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문제 정의
- 벌 사상자의 유용성분으로는 osthole과 xanthotoxol에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으며, 약리작용으로는 면역기능개선과 천식억제, 피부과민반응 억제 및 leukemia 세포에 대한 세포독성이 보고되었지만 암과 관련된 연구는 많이 이루어지지 않았다[6]. 이에 따라 본 연구에서는 벌 사상자 에탄올 추출물이 HCT116 대장암 세포에서 apoptosis와 관련된 단백질에 미치는 영향과 apoptosis 유도 효과를 확인하고자 하였으며, Akt/mTOR/GSK3β 신호 경로를 확인하여 벌 사상자에 의한 apoptosis 효과가 어떠한 신호경로를 통하여 이루어지는지를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- HCT116 세포를 60 mm dish에 1×105 cells/ml의 농도로 분주하여 24시간 배양 후, CME를 24시간 동안 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 처리하였다
- HCT116대장암세포에 BIO (GSK-3β 저해제)와 LY294002 (PI3K/Akt 저해제), Rapamycin (mTOR 저해제)을 각각 단독으로 처리한 후, MTT assay, LDH release assay, Annexin V-PI staining을 통하여 저해제가 HCT116대장암세포의 증식과 apoptosis 유도에 미치는 영향을 CME와 비교하고자 하였다. 선행연구에 의하면 LY294002와 Rapamycin이 HCT116대장암세포의 증식억제에 효과가 있다고 보고되었다[21].
- 선행연구에 의하면, 천연추출물이 HCT116대장암세포와 Hep3B와 같은 많은 암 종에서 세포증식을 억제한다고 보고되었다[7, 10, 20]. 따라서 본 연구에서는 CME가 HCT116대장암세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 CME를 농도별(20~100 μg/ml)로 처리한 뒤, MTT assay와 LDH assay를 실시하여 HCT116 대장암세포의 세포생존율과 세포독성을 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 또한 많은 암 종에서 apoptosis가 일어난 세포만을 염색하는 annexin V에 positive한 세포의 수가 천연추출물 처리에 의하여 증가하는 것으로 보고되었다[23, 24, 27]. 따라서 본 연구에서는 CME처리에 의한 HCT116 대장암세포의 증식억제 유도효과가 Apoptosis에 의한 것인지 알아보기 위하여 Annexin V-PI staining와 Hoechst 33342 staining을 실시하였다. 먼저, HCT116 세포에 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, apoptosis시 membrane 밖으로 표출되는 phosphatidylserine을 Annexin V-PI double staining을 통하여 측정하였다.
- 또한, HCT116대장암세포에 호박잎 추출물을 처리하였을 때도 마찬가지로 cell morphological change가 일어난다고 보고되었다[18]. 따라서 본 연구에서는 CME처리에 의한 HCT116대장암세포의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 CME를 HCT116대장암세포에 농도별(20~100 μg/ml)로 24시간 동안 처리한 뒤 도립 현미경을 이용하여 형태학적 변화를 관찰하였다. 그 결과 Fig.
- 따라서 본 연구에서는 CME처리에 의한 HCT116 대장암세포의 증식억제 유도효과가 Apoptosis에 의한 것인지 알아보기 위하여 Annexin V-PI staining와 Hoechst 33342 staining을 실시하였다. 먼저, HCT116 세포에 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, apoptosis시 membrane 밖으로 표출되는 phosphatidylserine을 Annexin V-PI double staining을 통하여 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 세포의 성장과 증식은 세포주기(cell cycle)와 밀접한 연관이 있으며, 세포주기가 정지된 후 다시 복구되지 못하면 apoptosis로 이어진다[10, 17]. 본 연구에서는 CME처리에 의한 HCT116대장암세포의 증식억제 효과와 세포주기의 연관성을 알아보기 위하여 HCT116대장암세포에 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 24시간 동안 처리한 후 유세포분석기를 통하여 세포주기를 측정하였다. 그 결과 Fig.
대상 데이터
- , Logan, UT, USA)를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다. Fibroblast 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% FBS와 1% antibiotics가 포함된 DMEM media (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA)를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다. 매 48시간마다 Trypsin-EDTA (Hyclcone, Laboratories Inc.
- HCT116 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Laboratoris Inc., Logan, UT, USA)와 1% antibiotics가 포함된 RPMI 1640 media (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA)를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다. Fibroblast 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% FBS와 1% antibiotics가 포함된 DMEM media (Hyclone, Laboratris Inc.
- 본 실험에서 사용된 벌 사상자는 동경종합상사(주)에서 구입하였고, 벌 사상자 100g에 99.9% 에탄올 800 ml을 가하여 72시간 동안 상온에서 환류추출하였다. 이러한 방법으로 추출된 벌 사상자 추출물(CME)을 6 μm filter paper (qualitative filter paper NO.
데이터처리
- , Tokyo, Japan)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 3번 이상 하였으며, 이에 따른 평균값과 표준오차는 Microsoft Excel program을 사용하여 분석하였다.
- , Tokyo, Japan)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 3번 이상 하였으며, 이에 따른 평균값과 표준오차는 Microsoft Excel program을 사용하여 분석하였다.
이론/모형
- HCT116대장암세포에서 LY294002 (PI3K/Akt 저해제)와 BIO (GSK-3β 저해제), Rapamycin (mTOR 저해제)의 처리가 apoptosis 관련 신호단백질에 미치는 영향을 알아보고자 Western blotting을 실시하였다. 그 결과 Fig.
- 또한 비활성화된 GSK-3β는 p53의 분해를 유도하여 암세포의 성장과 증식을 돕는 것으로 보고되었다[17]. 본 연구에서는 HCT116대장암세포에 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 처리하여 apoptosis와 관련된 신호단백질들의 발현 변화를 알아보고자 Western blotting을 실시하였다. 그 결과 Fig.
성능/효과
- 그 결과 Fig. 1A와 같이 CME의 농도가 증가할수록 HCT116 대장암세포의 세포생존율이 감소하는 것을 확인하였으며, 12시간보다 24 시간과 48 시간에서 더 높은 세포증식 억제 효과를 확인하였다. Fig.
- 또한 섬유아세포(Fibroblast)에 CME를 HCT116세포와 동일한 농도로 처리하여 normal cell에서CME에 의한 세포독성을 확인한 결과, Fig. 1B에서와 같이, Fibroblast세포에서는 CME에 의한 세포독성 및 세포증식억제효과가 나타나지 않음을 확인하였다. 따라서, CME는 HCT116대장암세포의 증식억제에 효과적인 것으로 확인하였다.
- 그 결과 Fig. 3에서와 같이 세포의 증식을 조절하는 p-Akt와 p-TSC2, p-mTOR의 수준이 CME 처리에 의하여 감소하는 것을 확인하였으며, 비활성화 상태인 p-GSK-3β의 수준이 감소함에 따라 직접적으로 영향을 받는 β-catenin의 발현이 감소하고, p53의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 선행연구에 따르면, p-Akt의 수준이 감소할수록 p-TSC2와 p-mTOR의 수준이 감소하며, p-GSK-3β의 수준이 감소할수록 p53의 발현이 증가하는 것으로 보고되었다[3, 17, 30].
- 그 결과 Fig. 5에서와 같이 LY294002 및 Rapamycin 처리에 따라 p-Akt와 p-mTOR 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, 이에 따라 신호경로 하위 단백질인 p-TSC2, β-catenin, p-GSK-3β, pro-caspase-3, Bcl-2의 발현이 감소하고, p53, p-β-catenin, PUMA, Bax, Bak, cleaveged PARP의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. CME 처리 군의 apoptosis 관련 단백질 조절양상을 다른 군들과 비교해 보았을 때, 이러한 Akt/mTOR 신호경로 단백질의 조절이 LY294002 및 Rapamycin처리 군과 유사하게 일어난 것을 확인하였다.
- 5에서와 같이 LY294002 및 Rapamycin 처리에 따라 p-Akt와 p-mTOR 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, 이에 따라 신호경로 하위 단백질인 p-TSC2, β-catenin, p-GSK-3β, pro-caspase-3, Bcl-2의 발현이 감소하고, p53, p-β-catenin, PUMA, Bax, Bak, cleaveged PARP의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. CME 처리 군의 apoptosis 관련 단백질 조절양상을 다른 군들과 비교해 보았을 때, 이러한 Akt/mTOR 신호경로 단백질의 조절이 LY294002 및 Rapamycin처리 군과 유사하게 일어난 것을 확인하였다. 선행연구에 의하면, LY294002 및 Rapamycin의 처리에 따라 p53의 발현이 증가하여 apoptosis를 유도하며, BIO가 p-GSK-3β의 발현을 증가시키고, p-β-catenin의 발현을 저해한다고 보고되었다[7, 16].
- 32%로 농도의존적으로 증가함을 확인하였다. CME의 처리에 따라 G1기의 세포 비율이 증가하는 것으로 보아 HCT116대장암세포에서의 세포증식억제효과는 CME가 G1 checkpoint arrest를 유도함으로써 발생한 것으로 확인하였다.
- 1B에서와 같이, Fibroblast세포에서는 CME에 의한 세포독성 및 세포증식억제효과가 나타나지 않음을 확인하였다. 따라서, CME는 HCT116대장암세포의 증식억제에 효과적인 것으로 확인하였다.
- 81%로 점차 증가하는 것을 확인하였다. 또한 CME를 농도별(40, 60, 80 μg/ml)로 24시간 동안 처리하여 생성되는 apoptotic body를 관찰한 결과, CME의 농도가 증가할수록 apoptotic body의 수가 증가함을 확인하였다(Fig. 2B).
- 93%으로 나타났다. 본 실험의 결과, CME에 의한 세포증식 억제와 apoptosis, cell cycle arrest 유도 효과가 저해제를 처리하여 Akt, mTOR, GSK-3 경로를 저해했을 때의 결과와 비슷하거나 더 큰 것으로 확인하였다. 이러한 실험 결과를 토대로, HCT116대장암세포에서 CME에 의한 세포증식억제와 apoptosis 및 Cell Cycle Arrest 유도 효과는 Akt/mTOR/GSK-3β 신호경로를 통하여 일어나는 것으로 확인하였다.
- 증가된 Bax와 Bak은 미토콘드리아 외막에 구멍을 형성하여 cytochrome c의 방출을 유도하며, 방출된 cytochrome c에 의하여 caspase-3가 활성화됨에 따라 Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)가 분절되어 apoptosis가 유도된다[27, 29]. 본 실험의 결과에서도 PUMA의 발현이 감소함에 따라 Bcl-2, pro-caspase-3의 발현이 감소하고, Bax와 Bak, cleaveged PARP의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 실험결과를 바탕으로 HCT116대장암세포에서 CME의 처리가 세포의 증식에 관여하는 단백질의 발현은 감소시키고, apoptosis에 관여하는 단백질의 발현은 증가시킴으로써 apoptosis를 유도하는 것을 확인하였다.
- 선행연구에 의하면, LY294002 및 Rapamycin의 처리에 따라 p53의 발현이 증가하여 apoptosis를 유도하며, BIO가 p-GSK-3β의 발현을 증가시키고, p-β-catenin의 발현을 저해한다고 보고되었다[7, 16]. 본 연구의 결과에서도 BIO 처리 군에서 p-GSK-3β의 발현이 증가되었고, p-β-catenin의 발현은 저해되었으며 나머지 신호단백질들의 발현 변화는 control군과 유사한 것을 확인하였다. 이러한 실험결과를 바탕으로 CME에 의한 HCT116대장암세포의 apoptosis 유도 효과는 Akt/mTOR/GSK-3β 신호경로 단백질의 조절을 통하여 일어난 것으로 확인하였다.
- 2B). 이러한 결과를 통하여 CME에 의한 HCT116대장암세포의 증식억제 효과는 necrosis가 아닌 apoptosis 유도에 의한 것으로 확인하였다.
- 본 실험의 결과, CME에 의한 세포증식 억제와 apoptosis, cell cycle arrest 유도 효과가 저해제를 처리하여 Akt, mTOR, GSK-3 경로를 저해했을 때의 결과와 비슷하거나 더 큰 것으로 확인하였다. 이러한 실험 결과를 토대로, HCT116대장암세포에서 CME에 의한 세포증식억제와 apoptosis 및 Cell Cycle Arrest 유도 효과는 Akt/mTOR/GSK-3β 신호경로를 통하여 일어나는 것으로 확인하였다.
- 본 연구의 결과에서도 BIO 처리 군에서 p-GSK-3β의 발현이 증가되었고, p-β-catenin의 발현은 저해되었으며 나머지 신호단백질들의 발현 변화는 control군과 유사한 것을 확인하였다. 이러한 실험결과를 바탕으로 CME에 의한 HCT116대장암세포의 apoptosis 유도 효과는 Akt/mTOR/GSK-3β 신호경로 단백질의 조절을 통하여 일어난 것으로 확인하였다.
- 본 실험의 결과에서도 PUMA의 발현이 감소함에 따라 Bcl-2, pro-caspase-3의 발현이 감소하고, Bax와 Bak, cleaveged PARP의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 실험결과를 바탕으로 HCT116대장암세포에서 CME의 처리가 세포의 증식에 관여하는 단백질의 발현은 감소시키고, apoptosis에 관여하는 단백질의 발현은 증가시킴으로써 apoptosis를 유도하는 것을 확인하였다.
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