선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 NO의 생성이나 iNOS, COX-2, IL-1β 및 TNF-α의 발현 억제와 염증에 의한 활성산소종의 억제는 염증질환을 치료하는데 있어서 중요한 목표가 된다.
- NOS의 증가에 의한 NO의 과도한 생성과 COX-2의 증가는 염증반응의 특징이다. 따라서 지렁이와 갯지렁이 추출물이 LPS에 의해 유도된 COX-2, iNOS와 NO의 발현에 미치는 영향을 알아보았다. LPS에 의한 유도된 iNOS의 결과 LPS 처리구는 대조구(Fig.
제안 방법
- 따라서 본 연구에서는 지렁이와 갯지렁이의 추출물을 이용하여 LPS로 유도한 대식세포에서 항염증 관련 인자 NO, iNOS, IL-1β, TNF-α, COX-2의 억제 효과를 조사하였고, 항산화 관련 인자인 catalase, SOD, glutathione peroxidase(GSH-Px) 및 free malondialdehyde(MDA) 측정을 통한 항산화 효과를 조사하였다.
- 대식세포는 염증을 유발하기 위해 LPS(2 μg/ml)을 FBS가 없는 배양액에 첨가하여 염증을 유도하였으며, 지렁이와 갯지렁이 추출물은 여러 농도를 첨가한 후 실험에 이용하였다.
- 지렁이의 분말은 증류수를 이용하여 4-8회 세척을 통해 이물질을 제거 후 deep freezer에 24시간 보관 후 동결건조기(Ilshin Rab Co., Ltd.)를 사용하여 동결건조 하였으며, 동결 건조된 지렁이를 믹서를 이용하여 분말을 제조하였다. 갯지렁이 분말은 해수에서 4-8회 세척을 통해 이물질을 제거 후 지렁이와 같은 방법으로 분말을 제조하였다.
- )를 사용하여 동결건조 하였으며, 동결 건조된 지렁이를 믹서를 이용하여 분말을 제조하였다. 갯지렁이 분말은 해수에서 4-8회 세척을 통해 이물질을 제거 후 지렁이와 같은 방법으로 분말을 제조하였다. 추출물 제조는 제조된 분말가루 3 g을 70% 에탄올 30 ml에 녹인 후 24시간 실온에 방치한 후 상층액을 회수하여 370×g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액만을 분리하였다.
- GSH-Px 활성도는 50 mM Tris/HCl(pH 7.0)이 함유된 900 μl GSH-Px assay buffer와 1.6 mM GSH, 0.32 mM NADPH를 포함한 50 μl NADPH assay reagent에 0.5 mM EDTA를 cuvette에 첨가하여 4분 동안 5초 간격으로 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 67% (w/v) thiobarbituric acid 을 동일한 양을 첨가하여 반응시킨다. MDA 측정은 ELISA microplate reader로 532 nm에서 흡광도를 측정하여 MDA의 농도를 측정하였다.
- NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System을 이용하여 측정하였다. RAW 264.
- 5% phosphoric acid solution)을 넣어주고 10분간 상온에서 반응 시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NaNO2의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 계산하였다.
- 1% Tween 20을 함유한 TBST 용액으로 40 분간 세척한 다음, 2차항체와 반응시켰다. 이어서 ECL Plus kit(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 반응 시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 확인 하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay 방법을 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
- LPS 처리 후 지렁이와 갯지렁이 추출물의 억제 효과를 알아보기 위해 각각 2.5-10 μg/ml 농도를 처리하여 질산과산화 억제 효과를 측정하였다(Fig. 2).
- 질산과산화가 세포 내 손상 기전을 잘 나타내 주기 때문에 MDA 측정방법을 사용하여 질산과산화 억제 효과를 측정하였다. LPS 처리 후 지렁이와 갯지렁이 추출물의 억제 효과를 알아보기 위해 각각 2.
- 항산화 효소 활성 정도를 측정하기 위해 LPS처리 후 지렁이와 갯지렁이 추출물을 첨가하여 catalase, SOD 및 GSH-Px를 측정하였다(Table I). Catalase 활성은 LPS 처리구(47.
- 따라서 염증억제 정도를 측정하기 위해 LPS처리 후 지렁이와 갯지렁이 추출물을 첨가하여 IL-1β와 TNF-α를 측정하였다.
- 대식세포의 세포배양은 세포 배양액 DMEM에 10% FBS와 antibiotics(100 units/ml penicillin G and 100 μg/ml streptomycin)를 첨가하여 37℃, 5% CO2, 95% 습도 조건하에서 배양하였다.
- 따라서 본 실험에서 지렁이와 갯지렁이의 적정 농도를 2.5, 5 그리고 10 μg/ml로 판단하여 실험을 진행하였다.
대상 데이터
- 염증억제 관련 분석 시 사용되는 IL-1β와 TNF-α의 ELISA 키트는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
- 배양액에 사용하는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 배지와 heat-inactivated Fetal bovine serum(FBS)는 Gibco BRL(Gaithersburg, MD, USA), Antibiotics(penicillin G와 streptomycin) 용액은 Hyclone (Logan, UT) 제품을 구입해 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 지렁이는 어벙이 낚시(대구)에서 판매하는 붉은줄지렁이(Eisenia andrei)를 구입하여 실험에 공시하였고, 갯지렁이는 블루오션피아㈜에서 판매하는 두토막눈썹참갯지렁이(Perinereis linea)를 구매하여 실험에 공시하였다. 일반지렁이는 전북대학교의 홍용박사가, 갯지렁이는 인하대학교의 홍재상교수가 검증한 후 실험에 사용하였고 각각의 표준품은 전북대학교 치의학 전문대학원 치과약리학교실에 보관하였다.
- 본 실험에 사용한 지렁이는 어벙이 낚시(대구)에서 판매하는 붉은줄지렁이(Eisenia andrei)를 구입하여 실험에 공시하였고, 갯지렁이는 블루오션피아㈜에서 판매하는 두토막눈썹참갯지렁이(Perinereis linea)를 구매하여 실험에 공시하였다. 일반지렁이는 전북대학교의 홍용박사가, 갯지렁이는 인하대학교의 홍재상교수가 검증한 후 실험에 사용하였고 각각의 표준품은 전북대학교 치의학 전문대학원 치과약리학교실에 보관하였다.
- 염증억제 관련 분석 시 사용되는 IL-1β와 TNF-α의 ELISA 키트는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. Western 분석 시 사용되는 ECL Plus kit는 Amersham Biosciences(Piscataway, NJ, USA)에서 구입하였다. 다른 모든 시약들은 Sigma(St.
- 쥐의 대식세포 Raw264.7 세포 주는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구매하여 실험에 공시되었다. 대식세포의 세포배양은 세포 배양액 DMEM에 10% FBS와 antibiotics(100 units/ml penicillin G and 100 μg/ml streptomycin)를 첨가하여 37℃, 5% CO2, 95% 습도 조건하에서 배양하였다.
- 전체 세포 추출물은 10% (w/v) trichloroacetic acid을 2배로 섞어 침전시킨다. 표준곡선은 malondialdehyde(MDA)의 재료인 malondialdehyde bisdimethylacetal을 사용하여 준비하였다. 12,000×g에서 10분 동안 원심분리 후 상층액은 1시간 동안 boiling water에서 0.
데이터처리
- 실험에서 얻은 실험군 간의 결과는 student’s t-test로 분석하였으며 대조군과 비교하여 P-value가 0.05 미만일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
- 모든 실험 결과는 3회 이상 실시하였으며 그 평균값을 기초로 Mean±S.D.로 나타내었다.
이론/모형
- 지질과산화(lipid peroxidation)은 Prasad K 등의 방법25)을 사용하여 thiobarbituric acid로 측정하였다. 전체 세포 추출물은 10% (w/v) trichloroacetic acid을 2배로 섞어 침전시킨다.
- 세포 상층액을 수집하여 TNF-α, IL-1β를 ELISA 방법으로 정량 하였다.
- 세포 배양액 내의 TNF-α와 IL-1β의 양을 측정하기 위해 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)를 수행하였다.
- Catalase 활성은 Aebi등의 방법26)을 사용하여 측정하였다. 반응은 최종 양이 1 ml이 되게 전체 세포 단백질 100 μg에 100 mM KH2PO4(pH 7.
- 5 mM EDTA를 cuvette에 첨가하여 4분 동안 5초 간격으로 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. SOD 활성은 SOD assay kit(Oxis Research, Portland, OR USA)를 사용하였다. Boric acid와 diethylenetriaminepenta acetic acid(DTPA)가 들어있는 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol(pH 8.
- 이어서 ECL Plus kit(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 반응 시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 확인 하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay 방법을 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
- 지렁이와 갯지렁이 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해 MTT 분석 방법을 사용하여 생존율을 측정하였다. 각 처리 농도 2.
성능/효과
- 대식세포가 활성화되면, 많은 염증성 인자들을 생산하는데, 그 인자들에는 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β), leukotrienes, nitric oxide(NO) 등이 있다.1,2) 과도한 염증인자의 생산은 류마티스성 관절염, 천식, 호흡기 질환, 폐혈증 등의 질환을 유발하는 중요한 지표가 된다. 대식세포는 대표적인 염증 매개물인 NO 생성에 관여하며 급성 및 만성염증 반응에서 L-arginine으로부터 생성된다.
- 대식세포는 대표적인 염증 매개물인 NO 생성에 관여하며 급성 및 만성염증 반응에서 L-arginine으로부터 생성된다.3) NO는 신경전달, 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는데, 특히 대식세포에서 lipopolysaccharide(LPS)로 자극하면 iNOS(inducible nitric oxide synthase)가 발현되어 NO를 생성하게 된다.4,5) 그러므로 NO의 과량 생성은 염증반응을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
- 또한 LPS에 의한 대식세포의 활성 시 IL-1β 및 TNF-α와 같은 염증인자 등을 생산하게 된다.6,7) 생체의 산화반응 과정 중에 생성되는 활성산소들은 체내의 항산화효소(Superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase)에 의해 제거되나,8) 이를 초과한 과량의 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)으로 인한 산화적 스트레스가 항산화물질에 의해 감소된다. 최근 염증에 의한 질병에 활성산소종이 관련되어 있다고 보고 되었으며,9) Miesel10) 등은 매우 독성이 강한 산화제인 superoxide를 포함하는 활성산소종은 염증기간 동안에 조직 손상을 직접 초래할 수 있다고 보고하였다.
- 각 처리 농도 2.5, 5 그리고 10 μg/ml에서 대조군과 비교하여 세포 내 독성은 없는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 또한 GSH-Px 활성은 대조구(32.82±0.76 mU/mg)와 LPS 처리구간(33.94±0.30 mU/mg)에 유의적인 차이가 없었으나, 지렁이 추출물은 2.5, 5 그리고 10 μg/ml(37.78±0.30, 39.79±0.35, 41.49±0.24 mU/mg) 농도에서 LPS 처리구와 비교해 유의적으로 높은 활성도를 나타내었다(P<0.05).
- SOD 활성은 LPS 처리구(7.76±0.31 units/mg)가 대조구(6.01±0.28 units/mg)에 비해 유의적으로 증가하였지만(P<0.05), 지렁이 추출물에서 LPS 처리구와 비교해 5 와 10 μg/ml(9.51±0.07, 9.64±0.20 units/mg) 농도에서 각각 유의적으로 더 높은 활성도를 나타내었고(P<0.05), 갯지렁이 추출물 또한 LPS 처리구와 비교해 2.5, 5와 10 μg/ml(9.96±0.23, 11.05±0.23, 13.19±0.99 units/mg)농도에서 각각 유의적으로 더 높은 활성도를 나타내었다(P<0.05).
- 특히 지렁이와 갯지렁이 10 μg/ml 농도에서 각각 높은 억제 효과를 나타내었다.
- LPS 처리군(130.7±0.86)과 비교해 지렁이(12.9±0.86에서 11.3±0.86)와 갯지렁이(124.9±1.17에서 117.2±0.65)에서 농도 의존적으로 유의적 감소를 나타내었다(P<0.05).
- LPS에 의한 유도된 iNOS의 결과 LPS 처리구는 대조구(Fig. 3A, 3B)에 비해 8배 증가하였지만 지렁이와 갯지렁이 추출물 처리구는 각각 4배 및 8배가 유의적으로 감소되었다(P<0.05).
- NO 생산 결과(Fig. 4)에서 LPS 처리구와 비교해 지렁이와 갯지렁이 각 10 μg/ml 농도에서 유의적으로 감소하였지만(P<0.05), 갯지렁이 추출물(426.1±1.91)과 비교해 지렁이 추출물(384.1±5.73)이 NO 생산을 유의적으로 더 많은 감소를 나타내었다(P<0.05).
- 또한 갯지렁이는 지렁이 추출물과 비교해 유의적으로 3배 더 감소되는 효과를 나타내었다(P<0.05).
- 따라서 이 결과는 MDA 억제 효과는 산화물질의 억제효과를 나타내며 반대로 항산화 물질인 catalase, SOD, GSH-Px의 증가는 지렁이와 갯지렁이 추출물의 항산화 활성을 나타낸다는 것을 반증한다. 특히 MDA 억제 효능에서 지렁이가 갯지렁이 추출물과 비교해 높은 효율을 나타내었지만 SOD 활성에서는 반대로 갯지렁이 추출물이 더 높은 효율을 나타냈다. 그러므로 LPS에 의한 산화 스트레스에 대한 갯지렁이 추출물이 지렁이 추출물과 동일한 효능을 가지고 있다고 판단되며 강력한 항산화제로 사용이 가능할 것으로 사료된다.
- Balamurugan M 등17)의 보고에서 지렁이 추출물이 항염증제제인 Indomethacin과 비슷한 효과를 나타낸다고 보고하였지만 어떤 경로를 통해서 염증을 억제하는지 보고되지 않았다. 본 실험결과 지렁이는 iNOS와 NO에서만 억제 효과가 나타났고 COX-2의 경우 LPS 처리구에 비해 오히려 더 증가되었다. COX-2의 염증대사 경로는 COX-2의 증가에 따라 prostaglandin E2의 합성이 유도되며 최종적으로 염증반응이 일어나게 되기 때문에30) 지렁이 추출물은 proinflammatory cytokine의 특징도 나타낸다고 사료된다.
- 따라서 지렁이는 iNOS와 NO의 억제를 통해서 염증반응을 억제 한다고 판단된다. 그러나 갯지렁이 추출물은 iNOS와 COX-2 둘 다 유의미하게 억제하여 NO와 COX-2를 통한 염증반응을 각각 저해하는 결과를 보였다. 이 결과는 갯지렁이 추출물의 항염증 효능을 처음으로 나타낸 결과이며 지렁이와 비교해 더 높은 항염증 효능을 나타내어 갯지렁이의 항염증 제제로의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
- 따라서 지렁이 추출물의 염증억제는 단지 TNF-α 억제를 통해만 염증억제를 하였으나, 갯지렁이 추출물은 IL-1β와 TNF-α 둘 다 억제하여 지렁이와 비교해 더 높은 염증억제 효능이 있다고 판단된다.
- 또한 갯지렁이 추출물도 2.5, 5, 10 μg/ml (51.81±0.35, 52.71±0.55, 45.26±0.5) 농도에서 유의적으로 높은 억제효과를 나타내었다(P<0.05).
- TNF-α의 결과(Fig. 5B)에서 LPS 처리구(60.46±0.3)와 비교해 지렁이 추출물은 10μg/ml(51.81±0.4)에서 유의적으로 높은 억제효과를 나타내었다(P<0.05).
- IL-1β의 결과(Fig. 5A)에서 갯지렁이 추출물은 LPS 처리구(125.4±5.0)에 비해 5, 10 μg/ ml(97.11±3.3, 84.89±7.8) 농도에서 유의적으로 높은 억제 효과를 나타내었지만(P<0.05), 지렁이 추출물은 LPS 처리구와 비교해 오히려 더 증가하였다.
- 이상의 연구결과를 통하여 지렁이 추출물은 지질과산화 억제를 통해 항산화 물질인 Catalase, SOD, 및 GSH-px를 증가시켜 항산화제로서 가능성을 나타내었고, iNOS의 억제를 통한 NO 생산을 감소시키고 항염증 대사 물질인 TNF-α의 억제를 통한 항염증 제제로서의 가능성을 나타내었지만 IL-1β와 COX-2를 억제하지 못하였다. 갯지렁이 추출물도 지질과산화 억제와 항산화 관련 효소를 증가시켰는데 지렁이와는 달리 갯지렁이 추출물은 iNOS, NO 뿐 아니라 COX-2, 및 IL-1β도 억제하여 지렁이 추출물에 비해 더 높은 항염증 효능을 나타내었다. 이 결과는 갯지렁이 추출물이 높은 염증억제 효능과 항산화 효과를 나타내어 염증과 관련된 질환 치료에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.
- 이상의 연구결과를 통하여 지렁이 추출물은 지질과산화 억제를 통해 항산화 물질인 Catalase, SOD, 및 GSH-px를 증가시켜 항산화제로서 가능성을 나타내었고, iNOS의 억제를 통한 NO 생산을 감소시키고 항염증 대사 물질인 TNF-α의 억제를 통한 항염증 제제로서의 가능성을 나타내었지만 IL-1β와 COX-2를 억제하지 못하였다.
- 27 mU/mg) 농도에서 LPS 처리구와 비교해 높은 활성도를 나타내었다. 따라서 이 결과는 MDA 억제 효과는 산화물질의 억제효과를 나타내며 반대로 항산화 물질인 catalase, SOD, GSH-Px의 증가는 지렁이와 갯지렁이 추출물의 항산화 활성을 나타낸다는 것을 반증한다. 특히 MDA 억제 효능에서 지렁이가 갯지렁이 추출물과 비교해 높은 효율을 나타내었지만 SOD 활성에서는 반대로 갯지렁이 추출물이 더 높은 효율을 나타냈다.
후속연구
- 또한 지렁이 조직에 폴리페놀산(polyphenolic)이 높게 존재하여 항염증, 항산화 효과를 보고하였다.17) 그러나 지렁이에 대한 항염증, 항산화 관련 실험에 대한 검증은 많지 않으며 체외 실험을 통한 염증억제 및 항산화 효과에 대한 추가 검증이 필요할 것으로 판단한다. 갯지렁이(Perinereis linea)는 해양 갯지렁이(marine clamworm)의 한 종류로 동양의학에서 수백 년 전부터 한방의약에 사용되어 왔다.
- 특히 MDA 억제 효능에서 지렁이가 갯지렁이 추출물과 비교해 높은 효율을 나타내었지만 SOD 활성에서는 반대로 갯지렁이 추출물이 더 높은 효율을 나타냈다. 그러므로 LPS에 의한 산화 스트레스에 대한 갯지렁이 추출물이 지렁이 추출물과 동일한 효능을 가지고 있다고 판단되며 강력한 항산화제로 사용이 가능할 것으로 사료된다.
- 그러나 갯지렁이 추출물은 iNOS와 COX-2 둘 다 유의미하게 억제하여 NO와 COX-2를 통한 염증반응을 각각 저해하는 결과를 보였다. 이 결과는 갯지렁이 추출물의 항염증 효능을 처음으로 나타낸 결과이며 지렁이와 비교해 더 높은 항염증 효능을 나타내어 갯지렁이의 항염증 제제로의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
- 갯지렁이 추출물도 지질과산화 억제와 항산화 관련 효소를 증가시켰는데 지렁이와는 달리 갯지렁이 추출물은 iNOS, NO 뿐 아니라 COX-2, 및 IL-1β도 억제하여 지렁이 추출물에 비해 더 높은 항염증 효능을 나타내었다. 이 결과는 갯지렁이 추출물이 높은 염증억제 효능과 항산화 효과를 나타내어 염증과 관련된 질환 치료에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.