[논문]베타-갈락토시데이즈를 이용하여 합성된 Benzyl Alcohol Galactoside의 NMR Spectroscopy 및 Mass spectrometry

이향렬; 정경환

doi:10.12925/jkocs.2019.36.1.84

베타-갈락토시데이즈를 이용하여 합성된 Benzyl Alcohol Galactoside의 NMR Spectroscopy 및 Mass spectrometry
NMR Spectroscopy and Mass Spectrometry of Benzyl Alcohol Galactoside synthesized using β-Galactosidase 원문보기

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.36 no.1, 2019년, pp.84 - 89

이향렬 (한국교통대학교 생명공학과) , 정경환 (한국교통대학교 생명공학과)

초록
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대장균 효소 ${\beta}$-gal를 이용하여 합성된 BzO-gal의 분자구조를 NMR ($^1H$-와 $^{13}C$-)과 고성능 mass spectrometry를 이용하여 분석하였다. BzO-gal은 $^1H$ NMR에서 14개의 proton으로부터 12개의 피크를 나타내었다. 방향족 고리에서 오는 5개의 proton 피크와 벤질기의 $CH_2$에서 오는 2개의 proton 피크는 벤질알코올이 존재함을 나타낸다. 지방족 사슬 영역인 ${\delta}_H$ 4.32 ~ 3.46 ppm에서 나타나는 7개의 proton 피크로부터 단당류가 도입되었음을 확인할 수 있었다. $^{13}C$ NMR 스팩트럼에서 나타난 11개의 carbon 피크도 또한 벤질알코올에 단당이 도입되었음을 나타낸다. BzO-gal의 분자량을 확인하기 위하여 mass spectrometry 로 분석한 결과 m/z가 293.0994인 BzO-gal의 sodium adduct ion($[M+Na]^+$)을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 세포독성이 감소된 첨가물 개발을 기대하고 있으며, 추가적인 후속연구를 진행할 예정이다.

Abstract ▼ AI-Helper

To characterize the molecular structure of BzO-gal synthesized using Escherichia coli ${\beta}$-gal, NMR ($^1H$- and $^{13}C$-) spectroscopy and mass spectrometry of BzO-gal were conducted. $^1H$ NMR spectrum of BzO-gal showed multiple peaks corresponding to the galactosyl group, which is an evidence of galactosylation on BzOH. Five proton peaks around the aromatic region at ${\delta}_H$ 7.43 ~ 7.24 ppm and 2 peaks from ${\delta}_H$ 4.93 and 4.67 ppm were evidence of the presence of the benzyl group. Seven proton peaks at ${\delta}_H$ 4.32 ~ 3.46 ppm showed the presence of a monosaccharide and were indicative of galactosylation on BzOH. $^{13}C$ NMR spectrum also revealed the presence of 11 carbons suggestive of BzO-gal. The mass value (sodium adduct ion of BzO-gal, m/z = 293.0994) from mass spectrometry analysis of BzO-gal, and $^1H$ and $^{13}C$ NMR spectral data were in good agreement with the expecting structure of BzO-gal. We are expecting that through future study it will eventually be able to develop a new additive of low cytotoxicity.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. ¹H-NMR spectrum of BzO-gal.
그림 Fig. 3. Mass spectrum of BzO-gal using ESI-MS. Arrow indicates a peak of sodium adduct ion of BzO-gal ([M+Na]⁺). In addition, molecular structure of [M+Na]⁺ is shown beside the arrow.
그림 Fig. 2. ¹³C-NMR spectrum of BzO-gal.
그림 Fig. 4. Transgalactosylation reaction of BzOH using β-gal.

AI 본문요약
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문제 정의

그래서, 본 논문에서는 BzO-gal을 대장균 β -galactosidase (β-gal)를 이용하여 transgalactosylation 방법으로 합성하고 순수 분리한 후, BzO-gal 추정 물질에 대한 1 H- and 13 C-NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy, 그리고 mass spectrometry 연구를 수행한 결과에 대하여 논하려고 한다.
이러한 결과를 바탕으로 본 연구에서는 benzyl alcohol (BzOH) 분자에 galactose 한 분자를 결합시키는 연구를 실시하였다. BzOH는 현재 식품 산업, 화장품 산업, 그리고 제약 산업에서 착향제와 방부제로서 많이 사용되고 있으나, BzOH 사용 중 발생하는 독성 문제와 피부 알러지 문제가 몇몇 보고를 통하여 알려지고 있다[11-14].

제안 방법

400 MHz NMR Spectrometer (Bruker Ascend 400, Bruker, Germany)를 이용한 ¹H-NMR과 ¹³ C-NMR 분석을 하였다. 이때, 사용한 solvent는 CD ₃OD이며, 정제된 BzO-gal 추정 물질을 약 20 mg 1000 μl CD₃ OD에 녹여 NMR 시료로 사용하였다
선행연구와 같은 조건으로 EA 추출로 모아진 8 ml의 물 층을 silica gel chromatography에 loading 하여, 정제를 실시하였다 (이동상, EA : Methanol : DW = 17 : 2 : 1). BzO-gal로 추정되는 물질이 포함된 분획을 모아서 TLC 분석으로 확인한 후, rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축하였다. 자세한 조건과 방법은 선행연구에 상세히 기술하였다[16,17].
)를 사용하여 실시 하였다. Ionization source는 ESI (electrospray ionization)으로, analyze type은 time of flight (TOF)로 물질의 m/z (mass to charge ratio)를 확인하였다.
75 U/ml β-gal, 185mM BzOH를 녹인 후, shaking incubator (40℃, 100 rpm) 에서 48 시간 동안 반응시켜 BzO-gal을 합성하였다. 그리고, 9ml의 반응액과 9 ml ethyl acetate (EA)를 50 ml conical tube에 넣어 섞은 후, 물과 EA층 으로 분획하여 EA층으로 잔여 BzOH를 제거하고, 물 층으로 합성된 BzO-gal 추정 물질을 분획하였다. 이러한 분획은 총 3회 실시하였고, 나머지 반응액도 이러한 분획을 계속 실시하여 잔여 BzOH가 제거되고, BzO-gal 추정 물질이 모여있는 물 층 만을 모았다.
대장균 효소인 β-gal을 이용하여 BzO-gal을 합성하기 위하여 transgalactosylation 반응을 수행하였다.
대장균의 araBAD 프로모터 시스템에 의하여 발현이 조절되는 vector를 사용하여 대장균을 발현 숙주로 하여 재조합 β-gal 효소를 발현하였다.
이러한 분획은 총 3회 실시하였고, 나머지 반응액도 이러한 분획을 계속 실시하여 잔여 BzOH가 제거되고, BzO-gal 추정 물질이 모여있는 물 층 만을 모았다. 선행연구와 같은 조건으로 EA 추출로 모아진 8 ml의 물 층을 silica gel chromatography에 loading 하여, 정제를 실시하였다 (이동상, EA : Methanol : DW = 17 : 2 : 1). BzO-gal로 추정되는 물질이 포함된 분획을 모아서 TLC 분석으로 확인한 후, rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축하였다.
자세한 조건과 방법은 선행연구에 상세히 기술하였다[16,17]. 이 농축 물질이 BzO-gal 이라는 것을 확인하기 위하여 NMR spectroscopy와 mass spectrometry 분석을 실시하였다.
대장균 효소인 β-gal을 이용하여 BzO-gal을 합성하기 위하여 transgalactosylation 반응을 수행하였다. 이때, BzO-gal 합성 추정 물질을 정제한 후, NMR (¹H- and ¹³C-) spectroscopy와 mass spectrometry 분석을 실시하였다. 그 결과,BzOH의 hydroxyl group (-OH)에 galactose 한 분자를 결합된 BzO-gal의 분자구조와 질량을 확인할 수 있었다.
다양한 분야에 사용되는 화합물의 독성과 알러지 문제를 해결하기 위한 방법으로 galactose 한 분자를 화합물에 결합시켜서 galactoside 유도체를 합성하려는 시도가 있어왔다[1,2]. 이러한 반응에서 가수분해 효소를 이용하는 방법을 transgalactosylation (혹은 reverse hydrolysis) 이라고 하며, 그동안 본 연구팀에서는 이 방법을 이용하여 chlorphenesin (CPN) [3,4], 2-phenoxyethanol (PE) [5,6], 1, 2-hexanediol (HD) [7,8] 분자의 galactoside 유도체 합성을 시도하였다. 합성된 CPN, PE, 그리고 HD의 galactoside 유도체(CPN-gal, PE-gal, 그리고 HD-gal)를 인간 피부세포 (HaCaT cell)에 적용하였을 때, 세포에 대한 독성이 CPN, PE, 그리고 HD에 비하여 현저하게 감소되는 것을 관찰하였다[3,5,9].
그리고, 9ml의 반응액과 9 ml ethyl acetate (EA)를 50 ml conical tube에 넣어 섞은 후, 물과 EA층 으로 분획하여 EA층으로 잔여 BzOH를 제거하고, 물 층으로 합성된 BzO-gal 추정 물질을 분획하였다. 이러한 분획은 총 3회 실시하였고, 나머지 반응액도 이러한 분획을 계속 실시하여 잔여 BzOH가 제거되고, BzO-gal 추정 물질이 모여있는 물 층 만을 모았다. 선행연구와 같은 조건으로 EA 추출로 모아진 8 ml의 물 층을 silica gel chromatography에 loading 하여, 정제를 실시하였다 (이동상, EA : Methanol : DW = 17 : 2 : 1).
정제된 BzO-gal 추정 물질의 질량 분석은 고분해능 Q-TOF mass spectrometer(MicroQTOF III, Bruker Co.)를 사용하여 실시 하였다. Ionization source는 ESI (electrospray ionization)으로, analyze type은 time of flight (TOF)로 물질의 m/z (mass to charge ratio)를 확인하였다.

대상 데이터

Benzyl alcohol은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였고, TLC (thin-layer chromatography) plate는 MACHEREYNAGEL GmbH & Co. KG (Düren, Germany) 의 precoated plates SIL HD UV254(MN809222)를 사용하였다.
BzO-gal 정제를 위한 Silica gel은 Zeochem (Uetikon am See, Switzerland)의 ZEOprep 60 (60-200 μm)을 사용하였고, 기타 본 연구에 사용한 시약들은 reagent-grade를 사용하였다.

성능/효과

2). BzOH의 방향족 탄소로부터 4개의 피크와 벤질 옥시기의 CH₂ 1개의 피크, 그리고 당으로부터 6개의 피크가 dH 76.9~62.7 ppm 영역에서 나타나 이 물질의 구조는 BzOH에 한 개의 당이 치환된 배당체임을 확인할 수 있었다. ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 139.
이때, BzO-gal 합성 추정 물질을 정제한 후, NMR (¹H- and ¹³C-) spectroscopy와 mass spectrometry 분석을 실시하였다. 그 결과,BzOH의 hydroxyl group (-OH)에 galactose 한 분자를 결합된 BzO-gal의 분자구조와 질량을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 BzOH에서 BzO-gal이 합성되는 transgalactosylation 반응을 Fig.
그래서 이 peak를 BzO-gal의 sodium adduct ion 이라고 확인하였으며, 대장균 β-gal에 의해 transgalactosylation 반응에 의하여 BzO-gal이 합성되었음을 확인할 수 있었다.
당류에서 특징적으로 나타나는 영역인 δH 4.32, 3,84와 3.82~ 3.46 ppm에서 7개의 수소로부터 나타나는 피크 들이 나타나는 것으로 보아 이들이 BzOH에 갈락토즈와 같은 단당이 도입되었음을 확인할 수 있었다.
따라서 β–gal과 방향족 알코올과의 반응들은 대부분 입체특이성을 가지나 직쇄상의 지방족 알코올과의 반응성은 입체특이성이 상대적으로 적은 것으로 나타났다.
따라서 β–gal과 방향족 알코올과의 반응들은 대부분 입체특이성을 가지나 직쇄상의 지방족 알코올과의 반응성은 입체특이성이 상대적으로 적은 것으로 나타났다. 본 연구에서 사용한 방향족 알코올인 BzOH의 전환 생성물도 또한 오직 한 종류의 anomer만 특이적으로 관찰되어 모두 일치된 결과를 보이고 있다.
합성된 CPN, PE, 그리고 HD의 galactoside 유도체(CPN-gal, PE-gal, 그리고 HD-gal)를 인간 피부세포 (HaCaT cell)에 적용하였을 때, 세포에 대한 독성이 CPN, PE, 그리고 HD에 비하여 현저하게 감소되는 것을 관찰하였다[3,5,9]. 즉, 피부세포에 대한 독성이 galactose 한 분자 결합으로 감소되는 것을 확인 하였다. 또한, HD-gal의 경우에는 galactose 한 분자가 결합하면서 보습력이 증가하는 현상도 관찰되었다[10].

후속연구

앞으로 이러한 결과를 바탕으로 인간피부세포에 대한 독성 문제가 해결된 첨가물을 개발할 수 있을 것으로 기대되며, 이를 위하여 BzO-gal의 피부세포에 대한 독성 시험 그리고 항균시험 등을 계속 실시할 예정이다.

그래서, 본 논문에서는 BzO-gal을 대장균 β -galactosidase (β-gal)를 이용하여 transgalactosylation 방법으로 합성하고 순수 분리한 후, BzO-gal 추정 물질에 대한 ¹ H- and ¹³ C-NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy, 그리고 mass spectrometry 연구를 수행한 결과에 대하여 논하려고 한다. 이를 통하여, BzOH 분자의 -OH group에 한 분자의 galactose가 결합한 BzO-gal가 합성되었다는 실험적 증거를 제시하고, 이러한 결과를 근거로 독성이 감소된 BzO-gal 합성의 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	재조합 β-gal 효소를 생산하는 대장균을 만드는 방법은 무엇인가?	대장균의 araBAD 프로모터 시스템에 의하여 발현이 조절되는 vector를 사용하여 대장균을 발현 숙주로 하여 재조합 β-gal 효소를 발현하였 다. 재조합 대장균제작과 재조합 β-gal을 함유한 대장균의 배양방법 등에 대하여서도 선행연구에서 자세히 기록하였다[15].
	BzOH의 특징은 무엇인가?	이러한 결과를 바탕으로 본 연구에서는 benzyl alcohol (BzOH) 분자에 galactose 한 분자를 결합 시키는 연구를 실시하였다. BzOH는 현재 식품 산업, 화장품 산업, 그리고 제약 산업에서 착향제와 방부제로서 많이 사용되고 있으나, BzOH 사용 중 발생하는 독성 문제와 피부 알러지 문제가 몇몇 보고를 통하여 알려지고 있다[11-14]. 그래서, 본 논문에서는 BzO-gal을 대장균 β -galactosidase (β-gal)를 이용하여 transgalactosylation 방법으로 합성하고 순수 분리한 후, BzO-gal 추정 물질에 대한 1 H- and 13 C-NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy, 그리고 mass spectrometry 연구를 수행한 결과에 대하여 논하려고 한다.
	피부세포에 대한 독성이 galactose 한 분자 결합으로 감소되는 것을 확인할 수 있는 근거는 무엇인가?	이러한 반응에서 가수분해 효소를 이용하는 방법을 transgalactosylation (혹은 reverse hydrolysis) 이라고 하며, 그 동안 본 연구팀에서는 이 방법을 이용하여 chlorphenesin (CPN) [3,4], 2-phenoxyethanol (PE) [5,6], 1, 2-hexanediol (HD) [7,8] 분자의 galactoside 유도체 합성을 시도하였다. 합성된 CPN, PE, 그리고 HD의 galactoside 유도체(CPN-gal, PE-gal, 그리고 HD-gal)를 인간 피부세포 (HaCaT cell)에 적용 하였을 때, 세포에 대한 독성이 CPN, PE, 그리고 HD에 비하여 현저하게 감소되는 것을 관찰하 였다[3,5,9]. 즉, 피부세포에 대한 독성이 galactose 한 분자 결합으로 감소되는 것을 확인 하였다.

참고문헌 (18)

D. Melisi, A. Curcio, E. Luongo, E. Morelli, M. G. Rimoli, "D-Galactose as a vector for prodrug design", Curr. Top. Med. Chem., Vol,11, No.18, pp. 2288-2298, (2011).

상세보기
H. Devalapally, K. S. Rajan, R. R. Akkinepally, R. K. Devarakonda, "Safety, pharmacokinetics and biodistribution studies of a ${\beta}$ -galactoside prodrug of doxorubicin for improvement of tumor selective chemotherapy", Drug Dev. Ind. Pharm., Vol.34, No.8, pp. 789-795, (2008).

상세보기
S. E. Lee, T. M. Jo, H. Y. Lee, J. Lee, K. -H. Jung, " ${\beta}$ -Galactosidase-catalyzed synthesis of galactosyl chlorphenesin and its characterization", Appl. Biochem. Biotechnol., Vol.171, No.6, pp. 1299-1312, (2013).

상세보기
S. E. Lee, H. Y. Lee, K. -H. Jung, "Production of chlorphenesin galactoside by whole cells of ${\beta}$ -galactosidase-containing Escherichia coli", J. Microbiol. Biotechnol., vol.23, No.6, pp. 826-832, (2013).

원문보기 상세보기
K. -H. Jung, H. Y. Lee, "Escherichia coli ${\beta}$ -galactosidase-catalyzed synthesis of 2-phenoxyethanol galactoside and its characterization", Bioprocess Biosyst. Eng., Vol.38, No.2, pp. 365-372, (2015).

상세보기
H. Y. Lee, K. -H. Jung, "Enzymatic synthesis of 2-phenoxyethanol galactoside by whole cells of ${\beta}$ -galactosidase-containing Escherichia coli", J. Microbiol. Biotechnol., Vol.24, No.9, pp. 1254-1259, (2014).

원문보기 상세보기
Y. -O. Kim, K. -H. Jung, "Enzymatic synthesis of 1, 2-hexandiol galactoside by whole cells of ${\beta}$ -galactosidase-containing recombinant Escherichia coli", J. Life Sci., Vol.26, No.5, pp. 608-613, (2016).

원문보기 상세보기
Y. -O Kim, H. Y. Lee, K. -H. Jung, "NMR spectroscopy and mass spectrometry of 1, 2-hexanediol galactoside synthesized using Escherichia coli ${\beta}$ -galactosidase", J. Korean Oil Chemists' Soc., Vol.33, No.2, pp. 286-292, (2016).

원문보기 상세보기
J. -S. Kim, K. -H. Jung, "Cytotoxic effects of 1, 2-hexanediol and 1, 2-hexanediol galactoside on HaCaT cell", J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, Vol.44, No.3, pp. 343-347, (2018).
Y. -O. Kim, K. -H. Jung, "Water-holding capacity and antimicrobial activity of 1, 2-hexanediol galactoside synthesized by ${\beta}$ -galactosidase", J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, Vol.43, No.4, pp. 373-379, (2017).
S. Sestini, M. Mori, S. Francalanci, "Allergic contact dermatitis from benzyl alcohol in multiple medicaments", Contact Dermatitis, Vol.50, No.5, pp. 316-317, (2004).

상세보기
M. Corazza, L. Mantovani, C. Maranini, A. Virgli, "Allergic contact dermatitis from benzyl alcohol", Contact Dermatitis, Vol.34, No.1, pp. 74-75, (1996).

상세보기
E. J. Curry, E. M. Warshaw, "Benzyl alcohol allergy: Importance of patch testing with personal products", Dermatitis, Vol.16, No.4, pp. 203-208, (2005).

상세보기
E. Shmunes, "Allergic dermatitis to benzyl alcohol in an injectable solution", Arch. Dermatol., Vol.120, No.9, pp. 1200-1201, (1984).

상세보기
K. -H. Jung, "Enhanced enzyme activities of inclusion bodies of recombinant ${\beta}$ -galactosidase via the addition of inducer analog after L-arabinose induction in the araBAD promoter system of Escherichia coli", J. Microbiol. Biotechnol., Vol.18, No.3, pp. 434-442, (2008).
K. -H. Jung, "Purifications of phenoxyethanol galactoside and chlorphenesin galactoside using solvent extraction followed by gel chromatography", J. Oil & Applied Science, Vol.34, No.4, pp. 954-961, (2017).
Y. -O. Kim, K. -H. Jung, " ${\beta}$ -Galactosidase-catalyzed synthesis of 1, 2-hexanediol galactoside and its purification using ethyl acetate extraction followed by silica gel chromatography", J. Korean Oil Chemists' Soc., Vol.33 No.3, pp. 498-506, (2016).

원문보기 상세보기
D. O. Otieno, "Synthesis of ${\beta}$ -Galactooligosaccharides from lactose using microbial ${\beta}$ -galactosidases", Compr. Rev. Food Sci. Food Saf., Vol.9, pp. 410-482, (2010).

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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