피부의 가장자리에 위치한 표피는 개체의 생존에 절대적으로 중요하며, 기저막에 위치한 표피줄기세포에 의해 평생 끊임없이 재생되고 있다. 표피줄기세포는 한정된 세포분열을 진행하고 각질세포로 분화하는 transit amplifying (TA)세포를 만들어 냄으로써 오랜 기간 재생에 필요한 많은 각질세포를 만들어 낼 수 있다. 본 연구에서는 표피줄기세포 세포분열 활성화 화합물로 목단으로부터 추출한 페오놀(paeonol)을 350여 개의 화합물들로부터 검색해 냈다. 이러한 세포분열 활성화 효능은 표피줄기세포 특이적으로 나타나며, 표피줄기세포의 지표로 알려진 p63 단백질의 발현 경향은 페오놀을 처리한 표피줄기세포에서 변화하지 않음을 유세포분석법으로 확인하였다. 콜로니형성 분석에서는 페오놀을 처리한 표피줄기세포가 1.3배 이상 더 나은 콜로니 형성능을 보여 주었다. 그리고 PCR array 분석을 통해서 페오놀의 효능은 여러 신호전달에 의해 나타남을 알 수 있었다. 이러한 결과들로부터 페오놀이 줄기세포성에 영향을 주지 않고 표피줄기세포의 재생능력을 향상시키므로 표피줄기세포 활성화 물질로서 화장품 소재로 적용될 수 있을 것으로 판단된다.
피부의 가장자리에 위치한 표피는 개체의 생존에 절대적으로 중요하며, 기저막에 위치한 표피줄기세포에 의해 평생 끊임없이 재생되고 있다. 표피줄기세포는 한정된 세포분열을 진행하고 각질세포로 분화하는 transit amplifying (TA)세포를 만들어 냄으로써 오랜 기간 재생에 필요한 많은 각질세포를 만들어 낼 수 있다. 본 연구에서는 표피줄기세포 세포분열 활성화 화합물로 목단으로부터 추출한 페오놀(paeonol)을 350여 개의 화합물들로부터 검색해 냈다. 이러한 세포분열 활성화 효능은 표피줄기세포 특이적으로 나타나며, 표피줄기세포의 지표로 알려진 p63 단백질의 발현 경향은 페오놀을 처리한 표피줄기세포에서 변화하지 않음을 유세포분석법으로 확인하였다. 콜로니형성 분석에서는 페오놀을 처리한 표피줄기세포가 1.3배 이상 더 나은 콜로니 형성능을 보여 주었다. 그리고 PCR array 분석을 통해서 페오놀의 효능은 여러 신호전달에 의해 나타남을 알 수 있었다. 이러한 결과들로부터 페오놀이 줄기세포성에 영향을 주지 않고 표피줄기세포의 재생능력을 향상시키므로 표피줄기세포 활성화 물질로서 화장품 소재로 적용될 수 있을 것으로 판단된다.
Epidermis is continuously regenerated by keratinocyte stem cells (KSCs) residing in basement membrane, which is critical to the survival of an organism. KSCs are believed to persist during the whole lifetime and generate an enormous number of keratinocytes, required for the maintenance of epidermis,...
Epidermis is continuously regenerated by keratinocyte stem cells (KSCs) residing in basement membrane, which is critical to the survival of an organism. KSCs are believed to persist during the whole lifetime and generate an enormous number of keratinocytes, required for the maintenance of epidermis, through transit amplifying cells dividing definite times until they become differentiated. In this report, we have developed a phenolic compound, paeonol, purified from Moutan Cortex, as a KSC proliferation activator, by screening about 350 herbal compounds. The cell proliferation activation by paeonol is specific for KSC not for keratinocyte, and no significant difference in the expression of p63 protein, a KSC marker, in KSCs treated with paeonol was observed in FACS analysis with anti-p63 antibody. In the colony forming assay, paeonol-treated KSC showed improved colony forming activity more than 1.3 fold. In addition, the result of PCR array shows that the activity of paeonol is through several signal pathways involving stem cell functions. These results suggest that paeonol could enhance KSC proliferation activity without reduction in stemness and could be applied to cosmetics as a KSC activating ingredient.
Epidermis is continuously regenerated by keratinocyte stem cells (KSCs) residing in basement membrane, which is critical to the survival of an organism. KSCs are believed to persist during the whole lifetime and generate an enormous number of keratinocytes, required for the maintenance of epidermis, through transit amplifying cells dividing definite times until they become differentiated. In this report, we have developed a phenolic compound, paeonol, purified from Moutan Cortex, as a KSC proliferation activator, by screening about 350 herbal compounds. The cell proliferation activation by paeonol is specific for KSC not for keratinocyte, and no significant difference in the expression of p63 protein, a KSC marker, in KSCs treated with paeonol was observed in FACS analysis with anti-p63 antibody. In the colony forming assay, paeonol-treated KSC showed improved colony forming activity more than 1.3 fold. In addition, the result of PCR array shows that the activity of paeonol is through several signal pathways involving stem cell functions. These results suggest that paeonol could enhance KSC proliferation activity without reduction in stemness and could be applied to cosmetics as a KSC activating ingredient.
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문제 정의
노화에 따라서 감소하는 표피줄기세포를 재생시켜주는 효능 소재를 찾기 위하여 350여 종의 천연물 유래 화합물 라이브러리로부터 표피줄기세포 분열 활성을 높여 주는 화합물을 검색하였다. Figure 1A에서 설명한 것과 같이 실험법에 기술된 CCK-8 측정법을 활용하여 3일 동안 자란 표피줄기세포의 숫자를 비교하여, 페오놀을 표피줄기세포 세포 분열 활성화 소재로 발굴하였다(Figure 1B).
본 연구에서는 노화가 진행되면서 감소하는 표피줄기세포를 재생시키는 안티에이징 소재를 찾고자 천연물 유래 화합물 라이브러리에서 표피줄기세포 활성화 소재를 검색하였으며, 페오놀을 표피줄기세포 세포 분열 활성화 물질로 발굴하였다.
본 연구에서는 노화에 따른 표피줄기세포 감소를 개선하기 위해서 천연물 유래 화합물 라이브러리로부터 표피줄기세포의 세포 분열 능력을 개선하는 화합물을 검색하여 페오놀을 찾았다.
이번 연구를 통해 페오놀의 표피줄기세포 재생 활성화를 통한 피부 안티에이징 소재로서 효능을 확인하였으며, 안티에이징 화장품 소재로 가능성을 제안하고자 한다.
제안 방법
Cell debris를 제거하기 위해 15000 rpm에서 15 min 간 원심 분리 후 상등액을 SDS-PAGE에서 전기영동 분석을 하였다.
DNA 합성 시에 결합되는 5-bromo-2’-deoxyuridine(BrdU)를 이용한 효소결합 면역반응시스템(ELISA)(Roche, Switzerland)을 이용하여 제공된 프로토콜에 따라 세포 복제 정도를 측정하였다.
Figure 1A에서 설명한 것과 같이 실험법에 기술된 CCK-8 측정법을 활용하여 3일 동안 자란 표피줄기세포의 숫자를 비교하여, 페오놀을 표피줄기세포 세포 분열 활성화 소재로 발굴하였다(Figure 1B).
TBST로 10 min씩 3번 세척 후 horse radish peroxidase (HRP)가 결합된 2차 항체(Cell Signaling Technology, USA)와 1 h 동안 상온에서 반응한 후 다시 TBST로 10 min 간 3회 반복하여 세척하였다.
그리고 페오놀에 의한 세포분열주기 변화를 관찰하고, 표피줄기세포 마커인 p63 단백질의 발현 변화 관찰을 통해 그 효능을 검증하였다.
메커니즘 탐색을 위해서 줄기세포 관련 유전자 89 종을 한번에 RT-PCR로 분석하는 RT2 Profiler PCR Array (Qiagen)를 수행하였다.
세포주기 분석실험을 위해 35 mm 배양용 접시에 1 × 106개의 표피줄기세포를 배양액 조건에서 깔고 12 h 뒤 소 뇌하수체 추출물이 들어가지 않은 배양액 조건에서 페오놀을 처리하여 24 h 배양 후, 표피줄기세포를 수확하여 PBS로 두 번 세척한 후 3 mL의 70% 에탄올에서 4 ℃에 최소 2 h 동안 세포고정 하고, 50 µg/mL propidium iodide (Sigma, USA)와 0.1%의 Triton X-100(Sigma, USA) 및 0.1 mg/mL DNase-free RNase A(Sigma, USA)가 포함된 PBS 용액 500 µL에서 30 min간 실온에 둔 뒤, fluorescence activated cell sorting sys-tem (FACS CaliburTM, BD, USA) 장비를 통하여 분석하였다.
세포를 24 h 동안 배양한 후, 물질을 처리하고 배양액 조건에서 14일 간 배양하였다. 이후 10% formalin과 0.3% toluidine blue 혼합액을 처리하여, 세포를 염색한 후 형성된 콜로니를 확인하였다. 일정한 크기 이상 되는 콜로니를 Fusion Fx 5 image system (Vilber Lourmat, Germany)의 colony counting 분석법을 이용하여 측정하였다.
이후 검출 시약(ECL solution)을 처리한 후 UV fluorescence 장비(Fusion Fx5TM, Vilber Lourmat, Germany)를 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 사람 피부 유래 표피줄기세포(human epidermal keratinocyte progenitor cell)는 CELLnTEC (HPEKp.05, Switzerland)에서 구입하였다.
본 실험에 사용한 천연물 유래 화합물 라이브러리를 구성하고 있는 화합물들은 중국 업체(Shaanxi Huike Botanical Development)를 통해서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
실험 결과는 평균값과 표준편차로 나타내었으며, Student’s t-test법을 이용하여 p-value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
세포의 성장률은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Japan)을 이용하여 판매사에서 제공한 실험법에 따라 측정하였다.
일정한 크기 이상 되는 콜로니를 Fusion Fx 5 image system (Vilber Lourmat, Germany)의 colony counting 분석법을 이용하여 측정하였다.
페오놀이 표피줄기세포 세포 주기에 미치는 영향을 확인하기 위해 세포 분열이 진행 중인 세포를 측정할 수 있는 BrdU 분석법을 활용하였다.
성능/효과
결과는 Table 1에서와 같이 0.65배 이하로 발현량이 감소한 유전자는 4종, 1.5배 이상 증가한 유전자는 37종으로 나타났다.
그리고 페오놀이 각질세포(epidermal keratinocyte)에도 유사한 효능을 나타내는지 알아보기 위해 실험한 결과 페오놀 처리군은 무처리군과 유사한 정도의 세포 수 증가를 보였으며, 혈청이 들어간 배양배지에서는 무처리군에 비해 1.5배 이상 세포 수가 증가한 것을 관찰할 수 있었다(Figure 2C).
배양배지와 사이토카인 처리군에서 S 주기와 G2/M 주기가 3배 이상 늘어나 있으며 페오놀 처리군에서는 S 주기는 약간 줄어들었지만 G2/M 주기가 늘어나 둘의 합은 무처리군에 비해 1.5배 이상 늘어난 것을 확인할 수 있었다.
본 연구를 통하여 페오놀의 표피줄기세포 세포 분열 활성화 효능을 발굴하였고, 이를 통해 노화에 따른 표피줄기세포 감소를 막아주는 안티에이징 소재로 활용 가능성을 확인하였다.
3배 정도 증가한 것으로 나타났다. 위의 결과로 페오놀을 처리하면 표피줄기세포의 지속적 세포 분열이 활성화 되어 더 크고, 더 많은 수의 콜로니가 형성되는 것을 볼 수 있다.
위의 결과로부터 페오놀이 휴지기에 있는 표피줄기세포를 세포 분열의 주기 중에 DNA가 복제되고 두 개의 딸세포로 나눠지는 S 주기와 G2/M 주기로 유도하여 세포 분열을 활성화 하는 것을 확인할 수 있었다.
페오놀의 작용 기작을 알기 위하여 줄기세포 관련 89종 유전자의 발현 변화 분석을 한결과 41종에서 유의미한 변화를 관찰하였으며, 그 중에서 self-renewal 관련 유전자들, 텔로미어 복제 관련 유전자, WNT/Notch 관련 유전자들의 발현이 증가하였다. 이를 통해 페오놀이 줄기세포의 자기복제에 관련된 여러 신호 전달 체계에 복합적으로 영향을 주는 것을 알 수 있었다.
이를 통해서 페오놀에 의한 표피줄기 세포 세포 수 증가는 줄기세포에 특이적으로 나타나는 효능임을 확인할 수 있었다.
증가한 유전자 중에는 self-renewal에 관여한다고 알려진 유전자 4종을 비롯하여 텔로미어(telomere) 복제에 중요한 TERT 유전자와 WNT 신호전달 관련 유전자 2종, Notch 신호전달 관련 유전자 5종이 포함되어 있다. 이를 통해서 페오놀이 self-renewal 관련 유전자와 줄기세포에서 중요한 WNT/Notch 신호전달 관련 유전자의 발현을 유도하여 표피줄기세포의 재생 능력을 활성화 시키고, TERT 유전자를 활성화함으로써 텔로미어 상실에 의한 세포 노화 현상을 막아 주는 것을 알 수 있다. 위와 같이 페오놀은 특정한 하나의 유전자나 신호전달 체계를 통해 표피줄기세포 재생을 활성화 하는 것이 아니라 다양한 유전자들의 발현을 조절하여 표피줄기 세포 재생을 유도하는 것을 알 수 있다.
GAPDH는 loading control로 involucrin은 각질세포 분화 마커로 각각 발현량을 확인하였다. 이를 통해서 페오놀이 표피줄기세포의 자기 복제 능력만을 활성화하고, 각질세포로 분화를 유도하지는 않는 것을 확인할 수 있다.
콜로니를 정량적으로 분석하기 위해서 Fusion Fx 5 image system의 colony counting 분석법을 이용하여 콜로니 개수를 측정한 결과 무처리군은 65개, 페오놀 처리군은 87개로 1.3배 정도 증가한 것으로 나타났다.
페오놀에 의한 세포 분열 활성화가 표피줄기세포의 분화에는 영향을 주지 않음을 p63 마커 확인을 통해서 검증하였으며, 줄기세포의 특성 중 하나인 콜로니 형성을 보는 CFA에서도 개선효과를 나타내었다.
페오놀의 작용 기작을 알기 위하여 줄기세포 관련 89종 유전자의 발현 변화 분석을 한결과 41종에서 유의미한 변화를 관찰하였으며, 그 중에서 self-renewal 관련 유전자들, 텔로미어 복제 관련 유전자, WNT/Notch 관련 유전자들의 발현이 증가하였다.
표피줄기세포의 세포 분열 주기 변화 분석을 통해 페오놀이 휴지기의 세포를 복제기로 유도하여 표피줄기세포의 세포 분열을 활성화하는 것을 확인하였다.
후속연구
본 연구를 통하여 페오놀의 표피줄기세포 세포 분열 활성화 효능을 발굴하였고, 이를 통해 노화에 따른 표피줄기세포 감소를 막아주는 안티에이징 소재로 활용 가능성을 확인하였다. 앞으로 임상 시험을 통한 생체내에서 페오놀의 표피줄기세포 재생에 대한 효능 연구를 추가적으로 수행할 필요가 있다고 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
표피줄기세포는 어떠한 기능을 가지고 있는가?
피부의 가장자리에 위치한 표피는 개체의 생존에 절대적으로 중요하며, 기저막에 위치한 표피줄기세포에 의해 평생 끊임없이 재생되고 있다. 표피줄기세포는 한정된 세포분열을 진행하고 각질세포로 분화하는 transit amplifying (TA)세포를 만들어 냄으로써 오랜 기간 재생에 필요한 많은 각질세포를 만들어 낼 수 있다. 본 연구에서는 표피줄기세포 세포분열 활성화 화합물로 목단으로부터 추출한 페오놀(paeonol)을 350여 개의 화합물들로부터 검색해 냈다.
표피줄기세포는 피부가 손상을 받았을 때 표피층을 유지하기 위해 어떠한 작업을 하는가?
이와 같이 표피층을 유지하기 위해서 표피줄기세포, TA세포, 그리고 각질 세포들이 평생 동안 끊임없이 세포 분열과 분화를 해야만 한다. 그중에서도 표피줄기세포는 평소에는 간헐적으로 분열하여 TA세포와 표피줄기세포를 하나씩 만드는 이종 세포 분열을 진행하고, 피부가 손상을 받았을 때에서는 집중적으로 분열을 하여 표피층 재건에 필요한 TA세포와 각질 세포들을 만들어낸다[5,6].
피부의 가장자리에 위치한 표피는 무엇의 의해 끊임없이 재생되는가?
피부의 가장자리에 위치한 표피는 개체의 생존에 절대적으로 중요하며, 기저막에 위치한 표피줄기세포에 의해 평생 끊임없이 재생되고 있다. 표피줄기세포는 한정된 세포분열을 진행하고 각질세포로 분화하는 transit amplifying (TA)세포를 만들어 냄으로써 오랜 기간 재생에 필요한 많은 각질세포를 만들어 낼 수 있다.
참고문헌 (11)
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N. Gago, V. Perez-Lopez, J. P. Sanz-Jaka, P. Cormenzana, I. Eizaguirre, A. Bernad, and A. Izeta, Age-dependent depletion of human skin-derived progenitor cells, Stem Cells, 27(5), 1164 (2009).
H. R. Choi, Y. A. Kang, J. I. Na, S. Y. Huh, C. H. Hur, K. H. Kim, and K. C. Park, Oligosaccharides of hyaluronic acid increased epidermal cell stemness by modulation of integrin expression, J. Cosmet. Dermatol., 11(4), 290 (2012).
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