무작위로 10개씩 선발하여 순수배양하였다.
- 천연발효를 통해 추출한 유산균을 접종한 삼정환과 접종하지 않은 두 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 두 군의 발효정도를 비교하기 위해 총 유산균 수와 pH를 비교하였으며 총 유산균 수는 무접종군에서 더 큰 차이를 보였으며 접종군에서 더 큰 pH 변화가 일어났다.
대상 데이터
- 5주간의 발효가 진행된 삼정환에서 시료를 채취하여 실험을 진행하였다. 세균 수를 분석하기 위해 시료는 각각 2 g 씩 18 ml 0.
- 300 μl를 혼합하여 5분간 반응시킨 다음 1 M NaOH 2 ml로 반응을 정지시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Chatechin (Sigma-Aldrich)을 표준물질로 사용하였고 표준곡선을 작성하여 총 플라보노이드 함량을 환산하여 표시하였다.
- Louis, MO, USA) 50 μl를 혼합한 후 실온에서 10분간 반응시키고 720 nm에서 UV ELISA microplate reader를 이용해 흡광도를 측정하였다. Gallic acid (Sigma-Aldrich)를 표준물질로 사용하였고 표준곡선을 작성하여 총 폴리페놀 함량을 환산하여 표시하였다.
- 삼정환의 구성재료인 상심자, 지골피, 창출은 동국대학교 일산한방병원에서 구입하였으며 상심자는 분쇄하여 즙으로 제조하였고 지골피, 창출은 분쇄하여 건조시료를 사용하였다. 상심자, 지골피, 창출을 각각 20:1:1 중량 비율로 혼합하여 옹기에 담아 통풍이 잘 되고 25℃가 유지되는 서늘한 곳에서 5주간 발효시켰다.
- 1) 1종을 각각 한 종씩 선택하여 MRS broth에서 37℃, 24시간 동안 활성시킨 후 접종하였다. 유산균을 접종한 삼정환은 전통 숙성 과정 환경과 유사한 25℃를 유지하며 선행연구13) 에서 급격한 미생물의 변화가 일어난 시점인 1주일간의 발효 후 시료로 사용하였다.
- 인간 간암 세포주인 HepG2 세포(HB8065)는 한국세포주은행(Korea)으로부터 분양 받아 계대 배양하여 사용하였다. HepG2 cell lined은 10% fetal bovin serum (Hyclone; GE Healthcare, Chicago, IL, USA)과 100 units/ml penicillin and streptomycin이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium을 이용하여 배양하였다.
데이터처리
- 각 실험군 간의 통계적인 분석은 Student’s t-test를 통해 시행하였다.
- 각 실험군 간의 통계적인 분석은 Student’s t-test를 통해 시행하였다. 모든 실험은 1회 시행하였으며 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량, DPPH 라디컬 소거능, 세포 생존율 분석은 3개의 well을 사용해 측정한 평균값을 사용하였다. 통계적 유의성은 P값이 0.
- 측정값은 평균값±표준편차(mean±standard deviation) 로 표시하였다.
이론/모형
- 세포 생존율의 측정은 Ez-Cytox cell viability assay kit (DAEIL Lab, Seoul, Korea)를 사용하였다. 약재를 처리한 후 분화된 HepG2 세포에 EZ-Cytox 시약을 첨가하여 2시간 동안 반응시킨 후 UV ELISA microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 총 페놀함량은 Folin-Ciocalteu 방법을 이용하여 측정하였다. 재발효한 삼정환 시료를 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 얻어 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 05 log CFU/g 측정되었다. Lactobacillus 속의 생균 수는 발효 전 7.02 log CFU/g이었으며 1주일간의 발효 후 접종군에서는 8.48 log CFU/g, 무접종군에서는 9.02 log CFU/g이 측정되어 무접종균에서 더 많은 미생물의 분화가 일어났을 것으로 예상된다. Lactococcus 속 생균수는 발효 전 7.
- 55 log CFU/g으로 두 군 모두에서 증가하였다. Lactobacillus 속의 생균수는 발효전 7.02 log CFU/g이었으며 1주일간의 발효 후 무접종군에서는 9.02 log CFU/g, 접종군에서는 8.48 log CFU/g으로 두 군 모두에서 증가하였다. Lactococcus 속 생균 수는 발효 전 7.
- 48 log CFU/g으로 두 군 모두에서 증가하였다. Lactococcus 속 생균 수는 발효 전 7.10 log CFU/g으로 측정되었으나 발효 후 무접종군, 접종군 모두에서 발견되지 않았다(Fig. 1).
- 천연발효를 통해 추출한 유산균을 접종한 삼정환과 접종하지 않은 두 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 두 군의 발효정도를 비교하기 위해 총 유산균 수와 pH를 비교하였으며 총 유산균 수는 무접종군에서 더 큰 차이를 보였으며 접종군에서 더 큰 pH 변화가 일어났다. 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, DPPH 활성산소 소거능, 세포생존율에서는 접종 군이 더 우세한 결과가 나타났다.
- 발효 전 삼정환 단독투여군, 유산균 접종군, 유산균 미접종균 모두에서 무처리 대조군에 비해 세포생존율이 상승하는 경향을 보였다. 발효 전 삼정 환군에서는 1 mg/ml 처리군에서 62.7%로 세포생존율이 가장 높게 측정되었으나 유의성이 보이지는 않았으며 4mg/ml 처리군에서 60.4%로 측정되어 유의성 있는 결과를 보였다(P=0.005). 유산균 접종군에서는 4 mg/ml 처리군에서 62.
- 를 처리하여 세포독성을 일으켜 접종군 및 무접종군 간의 농도별 세포생존율을 비교하였다. 발효 전 삼정환 단독투여군, 유산균 접종군, 유산균 미접종균 모두에서 무처리 대조군에 비해 세포생존율이 상승하는 경향을 보였다. 발효 전 삼정 환군에서는 1 mg/ml 처리군에서 62.
- 유산균 생균 수와 더불어 발효 정도 차이를 비교하기 위해 pH도 함께 비교하였다. 발효 전 삼정환에서 pH는 4.81이 측정되었으며 발효 후 무접종군에서는 4.12, 접종군에서는 3.66으로 접종군에서의 pH가 더 낮게 측정되었다(Fig. 2).
- 발효 전 삼정환의 DPPH free radical 소거능은 33.96%에서 발효 후 접종군은 59.15%, 무접종군에서는 59.21%로 측정되었고 두 군 다 모두 유의성 있는 증가를 보였다(P=0.0001, P=0.0001) 무접종군이 접종군에 비해 소거능 활성이 소폭 증가되었다고 측정되었으나 유의적 차이는 보이지 않았다(Fig. 5).
- 046). 발효 전 삼정환의 총 플라보노이드 함량은 0.706 mg/g이었으며 발효 후 접종군에서는 1.240 mg/g, 무접종군에서는 1.203 mg/g으로 두 군 모두 유의성 있는 증가를 보였다(P=0.00009, P=0.0001) (Fig. 4). 발효 후 두 군 간의 총 플라보노이드 함량에는 유의한 차이가 보이지는 않았다.
- 의 생균 수를 조사하였다. 발효 전 총 균 수는 7.31 log CFU/g이었으며 1주일간의 발효 후 무접종군의 총 유산균 수는 9.05 log CFU/g, 접종군의 총 유산균 수는 8.55 log CFU/g으로 두 군 모두에서 증가하였다. Lactobacillus 속의 생균수는 발효전 7.
- 3). 발효 후 두 군 간의 총 폴리페놀 함량을 비교하였을 때 접종군에서 무접종군에 비해 유의성 있게 증가되어 있는 것으로 나타났다(P=0.046). 발효 전 삼정환의 총 플라보노이드 함량은 0.
- 발효삼정환의 항산화 활성 및 간세포 보호 효과에 대해 알아보기 위해 HepG2 cell을 배양하여 처리후 DPPH free radical 소거능을 측정하였다. 발효 후 접종군은 59.15%, 무접종군에서는 59.21%로 측정되어 발효 전 33.96% 측정값에 비해 유의성 있는 증가를 보여 항산화 작용이 더 증가 되었다고 할 수 있다. 하지만 두 군 간의 유의성 있는 차이는 보이지 않아 유산균 접종군의 항산화 활성의 우세성을 알아보기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이를 비교하여 발효대사물 생성정도를 비교하였다. 발효 후 총 폴리페놀 함량은 접종군에서는 1.798 mg/g, 무접종군에서는 1.639 mg/g으로 측정되어 발효 전 삼정환의 1.219 mg/g에 비해 두 군 모두 유의성 있는 증가를 보였다. 발효 후 두 군 간의 비교에서 접종군이 무접종군에 비해 유의성 있는 차이를 보였으며 이는 접종군에서 인체에 유익한 대사물들을 더 생성했을 것으로 유추해볼 수 있다.
- 발효 후 두 군 간의 비교에서 접종군이 무접종군에 비해 유의성 있는 차이를 보였으며 이는 접종군에서 인체에 유익한 대사물들을 더 생성했을 것으로 유추해볼 수 있다. 발효 후 총 플라보이드 함량은 접종군에서는 1.240 mg/g, 무접종군에서는 1.203 mg/g으로 발효 전 0.706 mg/g에 비해 두 군 모두 유의성 있는 증가를 보였으나, 두 군 간에는 유의성 있는 차이는 보이지 않아 상기 유산균들의 발효대사물 차이를 비교해보는 지표로 사용하기에는 한계를 가질 것으로 생각된다.
- 발효 후 무접종군과 접종군 간의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량의 차이를 비교하였다. 발효전 삼정환의 총 폴리페놀 함량은 1.219 mg/g이었으며 발효 후 접종군에서는 1.798 mg/g, 무접종군에서는 1.639 mg/g으로 두 군 모두 유의성 있는 증가를 보였다(P=0.0001, P=0.002) (Fig. 3). 발효 후 두 군 간의 총 폴리페놀 함량을 비교하였을 때 접종군에서 무접종군에 비해 유의성 있게 증가되어 있는 것으로 나타났다(P=0.
- 013). 유산균 미접종군에서는 모든 농도에서 유의성이 보이지 않았으며 4 mg/ml 처리군에서 세포생존율이 60.7%로 가장 높은 측정값이 측정되었다 (Fig. 6).
- 세포 생존율에서는 삼정환 처리군이 H2O2 단독군에 비해 증가되는 경향을 보이며 일부 측정값에서 유의성 있는 증가를 보여 세포독성에 대한 보호효과를 가질 것으로 생각된다. 유산균 접종군 중 4 mg/ml에서 62.9%로 가장 높게 측정되며 유의성 있는 결과를 나타내 투약의 적절한 농도였음을 확인해볼 수 있었다. 한약재들의 항산화작용이 항비만, 항지질작용과 큰 연관성18)을 갖고 있으므로 발효삼정환항산화 기전에 대한 이해를 통해 추후 항비만, 항지질작용을 규명하기 위한 연구로 이어질 수 있다.
- 005). 유산균 접종군에서는 4 mg/ml 처리군에서 62.9%로 세포생존율이 가장 높게 측정되었으며 유의성 있는 증가를 보였다(P=0.013). 유산균 미접종군에서는 모든 농도에서 유의성이 보이지 않았으며 4 mg/ml 처리군에서 세포생존율이 60.
- 12가 측정되어 접종군에서 발효가 더 빨리 진행되었다고 예상된다. 총 유산균 수 분석에서 발효 전 삼정환에서 7.31 log CFU/g으로 측정되었고 1주일간의 발효 후 접종군에서 8.55 log CFU/g이 측정되었으며 무접종군에서 9.05 log CFU/g 측정되었다. Lactobacillus 속의 생균 수는 발효 전 7.
- 두 군의 발효정도를 비교하기 위해 총 유산균 수와 pH를 비교하였으며 총 유산균 수는 무접종군에서 더 큰 차이를 보였으며 접종군에서 더 큰 pH 변화가 일어났다. 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, DPPH 활성산소 소거능, 세포생존율에서는 접종 군이 더 우세한 결과가 나타났다. 무접종군의 경우 접종군에 비해 미생물 수의 증가를 통해 발효정도가 더 진행되었다고 예상된다.
후속연구
- 02 log CFU/g이 측정되어 무접종균에서 더 많은 미생물의 분화가 일어났을 것으로 예상된다. Lactococcus 속 생균수는 발효 전 7.10 log CFU/g 측정되었으나 발효 후 무접종군, 접종군 모두에서 발견되지 않아 추후 추가적인 연구를 통해 각 유산균의 발효기전에 대한 이해가 필요할 것으로 생각된다.
- 한약재들의 항산화작용이 항비만, 항지질작용과 큰 연관성18)을 갖고 있으므로 발효삼정환항산화 기전에 대한 이해를 통해 추후 항비만, 항지질작용을 규명하기 위한 연구로 이어질 수 있다. 본 연구는 기존의 연구를 통해 삼정환의 발효에 주로 관여하는 상기 유산균들을 삼정환 발효에 재접종하여 무접종군과의 발효대사물의 차이를 비교해보았으며 이를 통해 추후 발효삼정환의 제품화 시 발효에 사용할 유산균 선별을 위한 초석을 다졌으나 접종군에서의 발효대사물 함량의 뚜렷한 효능차이가 보이지는 않아 추후 지속적인 연구를 통하여 발효대사물들 간의 차이와 발효기전에 대한 이해를 통해 항비만, 항지질 효과에 대한 규명이 필요할 것으로 여겨진다.
- 하지만 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량에서 접종군이 더 높은 측정값을 보여 발효를 통해 생성되며 인체에 유익한 작용을 할 수 있는 물질들은 접종군에서 더 많이 생성되었다고 생각해볼 수 있다. 이에 천연발효에서 추출한 상기 유산균들이 발효삼정환 제조에 사용되기 적합한 유산균이라 할 수 있으며 추후 삼정환의 발효 메커니즘 및 발효산물들의 개별연구를 통해 발효삼정환 항산화, 항비만 효과에 대한 규명이 필요할 것으로 생각되며 추후 제품화 및 규격화에도 기여할 것으로 생각된다.
- 96% 측정값에 비해 유의성 있는 증가를 보여 항산화 작용이 더 증가 되었다고 할 수 있다. 하지만 두 군 간의 유의성 있는 차이는 보이지 않아 유산균 접종군의 항산화 활성의 우세성을 알아보기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 세포 생존율에서는 삼정환 처리군이 H2O2 단독군에 비해 증가되는 경향을 보이며 일부 측정값에서 유의성 있는 증가를 보여 세포독성에 대한 보호효과를 가질 것으로 생각된다.
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