대장균 베타-갈락토시데이즈를 이용하여 합성된 1, 2-Hexanediol Galactoside의 NMR Spectroscopy 및 Mass spectrometry NMR Spectroscopy and Mass Spectrometry of 1, 2-Hexanediol Galactoside synthesized using Escherichia coli β-Galactosidase원문보기
화장품용 방부제로 사용하고 있는 1, 2-hexanediol (HD)에 높은 농도의 lactose (300 g/l)를 넣고, 재조합 대장균 ${\beta}$-galactosidase (${\beta}$-gal)를 이용하여 galactose 한 분자를 결합시키는 transgalactosylation 반응을 시켜서, 1, 2-hexanediol galactoside (HD-gal)을 합성하였다. 그리고, 합성된 HD-gal 분자를 확인하기 위하여, HD-gal에 대한 NMR ($^1H$- and $^{13}C$-) 스펙트럼 분석과 mass 스펙트럼 분석을 실시하였다. HD-gal의 $^1H$NMR 스펙트럼에서 HD에 갈락토실화가 되었음을 보여주는 다양한 피크를 확인하였다. $^1H$ NMR 스펙트럼의 다운필드인 ${\delta}_H$ 4.44 ppm과 ${\delta}_H$ 3.96~3.58 ppm에서 나타나는 다양한 피크들은 HD에 갈락토실화가 되었다는 것을 잘 암시하고 있으며, 또한 $^1H$ NMR 스펙트럼의 업필드에서 나타나는 ${\delta}_H$ 1.60~1.35 ppm과 0.92 ppm의 피크는 HD의 $CH_2$와 $CH_3$ 작용기로부터 나타나는 피크로써 HD가 본 물질에 존재한다는 것을 나타내고 있다. $^{13}C$ NMR 스펙트럼에서는 HD-gal의 알파-아노머와 베타-아노머의 구조에서 기인하는 총 21의 카본피크가 나타났고, 각 아노머마다 12개의 카본이 존재하는데 이중 ${\delta}_C$ 68.6, 60.9 and 13.2 ppm에 보이는 3개의 카본은 겹쳐서 나타나 총 24개의 피크 중 21개가 나타났다. 또한, 질량스펙트럼 분석에서는 protonated HD-gal인 281.1601 (m/z)의 peak를 확인할 수 있었다. 이를 종합하면, NMR ($^1H$- and $^{13}C$-) 스펙트럼 분석 결과와 질량분석 결과들은 우리가 기대했던 HD-gal의 구조와 매우 잘 일치하고 있다는 것을 알 수 있었다. 앞으로 추가적으로, 세균에 대한 minimum inhibitory concentrations (MICs) 조사와 human skin cell에 대한 독성연구를 추가적으로 진행할 예정이며, 이러한 결과를 근거로 항균력을 유지하면서 피부세포에 대한 독성이 감소된 화장품용 방부제의 연구/개발이 계속되기를 기대하고 있다.
화장품용 방부제로 사용하고 있는 1, 2-hexanediol (HD)에 높은 농도의 lactose (300 g/l)를 넣고, 재조합 대장균 ${\beta}$-galactosidase (${\beta}$-gal)를 이용하여 galactose 한 분자를 결합시키는 transgalactosylation 반응을 시켜서, 1, 2-hexanediol galactoside (HD-gal)을 합성하였다. 그리고, 합성된 HD-gal 분자를 확인하기 위하여, HD-gal에 대한 NMR ($^1H$- and $^{13}C$-) 스펙트럼 분석과 mass 스펙트럼 분석을 실시하였다. HD-gal의 $^1H$ NMR 스펙트럼에서 HD에 갈락토실화가 되었음을 보여주는 다양한 피크를 확인하였다. $^1H$ NMR 스펙트럼의 다운필드인 ${\delta}_H$ 4.44 ppm과 ${\delta}_H$ 3.96~3.58 ppm에서 나타나는 다양한 피크들은 HD에 갈락토실화가 되었다는 것을 잘 암시하고 있으며, 또한 $^1H$ NMR 스펙트럼의 업필드에서 나타나는 ${\delta}_H$ 1.60~1.35 ppm과 0.92 ppm의 피크는 HD의 $CH_2$와 $CH_3$ 작용기로부터 나타나는 피크로써 HD가 본 물질에 존재한다는 것을 나타내고 있다. $^{13}C$ NMR 스펙트럼에서는 HD-gal의 알파-아노머와 베타-아노머의 구조에서 기인하는 총 21의 카본피크가 나타났고, 각 아노머마다 12개의 카본이 존재하는데 이중 ${\delta}_C$ 68.6, 60.9 and 13.2 ppm에 보이는 3개의 카본은 겹쳐서 나타나 총 24개의 피크 중 21개가 나타났다. 또한, 질량스펙트럼 분석에서는 protonated HD-gal인 281.1601 (m/z)의 peak를 확인할 수 있었다. 이를 종합하면, NMR ($^1H$- and $^{13}C$-) 스펙트럼 분석 결과와 질량분석 결과들은 우리가 기대했던 HD-gal의 구조와 매우 잘 일치하고 있다는 것을 알 수 있었다. 앞으로 추가적으로, 세균에 대한 minimum inhibitory concentrations (MICs) 조사와 human skin cell에 대한 독성연구를 추가적으로 진행할 예정이며, 이러한 결과를 근거로 항균력을 유지하면서 피부세포에 대한 독성이 감소된 화장품용 방부제의 연구/개발이 계속되기를 기대하고 있다.
1, 2-Hexanediol galactoside (HD-gal) has been synthesized from 1, 2-hexanediol (HD), a cosmetic preservative, using recombinant Escherichia coli ${\beta}$-galactosidase (${\beta}$-gal) at the high lactose concentration (300 g/l). To confirm the molecular structure of synthesize...
1, 2-Hexanediol galactoside (HD-gal) has been synthesized from 1, 2-hexanediol (HD), a cosmetic preservative, using recombinant Escherichia coli ${\beta}$-galactosidase (${\beta}$-gal) at the high lactose concentration (300 g/l). To confirm the molecular structure of synthesized HD-gal, NMR ($^1H$- and $^{13}C$-) spectroscopy and mass spectrometry of HD-gal were conducted. $^1H$ NMR spectrum of HD-gal showed multiple peaks corresponding to the galactocyl group, which is an evidence of galactocylation on HD. Downfield proton peaks at ${\delta}_H$ 4.44 ppm and multiple peaks from ${\delta}_H$3.96~3.58 ppm were indicative of galactocylation on HD. Up field proton peaks at ${\delta}_H$ 1.60~1.35 ppm and 0.92 ppm showed the presence of $CH_2$ and $CH_3$ protons of HD. $^{13}C$ NMR spectrum revealed the presence of 21 carbons suggestive of ${\alpha}$- and ${\beta}$-anomers of HD-gal. Among 12 carbon peaks from each anomers, the 3 peaks at dC 68.6, 60.9 and 13.2 ppm were assigned to be overlapped showing only 21 peaks out of total 24 peaks. The mass value (protonated HD-gal, m/z = 281.1601) from mass spectrometry analysis of HD-gal, and $^1H$ and $^{13}C$ NMR spectral data were in well agreement with the expecting structure of HD-gal. For further study, the minimum inhibitory concentrations (MICs) of HD-gal against bacteria will be investigated, and, in addition, cytotoxicity to human skin cells of HD-gal will be examined. It is expected that it will eventually be able to develop a new cosmetic preservative, which have low cytotoxicity against human skin cell and maintains antimicrobial effect.
1, 2-Hexanediol galactoside (HD-gal) has been synthesized from 1, 2-hexanediol (HD), a cosmetic preservative, using recombinant Escherichia coli ${\beta}$-galactosidase (${\beta}$-gal) at the high lactose concentration (300 g/l). To confirm the molecular structure of synthesized HD-gal, NMR ($^1H$- and $^{13}C$-) spectroscopy and mass spectrometry of HD-gal were conducted. $^1H$ NMR spectrum of HD-gal showed multiple peaks corresponding to the galactocyl group, which is an evidence of galactocylation on HD. Downfield proton peaks at ${\delta}_H$ 4.44 ppm and multiple peaks from ${\delta}_H$3.96~3.58 ppm were indicative of galactocylation on HD. Up field proton peaks at ${\delta}_H$ 1.60~1.35 ppm and 0.92 ppm showed the presence of $CH_2$ and $CH_3$ protons of HD. $^{13}C$ NMR spectrum revealed the presence of 21 carbons suggestive of ${\alpha}$- and ${\beta}$-anomers of HD-gal. Among 12 carbon peaks from each anomers, the 3 peaks at dC 68.6, 60.9 and 13.2 ppm were assigned to be overlapped showing only 21 peaks out of total 24 peaks. The mass value (protonated HD-gal, m/z = 281.1601) from mass spectrometry analysis of HD-gal, and $^1H$ and $^{13}C$ NMR spectral data were in well agreement with the expecting structure of HD-gal. For further study, the minimum inhibitory concentrations (MICs) of HD-gal against bacteria will be investigated, and, in addition, cytotoxicity to human skin cells of HD-gal will be examined. It is expected that it will eventually be able to develop a new cosmetic preservative, which have low cytotoxicity against human skin cell and maintains antimicrobial effect.
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문제 정의
본 연구에서는 HD-gal 합성에 대한 몇 가지 선행연구에 대한 후속 연구를 진행하였다. 첫 번째 선행연구에서는 β-gal 포함하는 재조합 대장균을 이용하여 transgalactosylation 반응으로 HD-gal이 합성된다는 사실을 실험적으로 확인하였고[4], 두 번째 연구로 합성된 HD-gal을 solvent extraction과 silica gel chromatography를 이용하여, 효과적으로 분리/정제하는 방법에 대하여 연구 중에 있다.
첫 번째 선행연구에서는 β-gal 포함하는 재조합 대장균을 이용하여 transgalactosylation 반응으로 HD-gal이 합성된다는 사실을 실험적으로 확인하였고[4], 두 번째 연구로 합성된 HD-gal을 solvent extraction과 silica gel chromatography를 이용하여, 효과적으로 분리/정제하는 방법에 대하여 연구 중에 있다. 본 연구에서는 순수 분리된 HD-gal에 대한 1H- and 13C-NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy, 그리고 mass spectrometry 연구를 수행하였다. 이를 통하여, HD-gal 분자에 한 분자의 galactose가 어떻게 결합하고 있는지에 대한 실험적 증거를 제시하려고 하였다.
이러한 1, 2-alkanediol 계열의 화합물에서 alkyl chain의 길이가 길어질수록 독성이 높아지며, 몇 가지 1, 2-alkanediol을 혼합하여 사용하면, 피부에 대한 독성이 있는 것으로 알려져 있다[1-3]. 본 연구팀에서는 보다 안전한 방부제 연구/개발을 위하여, HD 분자에 한 분자의 galactose를 효소를 이용하여 결합시킨, 1, 2-hexanediol galactoside (HD-gal)를 만드는 연구를 진행하여왔다[4]. HD 뿐만 아니라, chlorphenesin (CPN)과 phenoxyethanol (PE) 같은 화장품에 쓰이는 방부제에도 galactose를 한 분자 결합시켜서, chlorphenesin galactoside (CPN-gal)와 phenoxyethanol galactoside (PE-gal)를 같은 방법으로 이미 합성하였다[5, 6].
본 연구에서는 순수 분리된 HD-gal에 대한 1H- and 13C-NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy, 그리고 mass spectrometry 연구를 수행하였다. 이를 통하여, HD-gal 분자에 한 분자의 galactose가 어떻게 결합하고 있는지에 대한 실험적 증거를 제시하려고 하였다. 앞으로 이러한 결과를 근거로 피부에 대한 독성이 감소된 화장품용 방부제 개발의 과학적 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 생각되며, HD-gal에 대한 항균시험과 세포독성 실험 등을 추가로 실시할 수 있을 것으로 생각된다.
제안 방법
400 MHz NMR Spectrometer (Bruker Ascend 400, Bruker, Germany)를 이용한 1H-NMR과 13C-NMR 분석을 하였다. 이 때, 사용한 solvent는 D2O이며, 정제된 HD-gal을 약 20 mg 1000 μl D2O에 녹여 NMR 시료로 사용하였다.
SYNAPT G2 (Waters, UK) mass spectrometer를 사용하여 정제된 HD-gal의 질량 분석을 실시하였다. Ionization source는 ESI(electrospray ionization)으로, analyze type은 time of flight (TOF)로 하여 분석하였다.
NMR (1H- and 13C-) spectroscopy와 mass spectrometry 분석을 통하여, 재조합 대장균 β-gal을 이용하여 HD의 hydroxyl group에 galactose 한 분자를 결합시켜 합성한 HD-gal 분자구조와 질량을 확인하였다.
SYNAPT G2 (Waters, UK) mass spectrometer를 사용하여 정제된 HD-gal의 질량 분석을 실시하였다. Ionization source는 ESI(electrospray ionization)으로, analyze type은 time of flight (TOF)로 하여 분석하였다.
Transgalactosylation 반응을 시킬 때에는 β-gal을 정제 하지 않고, 재조합 대장균 세포 자체를 직접 사용하였다. 그리고 lactose 농도를 300 g/l 정도 첨가하여, reverse hydrolysis 반응에 의하여 transgalactosylation 반응이 일어나도록 하였다.
대장균의 araBAD 프로모터 시스템에 의하여 발현이 조절되는 vector를 사용하여 E. coil을 발현 숙주로 하여 재조합 β-gal 효소를 발현하였다.
본 연구의 transgalactosylation 반응에 사용한 효소는 재조합 대장균에서 발현된 β-galactosidase (β-gal)이며, 선행연구에서 보고한 것과 같이 대장균 세포 내에 inclusion body 형태로 발현되고, 활성 증진을 위하여 발현속도를 조절하였고, inducer (D-arabinose) 첨가 후, inducer analog를 첨가하여 발현시켰다[14].
대상 데이터
1, 2-Hexanediol은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였고, HD-gal 정제를 위한 Silica gel은 Zeochem (Uetikon am See, Switzerland)의 ZEOprep 60 (60-200 μm)을 사용하였고, 기타 본 연구에 사용한 시약들은 reagent-grade를 사용하였다.
이 때, 사용한 solvent는 D2O이며, 정제된 HD-gal을 약 20 mg 1000 μl D2O에 녹여 NMR 시료로 사용하였다.
성능/효과
각 anomer 마다 12 개의 탄소가 존재하는데 이중 δC 68.6, 60.9 그리고 13.2 ppm에 보이는 3개의 탄소는 겹쳐서 나타나 총 24 개의 피크 중 21개가 나타났다(black dots in Fig. 2).
그래서 이 peak를 HD-gal의 protonated form 이라고 확인하였고, 재조합 대장균 β-gal에 의해 HD-gal이 합성되었음을 확인하였다.
2). 이로써, 본 물질에 HD-gal이 존재하고 있고, HD의 galactosylation이 되었다는 것을 확인 할 수 있다 (Fig. 2). 13C NMR (100 MHz, D2O) α-anomer; 103.
후속연구
이를 통하여, HD-gal 분자에 한 분자의 galactose가 어떻게 결합하고 있는지에 대한 실험적 증거를 제시하려고 하였다. 앞으로 이러한 결과를 근거로 피부에 대한 독성이 감소된 화장품용 방부제 개발의 과학적 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 생각되며, HD-gal에 대한 항균시험과 세포독성 실험 등을 추가로 실시할 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
1, 2-hexanediol은 주로 어디에 사용되고 있는가?
1, 2-hexanediol (HD)는 화장품에 방부제(살균/보존제)로 주로 사용되고 있으며, 사용 농도는 1-2% 정도 이다. 이러한 1, 2-alkanediol 계열의 화합물에서 alkyl chain의 길이가 길어질수록 독성이 높아지며, 몇 가지 1, 2-alkanediol을 혼합하여 사용하면, 피부에 대한 독성이 있는 것으로 알려져 있다[1-3].
galactose를 화장품 방부제에 결합시킨 합성물 CPN-gal과 PE-gal은 어떤 특성을 보이는가?
HD 뿐만 아니라, chlorphenesin (CPN)과 phenoxyethanol (PE) 같은 화장품에 쓰이는 방부제에도 galactose를 한분자 결합시켜서, chlorphenesin galactoside(CPN-gal)와 phenoxyethanol galactoside(PE-gal)를 같은 방법으로 이미 합성하였다[5, 6]. 합성된 CPN-gal과 PE-gal의 특성을 분석하여 보면, 원래 가지고 있던 CPN과 PE의 항균력에는 큰 변화가 없고, 피부세포에 대한 독성이 감소하는 긍정적인 결과를 얻었다[7, 8]. 이러한 결과는 transgalactosylation 반응에 의하여 만들어진 CPN-gal과 PE-gal 분자의 피부세포 독성이 galactose 결합에 의하여 감소되었다는 것을 보여주는 결과라 할 수 있다.
1, 2-alkanediol 화합물의 독성과 alkyl chain의 관계는?
1, 2-hexanediol (HD)는 화장품에 방부제(살균/보존제)로 주로 사용되고 있으며, 사용 농도는 1-2% 정도 이다. 이러한 1, 2-alkanediol 계열의 화합물에서 alkyl chain의 길이가 길어질수록 독성이 높아지며, 몇 가지 1, 2-alkanediol을 혼합하여 사용하면, 피부에 대한 독성이 있는 것으로 알려져 있다[1-3]. 본 연구팀에서는 보다 안전한 방부제 연구/개발을 위하여, HD 분자에 한분자의 galactose를 효소를 이용하여 결합시킨, 1, 2-hexanediol galactoside (HD-gal)를 만드는 연구를 진행하여왔다[4].
참고문헌 (17)
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