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문제 정의
- 따라서 본 연구는 국내에 자생하는 수집된 번행초 유전자원들의 유전적 특성을 비교하고, 향후 유용한 내염성 유전자와 형질연관 분자마커가 개발될 경우 새로운 품종의 개발을 위한 분자육종의 기초를 마련하는 데 그 목적이 있다고 하겠다. 기후변화에 따른 새로운 대체작물의 개발과 염류지역에 적용이 가능한 염생식물의 활용이라는 측면에서 국내 자생 염생식물 중 일부지역의 민간에서 엽채류로 오랫동안 활용이 되어왔던 번행초의 재배 작물로서의 가능성은 크다고 볼 수 있다.
- 본 연구는 국내 동, 서 및 남해안 바닷가 근처 사구지역에서 자생하는 번행초 55개체를 수집하여 AFLP 마커시스템을 적용하고 이들 유전자원들간의 유전다양성 차이를 알아보기 위하여 실시하였다. 우선 전체 게놈의 특이적 부위를 절단하기 위하여 제한효소로 EcoRI과 MseI 12개 조합을 활용하였고, 그 결과 총 1,279 절편을 확보할 수 있었다.
제안 방법
- 1, 2차 preamplification 및 selective amplification 과정을 거쳐 얻어진 PCR 결과물은 절편의 유무에 따라 각각 1 또는 0으로 데이터 코드를 구성하여 데이터 매트릭스를 작성하였다. 간단히 매칭된 계수를 기반으로 유전적 유사성을 추정하였고, 군집 분석은 NTSYSpc 프로그램(version 2.
- 1차 증폭은 72°C에서 2분 동안 열처리한 후 94°C에서 30초간 열변성, 65°C에 60초간 프라이머 결합, 그리고 72°C에서 60초간 DNA 합성을 반복하여 총 30회 증폭과정을 수행하였다.
- 2차 선택적 증폭은 EcoRI에 형광 표지된 3개(각각 FAM, HEX, NED로 표지; Applied Biosystems, CA, USA)를 이용하여 총 12개 조합을 가지고 수행하였다(Table 2와 3). 선택적 증폭을 위한 PCR은 2 μl pre-amplified DNA, 1 μM EcoRI primer, 2.
- DNA 추출은 기존에 알려진 CTAB 방법을 변형하여 수행하였고(Keim et al. 1988), 추출된 DNA는 분광광도계(Jenway 6505, Essex, U.K.)를 이용하여 균일한 농도(50 ng/µl)로 정량한 후 digestion, ligation, preamplification 및 selective amplification 등 AFLP 분석과정을 AFLP 분석시스템 I (Invitrogen, Carlsbad, California)을 따라 수행하였다.
- PCR 산물의 증폭 결과물을 확인하기 위해 1.5% agarose gel에 5 μl의 PCR 증폭 DNA를 사용하였고, 나머지는 TE 완충용액으로 1/10배 희석하여 보관하여 2차 증폭을 위한 주형(template)으로 이용하였다.
- 2007). Polymorphic information content (PIC) value와 유전 다양성(genetic diversity)을 이용하여 번행초 유전자원간의 유전적 변이 정도를 결정하였고(Nei 1978), 이를 위하여 Powermarker (version 3.25) 프로그램을 이용하였다(Muse et al. 2005).
- Polymorphism information content (PIC) 값과 유전 다양성(genetic diversity)을 추가로 계산하여 본 연구에 이용한 55개체 번행초 유전자원간의 유전적 변이를 결정하였다(Muse et al. 2005). 그 결과 본 연구에 이용된 국내 자생 번행초 수집자원들의 유전다양성 값은 0.
- 선택 프라이머를 이용한 2차 PCR은 touch-down PCR 방법(매회 0.7°C씩 온도 강하)을 이용하여 94°C에서 30초, 65°C에서 30초, 그리고 72°C에서 2분 동안 DNA 합성 단계를 반복하여 총 12회 실시한 후, annealing 온도를 56°C에 맞추어 추가로 30회 더 반복 진행하였다.
- 선택적 증폭을 위한 PCR은 2 μl pre-amplified DNA, 1 μM EcoRI primer, 2.5 μM MseI primer, 10X buffer, 8 mM dNTP, 그리고 0.65 Unit Taq polymerase를 포함하여 전체 부피를 10 μl로 맞추어 수행하였다.
- 2011). 수집한 종자를 온실 내 원예상토로 채워진 파종상자에 파종하여 발아된 어린 유식물체의 잎으로부터 DNA를 추출하여 AFLP 분석에 활용하였다.
- 실험에 이용된 제한효소는 EcoRI과 MseI이었고, 최종 selective primer의 5’ 말단에 Table 2에서처럼 VIC, NED, 그리고 PET 형광표지를 부착하여 자동화 염기서열 분석 시 여러 개의 조합을 동시에 분석할 수 있도록 하였다.
- 제한효소 EcoRI과 MseI을 이용하여 절단한 번행초 게놈 DNA 절편은 EcoRI 및 MseI adapter와 37°C에 2시간 반응시켜 각각의 제한효소에 의해 절단되는 단편의 말단에 결합시켰다.
- 7°C씩 온도 강하)을 이용하여 94°C에서 30초, 65°C에서 30초, 그리고 72°C에서 2분 동안 DNA 합성 단계를 반복하여 총 12회 실시한 후, annealing 온도를 56°C에 맞추어 추가로 30회 더 반복 진행하였다. 최종 PCR 산물은 ABI 3130xl genetic analyzer (Applied Biosystems, CA, USA)를 이용하여 절편의 유무와 크기를 결정하여 번행초 유전자원간의 유전자형 분석에 이용하였다.
대상 데이터
- 본 연구의 식물 재료인 번행초 유전자원은 2010-2011년에 걸쳐 우리나라 동, 서 및 남해안 일대와 제주도의 해안가 및 사구 지역 등 Table 1에 보여주는 것처럼 총 12곳에서 총 55점을 유식물체 또는 종자상태로 수집한 것을 이용하였다(Kim et al. 2011). 수집한 종자를 온실 내 원예상토로 채워진 파종상자에 파종하여 발아된 어린 유식물체의 잎으로부터 DNA를 추출하여 AFLP 분석에 활용하였다.
데이터처리
- AFLP 절편에서 다형성을 보이는 마커(총 743개)를 이용하여(Table 3) 수집 번행초 55개체간 공유 대립유전자 빈도를 기초로 하고 Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA)을 적용하여(shared allele-based UPGMA cluster analysis) 군집분석을 실시하였다(Fig. 2). 그 결과 수집 자생 번행초는 7개의 유전적 다양성 집단으로 나눌 수 있음을 알 수 있었다.
- 1, 2차 preamplification 및 selective amplification 과정을 거쳐 얻어진 PCR 결과물은 절편의 유무에 따라 각각 1 또는 0으로 데이터 코드를 구성하여 데이터 매트릭스를 작성하였다. 간단히 매칭된 계수를 기반으로 유전적 유사성을 추정하였고, 군집 분석은 NTSYSpc 프로그램(version 2.0; Rohlf 1998)을 이용하여 unweighted pair-group method arithmetic average (UPGMA) 방법으로 실시하였고 MEGA 4 프로그램을 이용하여 genetic tree를 도형으로 나타냈다(Kumar et al. 2007). Polymorphic information content (PIC) value와 유전 다양성(genetic diversity)을 이용하여 번행초 유전자원간의 유전적 변이 정도를 결정하였고(Nei 1978), 이를 위하여 Powermarker (version 3.
이론/모형
- 유전다양성 평가는 유전정보가 잘 알려지지 않은 식물에 많이 적용된 AFLP 마커를 활용하여 수행하였다. 번행초 게놈의 특정부위를 절단하는 EcoRI (5’-G▼AATTC-3’)과 MseI (5’-T▼TAA-3’) 제한효소 12개 조합을 이용하여 절단한 뒤 이러한 염기서열 특징을 보이는 절편을 선별적으로 골라낼 수 있는 Probe를 이용하여 총 1,279개의 절편을 확보할 수 있었고, 이는 게놈절편을 얻는데 활용한 제한효소 조합당 평균 107개의 절편 수에 해당한다(Table 3).
성능/효과
- 2011). 군집분석 결과와 비교해 볼 때 수집지역이 유사한 경우 유전 다양성 정도도 상대적으로 낮은 것으로 보이는데, 군집 4의 경우 경남북, 울주, 기장 및 부산지역 수집종들이고, 군집 6은 주로 제주지역 수집종, 그리고 군집 7은 전남 신안 또는 해남 등에서 수집한 종들이 그룹을 이루고 있다. 수집지가 다른 유전자원들간의 군집형성은 번행초가 해안가에서 서식하기 때문에 바닷물 조류를 따라 다른 지역으로 흘러들어가 유전다양성에 기여하는 것으로 유추해 볼 수 있다.
- 2005). 그 결과 본 연구에 이용된 국내 자생 번행초 수집자원들의 유전다양성 값은 0.29를 보이는 것을 알 수 있었다. 그리고 제한효소에 의하여 생성된 절편들 중에서 약 79%가 게놈 전체에 다수로 존재하는 주요 단편(major alleles)들이었고, PIC값은 0.
- 2). 그 결과 수집 자생 번행초는 7개의 유전적 다양성 집단으로 나눌 수 있음을 알 수 있었다. 그 중 군집 1, 2, 3에서 보여주는 것처럼 여수, 완도, 남해, 신안지역에서 수집한 번행초가 다른 지역 수집종에 비해 유전적으로 매우 큰 차이가 있다는 것을 알 수 있었다(Kim et al.
- 29를 보이는 것을 알 수 있었다. 그리고 제한효소에 의하여 생성된 절편들 중에서 약 79%가 게놈 전체에 다수로 존재하는 주요 단편(major alleles)들이었고, PIC값은 0.25로 자식성 작물인 Brachypodium에서 보였던 0.113보다 높았고, 유전다양성 값 0.29는 타식성 작물인 bermudagrass에서 보였던 0.36값의 유전 다양성에 비하여 낮게 나타났다(Kang et al. 2008; Zhang et al. 2012).
- 이와 같이 유전자원간에 다형성을 보인 게놈 절편을 대상으로 유전다양성을 분석한 결과 조사된 55개체 번행초 유전자원 집단은 29%의 유전적 차이를 보이는 것을 알 수 있었다. 또한 군집분석을 통해 유전적 차이를 보이는 그룹을 분류한 결과 국내 자생 번행초 유전자원은 총 7개의 집단으로 나누어짐을 알 수 있었다. 본 연구에서 국내외 최초의 번행초 유전 다양성 평가 정보는 향 후 품종 육성을 위한 교배친의 선발에 적용하여 다양한 유전적 차이를 보이는 분리집단을 확보하는 데 활용이 가능할 것으로 생각된다.
- 번행초 게놈의 특정부위를 절단하는 EcoRI (5’-G▼AATTC-3’)과 MseI (5’-T▼TAA-3’) 제한효소 12개 조합을 이용하여 절단한 뒤 이러한 염기서열 특징을 보이는 절편을 선별적으로 골라낼 수 있는 Probe를 이용하여 총 1,279개의 절편을 확보할 수 있었고, 이는 게놈절편을 얻는데 활용한 제한효소 조합당 평균 107개의 절편 수에 해당한다(Table 3).
- 본 연구실에서 간척지 후보 신규 자생식물로 연구를 해 오고 있는 번행초에 대한 농업적 측면의 재배 연구결과, 자생지는 비록 해안가 사구 또는 모래토양에서 자라고 있는 염생식물이지만(Myeong et al. 2011), 종자를 파종한 이후 약 2개월 동안 염농도 1.0%의 바닷물로 지속해서 관수를 하는 토양지역에서도 생육이 가능하다는 것을 알 수 있었다(Kim et al. 2011). 따라서 새만금과 같은 초기 간척지의 제염 및 소득 밭작물로 활용이 가능한 자생 식물이 될 수 있고, 기후변화에 따른 신규 엽채류의 개발을 목적으로 할 경우 시금치와 같은 저온성 채소를 대체할 수 있는 후보 작물로 가능할 것으로 보여진다(Kim et al.
- 본 연구는 국내 동, 서 및 남해안 바닷가 근처 사구지역에서 자생하는 번행초 55개체를 수집하여 AFLP 마커시스템을 적용하고 이들 유전자원들간의 유전다양성 차이를 알아보기 위하여 실시하였다. 우선 전체 게놈의 특이적 부위를 절단하기 위하여 제한효소로 EcoRI과 MseI 12개 조합을 활용하였고, 그 결과 총 1,279 절편을 확보할 수 있었다. 이 결과는 제한효소 조합당 평균 107개의 절편이 생산된 것으로 이 중 평균 62개(약 58%)가 유전자원간에 다형성을 나타냈다.
- 우선 전체 게놈의 특이적 부위를 절단하기 위하여 제한효소로 EcoRI과 MseI 12개 조합을 활용하였고, 그 결과 총 1,279 절편을 확보할 수 있었다. 이 결과는 제한효소 조합당 평균 107개의 절편이 생산된 것으로 이 중 평균 62개(약 58%)가 유전자원간에 다형성을 나타냈다. 이와 같이 유전자원간에 다형성을 보인 게놈 절편을 대상으로 유전다양성을 분석한 결과 조사된 55개체 번행초 유전자원 집단은 29%의 유전적 차이를 보이는 것을 알 수 있었다.
- 이 중 55개 번행초 유전자원들간에 차이를 나타내는 다형성 마커는 총 743개로 EcoRI과 MseI 제한효소 조합당 62개로 유전 다형성율은 58%로 나타났다(Table 3과 Fig. 1). 본 연구실에서 Brachypodium 속 식물을 대상으로 한 실험에서 자연수집 집단(66개체)의 경우에는 다형성율이 59%였고, 같은 속 식물을 감마선 처리를 통해 얻어진 인공변이 집단(43개체)을 통해 얻어진 다형성율은 79%였다(Zhang et al.
- 이러한 연구를 토대로 볼 때 타식성 작물이 Brachypodium과 같이 자식성 작물보다 유전적 차이가 크고, 같은 집단의 경우 감마선 처리에서와 같이 인공적으로 돌연변이를 유도한 집단의 경우가 자연 수집 집단보다 높은 유전적 차이를 보인다는 사실을 알 수 있다. AFLP 분석을 통해서 얻어진 유전적 다형성율을 기초로 판단해 볼 때 자식성 식물인 Brachypodium과 유사한 결과(Brachypodium 59%와 번행초 58%)가 보여주는 사실은 번행초가 자식성 작물임을 간접적으로 보여준다고 할 수 있겠다(Grubben and Denton 2004).
- 이 결과는 제한효소 조합당 평균 107개의 절편이 생산된 것으로 이 중 평균 62개(약 58%)가 유전자원간에 다형성을 나타냈다. 이와 같이 유전자원간에 다형성을 보인 게놈 절편을 대상으로 유전다양성을 분석한 결과 조사된 55개체 번행초 유전자원 집단은 29%의 유전적 차이를 보이는 것을 알 수 있었다. 또한 군집분석을 통해 유전적 차이를 보이는 그룹을 분류한 결과 국내 자생 번행초 유전자원은 총 7개의 집단으로 나누어짐을 알 수 있었다.
후속연구
- 기후변화에 따른 새로운 대체작물의 개발과 염류지역에 적용이 가능한 염생식물의 활용이라는 측면에서 국내 자생 염생식물 중 일부지역의 민간에서 엽채류로 오랫동안 활용이 되어왔던 번행초의 재배 작물로서의 가능성은 크다고 볼 수 있다. 따라서 기존의 식물학적 및 농업재배적 측면의 다양한 특성 결과와 수집 유전자원 간의 유전적 변이 결과를 종합한다면 간척지 또는 장기간의 시설재배로 인한 토양 염류가 문제가 되는 국내외 여러 지역에서 저온성 엽채류를 대체하기 위한 신규 자생식물의 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 연구결과는 기존 발표된 국내 수집 자생 번행초의 형태적 및 농업적 특성자료와 함께 유전적 특성분석을 제공함으로써 번행초 품종 육성을 위한 선발 또는 교배 육종의 재료 측면에서 활용가치가 높을 것으로 여겨진다. 특히 번행초의 경우 국내 간척지는 물론이고, 급증하는 시설재배 지역에서 문제가 되고 있는 염류집적 토양에 적용이 가능한 새로운 엽채류로서 국내외 번행초 유전자원에 대한 농업적 및 유전적 평가자료가 부족한 상황에서 본 연구 결과는 여름철 시금치 등 엽채류를 대체할 수 있는 채소 작물 개발에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.
- 또한 군집분석을 통해 유전적 차이를 보이는 그룹을 분류한 결과 국내 자생 번행초 유전자원은 총 7개의 집단으로 나누어짐을 알 수 있었다. 본 연구에서 국내외 최초의 번행초 유전 다양성 평가 정보는 향 후 품종 육성을 위한 교배친의 선발에 적용하여 다양한 유전적 차이를 보이는 분리집단을 확보하는 데 활용이 가능할 것으로 생각된다.
- 2012). 이러한 결과는 포장 선발 시 토양 내 염류의 집적 정도에 따라 영양생장 또는 생식생장으로의 발달이 달라질 수가 있어서 엽채류 번행초 작물의 개발을 위해서는 토양 환경에 영향을 받지 않고 생육 정도를 추정할 수 있는 관련 유전정보가 필요하다는 사실을 시사한다고 하겠다. 하지만 이들 유전자원간의 유전적 차이에 대한 정보는 아직 발표된 것이 없고, 그런 의미에서 본 연구는 국내 자생 번행초 수집 자원간의 유전적 차이를 보여주는 전 세계 최초의 결과라는 점에서 향 후 활용가치가 높다고 할 수 있겠다.
- 계통도에 나타난 군집특성과 비교해 볼 때 군집이 다른 번행초 유전자원의 높은 수량성은 서식지 환경에 더 많은 영향을 받는 것으로 보여진다. 이와 같이 농업적으로 우수한 개체들은 본 연구에서 유전적 변이가 높은 자원들과 교배를 통해 형질면에서 훨씬 다양한 개체를 확보할 수 있을 것으로 기대할 수 있겠다.
- 본 연구결과는 기존 발표된 국내 수집 자생 번행초의 형태적 및 농업적 특성자료와 함께 유전적 특성분석을 제공함으로써 번행초 품종 육성을 위한 선발 또는 교배 육종의 재료 측면에서 활용가치가 높을 것으로 여겨진다. 특히 번행초의 경우 국내 간척지는 물론이고, 급증하는 시설재배 지역에서 문제가 되고 있는 염류집적 토양에 적용이 가능한 새로운 엽채류로서 국내외 번행초 유전자원에 대한 농업적 및 유전적 평가자료가 부족한 상황에서 본 연구 결과는 여름철 시금치 등 엽채류를 대체할 수 있는 채소 작물 개발에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.
- 이러한 결과는 포장 선발 시 토양 내 염류의 집적 정도에 따라 영양생장 또는 생식생장으로의 발달이 달라질 수가 있어서 엽채류 번행초 작물의 개발을 위해서는 토양 환경에 영향을 받지 않고 생육 정도를 추정할 수 있는 관련 유전정보가 필요하다는 사실을 시사한다고 하겠다. 하지만 이들 유전자원간의 유전적 차이에 대한 정보는 아직 발표된 것이 없고, 그런 의미에서 본 연구는 국내 자생 번행초 수집 자원간의 유전적 차이를 보여주는 전 세계 최초의 결과라는 점에서 향 후 활용가치가 높다고 할 수 있겠다.
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