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문제 정의
- 이에 본 저자는 비만의 병기 중 하나인 어혈을 제거하는 沒 藥의 효능에 착안하여 지방 전구 세포인 3T3-L1 세포를 이용하여 비만 유발 인자, 유전자 발현량 및 Oil red-O 염색 등을 통한 항비만 효능을 확인하였으며, 유의적인 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이와 같은 결과는 앞선 3T3-L1 세포 실험결과와 부합되는 결과가 도출되어 沒藥이 in-vitro 실험에서 항비만에 효능이 있음을 증명함에 따라 추후 전임상 단계인 in-vivo 실험을 통해 효능을 검증하고자 한다.
제안 방법
- 사용된 primer는 아래와 같다(Table 1). 1% agarose gel에 전기영동 후 유전자발현의 여부를 UV로 촬영하여 각 그룹별로 band를 확인하고, RNA 발현을 나타내었다.
- 세포의 밀도가 80%이 된 것을 확인 후 DM으로 교체하여 몰약 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하고 2일간 배양하였다. PBS로 세척한 후 DMM으로 교체하여 몰약 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하였으며, 2일 간격으로 DMM과 몰약 추출물을 교체하여 7일 동안 배양하였다. 배양 후 free fatty acid (FFA) reagent A solution 100 ㎕를 넣고 37℃에서 10분 동안 반응 후 FFA reagent B solution 50 ㎕를 넣고 다시 37℃에서 10분 동안 반응하였다.
- 역전사 반응은 추출한 RNA를 RT premix kit의 mixture를 사용하여 first-strand cDNA를 합성하였으며 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다. RT-PCRe DNA polymerase 1U/tube에 250 mM dNTPs mix, RT buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 30 mM KCl, 1.5 mM MHCl2)를 포함한 mixture에 각 샘플과 primer를 넣고 PCR을 시행하였다. 사용된 primer는 아래와 같다(Table 1).
- 24시간 동안 배양하였다. 몰약 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 WST solution을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 450㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시 하였다.
- 몰약 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 WST solution을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 450㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시 하였다.
- PBS로 세척한 후 DMM으로 교체하여 몰약 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하였으며, 2일 간격으로 DMM과 몰약 추출물을 교체하여 7일 동안 배양하였다. 배양 후 ACC detection kit을 이용하여 ACC를 측정하였으며, ACC의 양은 대조군의 값에 대한 백분율로 나타내었다.
- 본 연구에서는 沒藥의 다양한 효능을 객관적으로 검증하기 위하여 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 이용하여 세포 독성 및 Triglyceride, 지방세포 분화에 관련된 전사인자, fatty acid, acetyl-CoA carboxylase 생성량에 대한 연구를 진행한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 계대배양 횟수는 5회 이상으로 하였고, 시료들을 처리하기 전에 24시간을 적응시켰다. 세포 분화는 3T3-L1 세포의 밀도가 80%가 된 것을 확인 후 differentiation media (DM, 10% FBS, 10 ㎍/㎖ insulin, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM IBMX)으로 교체 하여 몰약 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하고 2일간 배양하였다. 이후 Differentiation maintain media (DMM, 10% FBS, 10 ㎍/㎖ insulin)으로 교체하고 몰약 추출물을 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하였으며, 2일 간격으로 DMM과 몰약 추출물을 교체하여 7일 동안 배양하였다.
- 동결된 3T3-L1 세포를 해동시킨 후 50 ㎖ 튜브에 옮기고, PBS 9 ㎖을 넣어 세포를 부유시킨 뒤 1, 200 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 제거하였다. 세포가 있는 튜브에 10% bovine calf serum (BSA)와 1% penicillin으로 조성된 DMEM 배지 1 ㎖을 넣어 부유시켰다. 100 ㎜ dish에 9 ㎖의 배지를 넣고, 부유시킨 세포 1 ㎖을 넣어 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.
- 3T3-L1 세포를 96 well plate에 104 cells/well로 분주하여 2일간 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 세포의 밀도가 80%이 된 것을 확인 후 DM으로 교체하여 몰약 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하고 2일간 배양하였다. PBS로 세척한 후 DMM으로 교체하여 몰약 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하였으며, 2일 간격으로 DMM과 몰약 추출물을 교체하여 7일 동안 배양하였다.
- 실험종료 후 분리한 비장조직을 동결시킨 뒤 total RNA prep kit을 이용하여 RNA를 추출하였다. 역전사 반응은 추출한 RNA를 RT premix kit의 mixture를 사용하여 first-strand cDNA를 합성하였으며 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다.
- kit을 이용하여 RNA를 추출하였다. 역전사 반응은 추출한 RNA를 RT premix kit의 mixture를 사용하여 first-strand cDNA를 합성하였으며 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다. RT-PCRe DNA polymerase 1U/tube에 250 mM dNTPs mix, RT buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.
- 고정액을 제거하고 증류수로 세척한 후 Oil red O 염색약을 넣고 2시간 동안 염색하였다. 염색 후 증류수로 세척하고, 염색된 세포를 현미경을 이용하여 관찰하였다.
- 5 mM IBMX)으로 교체 하여 몰약 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하고 2일간 배양하였다. 이후 Differentiation maintain media (DMM, 10% FBS, 10 ㎍/㎖ insulin)으로 교체하고 몰약 추출물을 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하였으며, 2일 간격으로 DMM과 몰약 추출물을 교체하여 7일 동안 배양하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 dexamethasone, IBMX, insulin 및 FBS에 의해 다양한 전사인자들이 유도되면서 지방세포로 분화되는데, 이러한 지방세포의 분화에는 peroxisome preliferator activated receptor (PPAR) δ, sterol regulatory element blindingprotein (SREBP)1c 등의 전사인자들이 작용하면서 진행된다. 이때, 분화된 지방세포 내의 지방구 (lipid droplet)는 지질대사 및 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다47, 48).
- 본 연구에 사용한 沒藥 (Myrrh)은 ㈜옴니허브에서 구입하였고 대전대학교 TBRC-RIC에서 정선 후 사용하였다. 沒藥 100 g에 80% 에탄올 1,000 ㎖을 넣고 2시간 동안 환류 추출 후 여과액을 얻어 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하였다.
- 사용된 시약은 gel red (Sigma Co., U.S.A.), Oil red O (Sigma Co., U.S.A.), dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS : Welgene, Korea), bovine calf serum (BCS : Gibco BRL Co., U.S.A.), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), 우 태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS, Invitrogen Co., U.S.A.), lipopolysaccharide (LPS : Sigma Co., U.S.A.), cell viability assay kit (Daeillab sevice, Korea), dimethyl sulfoxide (DMSO : Sigma Co., U.S.A.), penicillin (Hyclone, Co., U.S.A.), streptomycin (Hyclone Co., U.S.A.), agarose (FMC Co., U.S.A.), total RNA prep kit (Intronbio., Korea), Fatty acid detection kit (Genbio Co., U.S.A.), ACC detection kit (Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 기기는 rotary vacuum evaporator (Büchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench (Vision scientific Co., Korea), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), thermocycler system (MWG Biotech Co., Germany), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.) 등을 사용하였다.
- 실험에 사용된 3T3-L1 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 동결된 3T3-L1 세포를 해동시킨 후 50 ㎖ 튜브에 옮기고, PBS 9 ㎖을 넣어 세포를 부유시킨 뒤 1, 200 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 제거하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 얻어진 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 평균값 사이에 대한 유의성은 SPSS 11.0의 unpaired student's t-test를 사용하여 p<0.001, p<0.01 및 p<0.05의 신뢰수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- The cells were treated with 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ and 100 µg/㎖ of Myrrh for 24hr. Cell viability was measured using an MTT assay. The results were expressed as mean ± S.
- 몰약 추출물이 3T3-L1 세포의 분화를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 분화된 3T3-L1 세포에서 형성되는 중성지방을 특이적으로 염색하는 Oil red O 염색법을 시행하였다. 배양된 세포의 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후 10% formalin용액을 넣은 뒤 1시간 동안 고정 시켰다.
성능/효과
- 1. 대조군에 비해 몰약 추출물은 98% 이상의 세포 생존율을 나타내었다.
- 2. 대조군에 비해 몰약 추출물은 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 Triglyceride 생성을 유의성 있게 감소시켰다.
- 3. 대조군에 비해 몰약 추출물은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 지방세포 분화에 관련된 전사인자 생성을 감소 시켰다.
- 4. 대조군에 비해 몰약 추출물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 fatty acid 생성을 유의성 있게 감소 시켰다.
- 5. 대조군에 비해 몰약 추출물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 Acetyl-CoA carboxylase 생성을 유의성 있게 감소시켰다.
- Oil red-O 염색에 의한 몰약 추출물이 세포 내 지방구 함량에 미치는 영향을 확인한 결과, 대조군과 비교하였을 때, 몰약 추출물을 처리한 군에서 농도 의존적으로 지방구가 감소하는 것을 육안으로 확인할 수 있었다(Fig. 6).
- 대조군은 149.1±7.3 μM 생성을 나타낸 반면, 몰약 추출물 1 ㎍/㎖ 농도 처리군은 141.1±6.4 μM, 10 ㎍/㎖ 농도 처리 군은 137.7±5.8 μM, 100 ㎍/㎖ 농도 처리군은 130.1± 3.4 μM (* : p<0.05)로 감소하여, 100 ㎍/㎖ 농도에서만 유의성 있는 결과가 나타났다(Fig. 4).
- 대조군을 100.0±1.6%로 하였을 때, 몰약 추출물 1 ㎍/㎖ 농도 처리군은 87.9±1.4% (* : p<0.05), 10 ㎍/㎖ 농도 처리 군은 81.5±4.8% (** : p<0.01), 100 ㎍/㎖ 농도 처리 군은 78.8±2.7% (** : p<0.01)로 감소하여, 농도 의존적으로 유의성 있는 결과가 나타났다(Fig. 2).
- 대조군을 100.0±3.1%로 하였을 때, 몰약 추출물 1 ㎍/㎖ 농도 처리군은 95.8±3.0%, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군은 87.4± 2.5%, 100 ㎍/㎖ 농도 처리군은 79.0±5.6% (* : p<0.05)로 감소하여, 100 ㎍/㎖ 농도에서만 유의성 있는 결과가 나타났다(Fig. 5).
- 대조군을 100.0±5.9%로 하였을 때, 몰약 추출물 1 ㎍/㎖ 농도 처리군은 98.1±4.6%, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군은 99.2± 4.4%, 100 ㎍/㎖ 농도 처리군은 99.5±6.9%로 나타나, 모든 농도에서 세포 독성이 나타나지 않았다(Fig. 1).
- 이러한 이유로 ACC의 억제는 대사성 질환과 관련된 비만, 당뇨 등의 유효한 약제 개발을 위한 비만 지표로 유용하게 활용되고 있다59). 본 연구결과 3T3-L1 지방 전구세포에서 沒藥은 독성이 나타나지 않았으며, 100 ㎍/㎖의 농도에서 TG 생성과 지방세포 분화에 관련된 전사인자 발현량, fatty acid와 ACC를 감소 시켰다.
- 이상의 결과들로 보아 沒藥 에탄올 추출물은 안전하고 항비만 효능이 있음이 실험적으로 규명되었다. 이와 같은 유의적인 결과는 폭넓은 질환에 대한 신규 치료제 개발에 기초적 자료를 제공할 수 있을 것으로 보이며, 한의학적 관점에서는 객관적 규명을 통한 EBM 구축에 일조할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이와 같이 沒藥이 비만 유관 인자에 효능을 보임에 따라 지방의 분화를 얼마나 억제하는지를 확인하기 위하여 화합물을 3T3-L1 세포에 처리한 후 지방만을 붉은색으로 염색하는 oil red-O 염색을 시행한 결과, 대조군에 비하여 농도 의존적으로 지방구가 감소하는 것을 육안으로 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 앞선 3T3-L1 세포 실험결과와 부합되는 결과가 도출되어 沒藥이 in-vitro 실험에서 항비만에 효능이 있음을 증명함에 따라 추후 전임상 단계인 in-vivo 실험을 통해 효능을 검증하고자 한다.
- 지방세포 분화와 관련된 전사인자인 C/EBPβ, C/EBPα, PPARγ, SREBP1c, aP2, fas의 유전자 발현량을 측정한 결과, 몰약 추출물 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 모두 현저한 감소가 나타났다(Fig. 3).
후속연구
- 위의 결과를 종합해 보면, 沒藥은 지방전구세포의 독성 평가를 통해 안전한 것으로 확인되었으며, 비만 유발 인자 및 유전자 발현량의 감소 효과가 객관적으로 확인되어 비만에 대한 효과적인 한약재로서의 가능성을 제시해 주고 있으며 향후 임상에서 임상 활용 제고와 더불어 보다 효과적인 비만 치료제 개발을 위한 기초적 자료로써 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 효능이 있음이 실험적으로 규명되었다. 이와 같은 유의적인 결과는 폭넓은 질환에 대한 신규 치료제 개발에 기초적 자료를 제공할 수 있을 것으로 보이며, 한의학적 관점에서는 객관적 규명을 통한 EBM 구축에 일조할 수 있을 것으로 사료된다. 본 연구는 산업통상자원부 지정 대전대학교 난치성 면역질환의 동서생명 의학연구 지역혁신 센터의 지원에 의한 것입니다.
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