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문제 정의
- 에서 항산화 능과 면역조절 작용에 의한 AD 염증 개선 효과 및 항균 효과가 in-vitro 실험을 통해 객관적으로 효능이 입증된 처방이다. 따라서 본 실험에서는 in-vivo 실험을 통해 외치제로써 AD 개선 효과를 실험적으로 입증하여 임상에서의 활용성을 제고하고자 AD 병태 동물모델인 NC/Nga 생쥐에 도포한 후 육안적, 혈액학적, 유전자 발현량 및 조직학적 변화를 관찰하였다.
- 본 연구에서는 DNCB로 유발한 아토피피부염 생쥐에게 한 약재로 조성된 아토탕(Ato)의 항아 토피 피부염 효과를 객관적으로 검증하기 위해 동물 병태 모델에서 피부염 지수 평가, 혈청 내 사이토카인 및 비장에서의 mRNA 발현량, 혈청 내면 역글로불린, 조직학적 변화에 미치는 영향을 확인한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서는 아토탕을 AD 병태 모델인 NC/Nga 생쥐에 게 4주간 도포하여 혈청 내 사이토카인 및 면역글로불린 측정, 비장조직에서의 유전자 발현, 조직변화 등의 연구를 통해 AD에 유용한 외치제로써의 치료 효과를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 사용된 primer는 아래와 같다(Table 2). 1% agarose gel에 전기영동 후 유전자 발현의 여부를 UV로 촬영하여 각 그룹별로 band를 확인하고, RNA 발현을 나타내었다.
- AD 병태 모델을 제작하기 위해 6주령이 된 NC/Nga 생쥐의 NC/Nga 마우스의 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모하고 24시간 방치 후 1 %의 DNCB(dinitrochlorobenzene) 용액(아세톤․올리브오일 = 3 : 1) 200 ㎕를 제모 부위에 도포하고, 3일 후 2차 도포하였다. 1차 도포 후 7일째부터는 1주 일에 3회씩 0.4 % DNCB 용액 150 ㎕를 2주간 도포하여 유발하였다. 이때, 유발이 되지 않은 동물은 안락사를 진행하였다.
- AD 병태 모델을 제작하기 위해 6주령이 된 NC/Nga 생쥐의 NC/Nga 마우스의 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모하고 24시간 방치 후 1 %의 DNCB(dinitrochlorobenzene) 용액(아세톤․올리브오일 = 3 : 1) 200 ㎕를 제모 부위에 도포하고, 3일 후 2차 도포하였다. 1차 도포 후 7일째부터는 1주 일에 3회씩 0.
- DNCB 용액처리 후 9주령, 11주령, 13주령 때에 임상적 육안 평가법으로 관능 평가를 실시하였다. 평가 항목은 홍반 (Erythema), 가려움과 건조 피부(Pruritus & Dry skin), 부종과 혈종(Edema & Hematoma), 짓무름 (Excoriation), 태 선화(Lichenification) 등으로 5가지이다.
- 역전사 반응은 추출한 RNA를 RT premix kit의 mixture를 사용하여 first-strand cDNA를 합성하였으며 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다. RT-PCRe DNA polymerase 1U/tube에 250 mM dNTPs mix, RT buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 30 mM KCl, 1.5 mM MHCl2)를 포함한 mixture에 각 샘플과 primer를 넣고 PCR을 시행하였다. 사용된 primer는 아래와 같다(Table 2).
- 실험 종료 후 ether로 마취한 상태에서 심장 천자법을 이용하여 채혈한 다음 3, 000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 가지고 IL-4, IL-5, IL-13을 custom-made 6-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 Luminex로 측정하였으며, IgE 생성량의 측정은 ELISA kit를 이용하여 ELISA reader 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 실험 그룹은 AD를 유발시키지 않은 정상군, 증류수를 도포하는 대조군, dexamethasone (이하, Dexa)를 도포하는 양성대조군과 아토탕(이하, Ato)을 도포하는 실험군 등 총 4개의 그룹으로 각 6마리씩 나누어 매일 오후 2시에 실험을 실시하였다.
- 실험종료 후 분리한 비장조직을 동결시킨 뒤 total RNA prep kit을 이용하여 RNA를 추출하였다. 역전사 반응은 추출한 RNA를 RT premix kit의 mixture를 사용하여 first-strand cDNA를 합성하였으며 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다.
- 실험종료 후 분리한 비장조직을 동결시킨 뒤 total RNA prep kit을 이용하여 RNA를 추출하였다. 역전사 반응은 추출한 RNA를 RT premix kit의 mixture를 사용하여 first-strand cDNA를 합성하였으며 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다. RT-PCRe DNA polymerase 1U/tube에 250 mM dNTPs mix, RT buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.
- 4 % DNCB 용액 150 ㎕를 2주간 도포하여 유발하였다. 이때, 유발이 되지 않은 동물은 안락사를 진행하였다.
- 조직의 탈수를 위해 60%에서부터 100% 알코올에 이르기까지 농도 상승 순으로 탈수하고, xylene에 투명과정을 거친 다음 파라핀 블럭을 제작하였다. 제작된 블 럭은 박편절단기 (microtome)를 이용해 3~4 ㎛ 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 다음 hematoxyline과 eosin(H&E) 염색을 실시하여 광학 현미 경상에서 관찰 및 사진 촬영 하였다.
- 배부의 피부를 떼어내어 각 실험군 별로 적출한 조직은 10% 중성 포르말린에 48시간 고정하여 고정이 완료된 조직들을 흐르는 수돗물에서 12시간 수세한 뒤 조직 내의 고정액을 완전 제거하였다. 조직의 탈수를 위해 60%에서부터 100% 알코올에 이르기까지 농도 상승 순으로 탈수하고, xylene에 투명과정을 거친 다음 파라핀 블럭을 제작하였다. 제작된 블 럭은 박편절단기 (microtome)를 이용해 3~4 ㎛ 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 다음 hematoxyline과 eosin(H&E) 염색을 실시하여 광학 현미 경상에서 관찰 및 사진 촬영 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 아토탕의 구성 약재들은 ㈜옴니허브에서 구입하였고, 대전대학교 TBRC-RIC에서 정선 후 사용하였고, 그 내용과 분량(1첩)은 다음과 같다(Table 1).
- 사용된 시약은 mouse cytokine milliplex map immuno- assay kit(Millipore Co., U.S.A.), mouse IgE ELISA kit (eBioscience CO., USA), total RNA prep kit(Intronbio., Korea)을 사용하였으며, 기기는 rotary vacuum evaporator (Büchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer(EYELA FDU- 540 Co., Japan), ELISA reader(Molecular Devices Co., U.S.A.), PCR machine(Thermal Dynamic., U.S.A) 등을 사용하였다.
- 실험동물인 수컷 4주령의 NC/Nga Mice(16∼22g)는 ㈜라온바이오에서 공급받아 실험 당일까지 고형사료(Altromin CO., Germany)와 물을 충분히 공급하고 온도 22 ± 2℃, 습도 55 ± 15%, 12시간-12시간(light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 본 실험은 대전 대학교 동물실험윤리 위원회의 승인(동물사용 윤리위원회 승인 번호–DJUARB 2016-018)을 받아 동물윤리준칙에 의거 하여 실험하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 실험 결과는 SPSS 17.0의 unpaired student's T-test를 사용하여 통계처리 하였으며 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 1. 아토탕 도포군은 대조군에 비해 홍반, 부종 등의 피부 개선이 빠르게 진행되었으며, 피부염 지수 역시 감소 시 켰다.
- 2. 아토탕 도포군은 대조군에 비해 혈청 내 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-13 생성을 감소시켰으며, IL-4와 IL-13에서 유의성이 나타났다.
- 3. 아토탕 도포군은 대조군에 비하여 비장 조직에서의 IL-4, IL-5, IL-13 유전자 발현을 감소시켰다.
- 4. 아토탕 도포군은 대조군에 비하여 IgE 생성을 감소시켰으며, 유의성이 나타났다.
- 5. 아토탕 도포군은 대조군에 비하여 비만 세포가 피부로 침윤되는 것을 억제하였으며, epidermis와 dermis의 두께도 대조군에 비하여 감소시켰다.
- 등 조직 변화를 확인한 결과, 대조군은 정상군에 비하여 피부가 두꺼워졌고 세포의 침윤으로 인한 세포의 밀도가 높게 나타난 반면, 아토탕 도포군은 대조군에 비하여 피부의 두께가 약 1/4 정도 줄었으며, 세포 침윤으로 인한 세포의 밀도 또한 낮아짐을 보였다(Fig. 3).
- 9 pg/㎖로 나타났다. 또한, IL-13은 대조군이 38.7±4.7 pg/㎖로 나타난 반면, 아토탕 도포군은 25.6±5.1 pg/㎖로 나타나 사이토카인 결과가 대조군에 비해 감소하였고 IL-4와 IL-13에서 유의성(* : p<0.01)이 나타났다(Fig. 4).
- 본 연구에서 피부 개선 효능을 확인하기 위해 NC/Nga 생쥐에 DNCB를 3주간 도포하여 유발한 후 4주간 아토탕을 도포한 결과, 아토탕은 대조군에 비해 홍반, 부종 등에 대한 회복속도가 빠른 것을 확인하였으며 피부염 지수 역시 대조군에 비해 감소함으로써 아토 탕이 AD 증상 완화 및 피부개선 효과가 있음을 확인되었다. 또한, 조직학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 H&E 염색을 실시한 결과, 대조군은 등 조직을 촬영한 결과 피부가 두꺼워졌고, 세포의 침윤으로 인한 세포의 밀도가 높게 나타난 반면, 아토탕 도포군은 피부의 두께가 약 1/4 정도 줄었으며, 세포 침윤으로 인한 세포의 밀도 또한 낮아짐을 보였다.
- 림프절은 국소 조직으로부터 유입되는 항원을 포획하는데 전문화되어 있는 반면, 비장은 혈액을 여 과하기 때문에 이 과정에 혈액 내 항원을 포획하는데 전문화되어 있다고 할 수 있다20-22). 본 실험에서는 비장 조직에서 유전자 발현량을 측정한 결과, 아토탕 도포군은 IL-4, IL-5 및 IL-13의 유전자 발현량이 대조군에 비해 감소를 나타내었다. 이와 같은 결과는 혈청 내 사이토카인 결과와 부합됨으로써 아토탕이 Th2 사이토카인의 감소시키는 결과를 더욱 뒷받침해 주고 있다.
- 따라서 AD 치료제의 소양감 조절 작용은 중요하며 홍반, 부종 등의 빠른 수복과 가려움증을 개선시킴으로 증상 완화 등의 치료적 효과를 기대해 볼 수 있다. 본 연구에서 피부 개선 효능을 확인하기 위해 NC/Nga 생쥐에 DNCB를 3주간 도포하여 유발한 후 4주간 아토탕을 도포한 결과, 아토탕은 대조군에 비해 홍반, 부종 등에 대한 회복속도가 빠른 것을 확인하였으며 피부염 지수 역시 대조군에 비해 감소함으로써 아토 탕이 AD 증상 완화 및 피부개선 효과가 있음을 확인되었다. 또한, 조직학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 H&E 염색을 실시한 결과, 대조군은 등 조직을 촬영한 결과 피부가 두꺼워졌고, 세포의 침윤으로 인한 세포의 밀도가 높게 나타난 반면, 아토탕 도포군은 피부의 두께가 약 1/4 정도 줄었으며, 세포 침윤으로 인한 세포의 밀도 또한 낮아짐을 보였다.
- IgE 발현의 증가는 호산구를 포함하는 과립구 및 비만 세포 등의 면역세포를 피부로 침윤 시켜 AD를 더욱 심화시킨다. 본 연구에서 혈청 내 사이토카인과 IgE 생성량을 확인한 결과, 아토탕 도포군은 대조군에 비해 IL-4, IL-13 및 IgE 생성량을 유의성 있게 감소 시켜 AD의 발병에 있어 중요한 인자로 알려진 사이토카인 및 IgE 생성량 감소는 아토탕이 AD의 효과적인 외치제로써 활용될 수 있음을 시사하고 있다.
- 비장 조직에서 유전자 발현량을 측정한 결과, IL-4는 대조군이 100.0±6.1%로 나타난 반면, 아토탕 도포군은 74.2±4.0%로 나타났으며, IL-5는 대조군이 100.0±5.7%로 나타난 반면, 아토탕 도포군은 80.4±6.6%로 나타났다. 또한, IL-13은 대조군이 100.
- 위와 같은 결과를 종합해 보면 아토탕은 AD 병태 모델인 NC/Nga 생쥐에서 피부염 지수, 사이토카인, 면역글로불린, 비장 조직의 mRNA의 발현 및 조직학적 변화 등에서 AD의 원인인 Th2 사이토카인의 과발현을 억제하고 IgE 생성을 감소시킴에 따라 피부개선 및 면역세포의 침윤을 막아 AD의 병리적 진행을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 아토탕이 내치법 적용이 어렵거나 거부감이 존재하는 환자에게 안전하고 효과적이며 활용성이 높은 외치제로 사용될 것으로 사료된다.
- 이상의 결과들로 보아 아토탕이 외치제로써 아토피피부염에 대한 개선 효능이 실험적으로 규명되었다. 보다 구체적인 치료 기전은 향후보다 심도 있는 연구를 통하여 보완되어야 할 것으로 보이나 이 같은 전임상 단계의 결과는 임상 활용 제고와 더불어 향후 보다 유의성 있는 치료제 개발을 위한 기초적 자료로써 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이와 같은 결과는 피부염 지수에 반영되어 나타났다. 피부염 지수는 AD를 유발한 후 9주차부터 13주 차까지 2주 간격으로 사진 촬영을 한 후에 피부염의 심화 정도를 관능적 방법에 의하여 측정한 결과로, 대조군은 9주 차에서 12.2±0.3, 11주 차에서 11.1± 0.4, 13주차에서 9.9±0.3의 결과가 나타난 반면, 아토탕 도 포군은 9주 차에서 12.7±0.3, 11주 차에서 8.4±0.1, 13주 차 에서 6.2±0.2으로 나타나 대조군에 비해 감소하였다(Fig. 2).
- 피부염 지수를 확인한 결과, Fig. 1은 9주, 11주, 13주의 피부염 유발 정도와 개선 정도를 나타내주는 사진으로 아토탕 도포 군에서는 양성대조군에 비해 태선화 증상이 남아있기는 했으나 대조군에 비해 회복이 빠르고 홍반, 부종 등의 증상이 현저하게 떨어졌음을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 이와 같은 결과는 피부염 지수에 반영되어 나타났다.
- 혈청 내 IgE를 측정한 결과, 대조군을 100.0±1.0%로 나 타냈을 때 아토탕 도포군은 83.9±2.1%로 나타나 대조군에 비해 유의성(* : p<0.05)이 나타났다(Fig. 6).
- 혈청 내 사이토카인을 측정한 결과, IL-4는 대조군이 22.2±2.4 pg/㎖로 나타난 반면, 아토탕 도포군은 7.2±2.0 pg/㎖로 나타났으며, IL-5는 대조군이 11.1±1.4 pg/㎖로 나타난 반면, 아토탕 도포군은 6.9±1.9 pg/㎖로 나타났다. 또한, IL-13은 대조군이 38.
후속연구
- 이상의 결과들로 보아 아토탕이 외치제로써 아토피피부염에 대한 개선 효능이 실험적으로 규명되었다. 보다 구체적인 치료 기전은 향후보다 심도 있는 연구를 통하여 보완되어야 할 것으로 보이나 이 같은 전임상 단계의 결과는 임상 활용 제고와 더불어 향후 보다 유의성 있는 치료제 개발을 위한 기초적 자료로써 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 위와 같은 결과를 종합해 보면 아토탕은 AD 병태 모델인 NC/Nga 생쥐에서 피부염 지수, 사이토카인, 면역글로불린, 비장 조직의 mRNA의 발현 및 조직학적 변화 등에서 AD의 원인인 Th2 사이토카인의 과발현을 억제하고 IgE 생성을 감소시킴에 따라 피부개선 및 면역세포의 침윤을 막아 AD의 병리적 진행을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 아토탕이 내치법 적용이 어렵거나 거부감이 존재하는 환자에게 안전하고 효과적이며 활용성이 높은 외치제로 사용될 것으로 사료된다.
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