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문제 정의
- 본 연구에서는 전통 발효식품으로부터 α-rhamnosidase 효소활성이 우수한 젖산균을 선발하고, 산양삼 추출물의 생물 전환에 적용하여 진세노사이드 Rg1 및 Rg5의 함량을 증가시키고자 하였다.
제안 방법
- α-Rhamnosidase 효소활성을 측정하기 위해 L-rhamnose가 첨가된 5 ml의 MRS 배지에 균주를 세포흡광도(OD600)가 0.1이 되도록 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 뒤, 세포 흡광도 1에 해당하는 배양액을 회수하였다.
- 효소활성은 1분동안 1 μmole의 ρ-nitrophenol을 생성하는 효소의 양으로 정의하였고, bradford dye reagent (Bio-Rad, USA)를 사용하여 조효소액 중의 단백질 농도를 측정하였다. Bovine serum albumin (Bio-Rad)을 사용하여 단백질 농도 측정을 위한 검량선을 작성하였다.
- Bromocresol purple이 첨가된 MRS 배지를 사용하여 전통 발효식품으로부터 200점의 젖산균을 분리하였다. Esculin 평판배지를 사용하여 glycosidase 활성을 보유하는 것으로 추정되는 49점의 젖산균을 선별하였다.
- 프라이머 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 16S rDNA 유전자의 단편을 증폭하였다[30]. PCR 증폭산물은 ㈜마크로젠(Korea)에 의뢰하여 염기서열을 해독하였으며 National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 프로그램을 사용하여 기존에 보고된 균주의 16S rDNA 유전자 염기서열과 상동성을 비교하였다.
- 발효식품으로부터 분리한 젖산균의 α-rhamnosidase 효소 활성을 측정하였다(Table 1, Fig. 2).
- 본 연구를 통해 막걸리로부터 α-rhamnosidase 효소활성이 우수한 L. plantarum MBE/L2990 균주를 분리하였고 산양삼 추출물에 함유된 진세노사이드 Rb1과 Re을 Rg1과 Rg5로 각각 생물전환하였다.
- 분리된 균주를 MRS 배지를 사용하여 30℃에서 24시간 동안 진탕배양한 후 GenExTM genomic Sx (GeneAll, Korea)를 사용하여 염색체 DNA를 추출하였다. 프라이머 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 16S rDNA 유전자의 단편을 증폭하였다[30].
- 분리한 젖산균 중 α-rhamnosidase 활성을 보유하는 젖산균을 선별하기 위해 L-rhamnose가 20 g/l 농도로 첨가된 MRS 평판배지에 도말한 후 30℃에서 24시간 동안 배양하여 단일집락을 형성한 균주를 선발하였다.
- 선별한 젖산균 중, α-rhamnosidase 효소활성을 보유하고 있는 젖산균을 선별하기 위해 L-rhamnose가 20 g/l로 첨가된 배지에서 성장한 12점을 확보하고 MBE/L2925, 2949, 2987, 2988, 2990, 2996, 3011, 3012, 3013, 3015, 3016, 3017 균주로 각각 명명하였다.
- 시료 1 g을 멸균수 9 ml에 현탁한 후 10-1−10-5 배수까지 단계적으로 희석하고[28], bromocresol purple (0.015 g/l, Sigma-Aldrich, USA)을 함유한 MRS (BD Diagnostic, USA) 평판배지에 도말한 후 30℃에서 48시간 동안 배양하여 노란색으로 변하는 단일집락을 확보하였다[29].
- 컬럼은 Eurospher 100-5 C18 (3 × 250 mm, Germany)를 사용하였으며, Rb1, Re 및 Rg1 표준물질은 Chromadex (USA)로부터, Rg5 표준 물질은 엠보연구소(Daejeon, Korea)로부터 구매하여 사용하였다. 이동상은 acetonitrile (J.T.Baker, USA)과 증류수(J.T.Baker)를 혼합하여 순차적으로 acetonitrile의 농도가 증가하도록 농도구배를 설정하였다. 컬럼의 온도는 25℃, 이동상의 유속은 0.
- 강원도 홍천군에서 재배된 5년근 산양삼을 재배농가로부터 구매하여 이물질을 제거한 후 약 1 cm 크기로 절단하였다. 재료 무게의 10배에 해당하는 에탄올(Duksan, Korea)을 추출용매로 첨가하고 항온수조(70℃, Chang shin scientific Co., Korea)에서 12시간 동안 3회 반복 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman paper No.
- 젖산균을 사용하여 산양삼 추출물의 생물전환반응을 진행하기 위하여 α-rhamnosidase 효소활성이 우수한 젖산균을 세포흡광도가 0.1이 되도록 MRS 배지에 접종하여 30℃에서 36시간 동안 배양한 후 배양액을 원심분리(13,000 ×g, 1분)하여 회수한 균체를 멸균수로 2회 세척한 후 사용하였다.
- 진세노사이드 함량은 UV/VIS 검출기(SPD-20A, Shimadzu, Japan)가 장착된 고성능 액체 크로마토그래프(HPLC, 20A-Series, Shimadzu)를 사용하여 측정하였다. 컬럼은 Eurospher 100-5 C18 (3 × 250 mm, Germany)를 사용하였으며, Rb1, Re 및 Rg1 표준물질은 Chromadex (USA)로부터, Rg5 표준 물질은 엠보연구소(Daejeon, Korea)로부터 구매하여 사용하였다.
- 프라이머 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 16S rDNA 유전자의 단편을 증폭하였다[30].
- 효소활성은 장 등[19]의 방법을 수정하여 측정하였다. α-Rhamnosidase 효소활성을 측정하기 위해 L-rhamnose가 첨가된 5 ml의 MRS 배지에 균주를 세포흡광도(OD600)가 0.
- 발효식품으로부터 분리한 젖산균 중 α-rhamnosidase 효소활성을 보유한 젖산균 12점을 선별하였다. 효소활성이 우수한 Weissella confuse 1점, L. pentosus 1점과 효소활성이 우수하였던 4점의 L. plantarum 균주를 사용하여 진세노사이드 Rb1과 Re를 Rg1, Rg5로 각각 생물전환하였다. L.
대상 데이터
- Bromocresol purple이 첨가된 MRS 배지를 사용하여 전통 발효식품으로부터 200점의 젖산균을 분리하였다. Esculin 평판배지를 사용하여 glycosidase 활성을 보유하는 것으로 추정되는 49점의 젖산균을 선별하였다. 선별한 젖산균 중, α-rhamnosidase 효소활성을 보유하고 있는 젖산균을 선별하기 위해 L-rhamnose가 20 g/l로 첨가된 배지에서 성장한 12점을 확보하고 MBE/L2925, 2949, 2987, 2988, 2990, 2996, 3011, 3012, 3013, 3015, 3016, 3017 균주로 각각 명명하였다.
- 두 균주는 α-rhamnosidase 활성이 우수하여 생물전환속도가 가장 빠른 시간에 진행된 것으로 사료되지만, 진세노사이드 Rg5의 증가량이 대조구와 비교하였을 때 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 대조구 균주에 비해 Rg1과 Rg5의 함량을 가장 현저하게 증가시킨 L. plantarum MBE/L2990 균주는 한국미생물자원센터에 KCTC18529P로 기탁하였다.
- 강원도 홍천군에서 재배된 5년근 산양삼을 재배농가로부터 구매하여 이물질을 제거한 후 약 1 cm 크기로 절단하였다. 재료 무게의 10배에 해당하는 에탄올(Duksan, Korea)을 추출용매로 첨가하고 항온수조(70℃, Chang shin scientific Co.
- 5 M Na2CO3 (Duksan, Korea)를 첨가하여 효소반응을 종결하고 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검량선은 4- nitrophenol (pNN, Sigma-Aldrich)을 사용하여 작성하였다. 효소활성은 1분동안 1 μmole의 ρ-nitrophenol을 생성하는 효소의 양으로 정의하였고, bradford dye reagent (Bio-Rad, USA)를 사용하여 조효소액 중의 단백질 농도를 측정하였다.
- 2, Sigma-Aldrich)를 사용하여 여과한 후 회전농축기(Rotavapor R-220SE, BÜCHI Labortechnik AG, Switzerland)를 사용하여 70℃의 항온수조에서 12시간 동안 농축하였다. 농축이 완료된 시료는 동결건조(Ilshinbiobase, Korea)하여 분말형태의 산양삼 추출물을 제조하였다.
- 두 균주는 α-rhamnosidase 활성이 우수하여 생물전환속도가 가장 빠른 시간에 진행된 것으로 사료되지만, 진세노사이드 Rg5의 증가량이 대조구와 비교하였을 때 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 대조구 균주에 비해 Rg1과 Rg5의 함량을 가장 현저하게 증가시킨 L. plantarum MBE/L2990 균주는 한국미생물자원센터에 KCTC18529P로 기탁하였다.
- 발효식품으로부터 분리한 젖산균 중 α-rhamnosidase 효소활성을 보유한 젖산균 12점을 선별하였다.
- 신경세포의 손상을 억제하고, 항암 및 항염증에 효과가 우수한 진세노사이드인 Rg1과 Rg5 [14, 15]의 함량을 증가시키기 위해, α-rhamnosidase 효소활성이 우수한 W. confusa로 동정된 MBE/L2925, L. pentosus로 동정된 MBE/L2996, L. plantarum으로 동정된 MBE/L2990, 3011, 3013, 3016 균주를 사용하였다.
- 젖산균을 분리하기 위하여 전라남도 진도를 비롯하여 전국에서 판매되고 있는 전통발효식품 10점(장아찌 4점, 김치 3점, 막걸리 3점)을 구매하였다. 시료 1 g을 멸균수 9 ml에 현탁한 후 10-1−10-5 배수까지 단계적으로 희석하고[28], bromocresol purple (0.
- 컬럼은 Eurospher 100-5 C18 (3 × 250 mm, Germany)를 사용하였으며, Rb1, Re 및 Rg1 표준물질은 Chromadex (USA)로부터, Rg5 표준 물질은 엠보연구소(Daejeon, Korea)로부터 구매하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 측정은 3회 반복하였으며 평균값과 표준오차는 SPSS (ver. 22.0, SPSS, USA)를 사용하여 결정하였고, 유의성 검증은 일원배치 분산 분석법을 이용하였다[32].
성능/효과
- L. plantarum MBE/ L3011 (0.18 ± 0.01 U/mg), MBE/L3016 (0.16 ± 0.01 U/ mg), MBE/L2990 (0.16 ± 0.02 U/mg) 균주들도 대조구로 사용한 균주에 비해 각각 38% 및 23% 가량 우수한 효소활성 을 나타내어, L. plantarum 균주의 α-rhamnosidase 효소활성이 다른 균주에 비하여 우수한 것으로 판단되었다.
- plantarum 균주를 사용하여 진세노사이드 Rb1과 Re를 Rg1, Rg5로 각각 생물전환하였다. L. plantarum MBE/L2990 균주를 사용한 생물전환반응에서 Rg1과 Rg5의 함량이 각각 0.58 mg, 0.24 mg 가량 증가하였으며, 대조구로 사용한 L. plantarum KCTC21004 균주에 비해 약 56% 및 42% 우수한 생물전환 효율이었다. L.
- Rg1의 함량은 MBE/L2925균주를 사용한 생물전환 반응에 의해 2.46 ± 0.31 mg/g에서 3.12 ± 0.24 mg/g으로 약 0.66 mg이 증가하여 가장 높은 생물전환능을 보였으며, KCTC21004 균주를 사용한 대조구의 경우 Rg1 함량이 2.41 ± 0.18 mg/g에서 2.74 ± 0.09 mg/g으로 약 0.33 mg 증가한 것에 비해 약 2배 가량 높은 증가량을 나타냈다.
- 선별한 젖산균 중, α-rhamnosidase 효소활성을 보유하고 있는 젖산균을 선별하기 위해 L-rhamnose가 20 g/l로 첨가된 배지에서 성장한 12점을 확보하고 MBE/L2925, 2949, 2987, 2988, 2990, 2996, 3011, 3012, 3013, 3015, 3016, 3017 균주로 각각 명명하였다. 각 균주들의 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석한 결과, Weissella confusa (MBE/L2925), Lactobacillus pentosus (MBE/L2996) 및 Lactobacillus plantarum (MBE/L2949, 2987, 2988, 2990, 3011, 3012, 3013, 3015, 3016, 3017)으로 동정되었다(Table 1).
- 동결건조 전 산양삼 추출물의 진세노사이드 함량을 분석한 결과, Rb1의 함량이 가장 높았으며(5.44 ± 0.17 mg/g), Re (5.09 ± 0.14 mg/g), Rg1 (2.43 ± 0.36 mg/g), Rg5 (0.24 ± 0.21 mg/g) 순서로 높은 함량을 나타내었다.
- 두 균주는 α-rhamnosidase 활성이 우수하여 생물전환속도가 가장 빠른 시간에 진행된 것으로 사료되지만, 진세노사이드 Rg5의 증가량이 대조구와 비교하였을 때 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
- 생막걸리로부터 분리된 L. plantarum MBE/L3013 균주가 0.18 ± 0.01 U/mg으로 가장 우수한 α-rhamnosidase 효소활성을 나타내었는데, 이는 대조구로 사용한 L. plantarum KCTC21004 균주에 비해 약 38% 가량 우수한 효소활성이었다.
- 진세노사이드 Rb1 및 Re 농도는 생물전환반응 전에 비해 발효 후 약 1.1−1.2배 가량 감소하였으나, Rg1는 약 1.1−1.3배, Rg5는 약 1.4−2배 가량 농도가 증가하였다(Table 2).
- 진세노사이드 Rg5의 경우 대조구는 0.23 ± 0.05 mg/g에서 0.37 ± 0.02 mg/g으로 0.14 mg 가량 증가하였으나, MBE/L2990 균주를 사용한 생물전환반응에서는 반응 전 0.24 ± 0.05 mg/g에서 반응 후 0.48 ± 0.02 mg/g으로 증가하여, 대조구에 비해 약 42% 가량 높은 증가량을 나타냈다.
후속연구
- 따라서 정제된 형태로 판매되지 않는 α-rhamnosidase 효소활성을 보유한 젖산균을 이용하여 유용 진세노사이드인 Rg1과 Rg5의 함량을 증가시킨 본 연구결과는 Rg1과 Rg5의 대량생산을 위한 기초자료를 제공할 것으 로 사료된다.
- plantarum MBE/L2990 균주를 분리하였고 산양삼 추출물에 함유된 진세노사이드 Rb1과 Re을 Rg1과 Rg5로 각각 생물전환하였다. 향후 반응조건 최적화 연구를 통하여 Rg1과 Rg5의 생산성을 증가시킬 수 있을 것으로 판단된다.
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