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문제 정의
- 따라서 본 연구는 흑마늘의 고부가가치 상품을 개발하기 위해 전통 발효식품, 과일 및 막걸리에서 Saccharomyces cer- evisiae 균주를 분리하여 최적 발효 조건을 탐색하고 흑마늘 와인을 제조하였으며 DPPH radical, ABTS radical, super ox- ide radical 및 환원력 등을 분석하여 흑마늘 와인의 항산화 활성과 기능성 성분을 조사하여 보고하고자 한다.
제안 방법
- 7 g/l, glucose 1 g/l, rutin 2 g/l, agar 20 g/l) 배지를 제조하여 효모를 접종하고 28℃에서 72시간 배양 후투명환의 생성 유무를 관찰하였으며, protease 활성은 YM 배지(yeast extract 3 g/l, malt extract 3 g/l, peptone 5 g/l, glu- cose 10 g/l, agar 15 g/l)에 skim milk 농도가 1% (w/v)가 되도록 첨가하여 제조하고 효모를 접종하여 28℃에서 48시간 배양한 후 투명환의 생성 유무에 따라 평가하였다[1]. Amino acid decarboxylase는 YPD 고체배지에 아미노산 10 g/l (histidine, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, lysine, leu- cine), bromocresol purple 6 mg/l를 첨가하고 0.1 N NaOH를 이용하여 pH 5.3으로 조정한 다음 효모를 접종한 후 28℃에서 120시간 배양한 뒤 보라색 환의 형성 여부를 조사함으로써 확인하였다[1].
- [19]의 방법을 따라 esculin 5 g/l(w/v)와 1% ferric ammonium citrate가 2% (v/v)가 첨가된 YPD 배지(yeast extract 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 20 g/l, agar 15 g/l)에 접종하고 28℃에서 48시간 배양 후 주변에 검은색 환의 생성 여부로 확인하였다. Glycosi- dase 활성은 Comitini [7]의 방법을 따라 측정하여, yeast ni- trogen base (6.7 g/l, glucose 1 g/l, rutin 2 g/l, agar 20 g/l) 배지를 제조하여 효모를 접종하고 28℃에서 72시간 배양 후투명환의 생성 유무를 관찰하였으며, protease 활성은 YM 배지(yeast extract 3 g/l, malt extract 3 g/l, peptone 5 g/l, glu- cose 10 g/l, agar 15 g/l)에 skim milk 농도가 1% (w/v)가 되도록 첨가하여 제조하고 효모를 접종하여 28℃에서 48시간 배양한 후 투명환의 생성 유무에 따라 평가하였다[1]. Amino acid decarboxylase는 YPD 고체배지에 아미노산 10 g/l (histidine, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, lysine, leu- cine), bromocresol purple 6 mg/l를 첨가하고 0.
- 4 ml의 증류수를 넣고 510 nm에서 흡광도를 측정하였다[20]. Tannin함량은 fo lin-ciocalteu의방법에 따라 동량의 시료, 95% ethanol 및 증류수를 혼합하고 1 ml의 5% Na2CO3와 0.5 ml의 1 N folin-ciocalteu 을 첨가하여 실온에서 60분간 반응시키고 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 5-hydroxymethylfurfural 함량은 Ningyang의 방법에 따라 2개의 튜브에 2 ml의 시료와 5 ml의 0.
- 5% barbituric acid와 증류수를 첨가한 뒤 즉시 550 nm에서 흡광도를 측정하였다[15]. pH 는 pH meter (Ion meter, Orion 520A)를 이용하여 측정하였고, 당도는 굴절당도계(RHB-55ATC, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다[15].
- 균주의 성장을 조사하였다. 당에 대한 내성 측정은 20, 30 및 40%의 glucose가 함유된 YPD 액체배지에 전배양한 효모를 0.1% 농도로 접종하고 28℃에서 180 rpm으로 24시간 동안 진탕 배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 성장을 비교하였다[1].
- 2 ml씩 도말하여 28℃에서 48시간 배양하였다. 배양된 효모는 집락 모양, 크기, 색깔 등 형태적 특징을 관찰하여 효모로 추정되는 균주를 순수 분리하여 사용하였으며, 분리한 균주들은 PDA 배지에 계대보관하며 실험에 이용하였다. 대조군으로 Saccharomyces cerevisiae KACC 30068, S.
- 에탄올 내성 측정은 0, 5, 10 및 15%의 에탄올이 함유된 YPD 액체배지 10 ml에 전 배양한 효모의 배양액을 1% 농도로 접종하고 28℃에서 3일간 배양 후 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 성장을 조사하였다. 당에 대한 내성 측정은 20, 30 및 40%의 glucose가 함유된 YPD 액체배지에 전배양한 효모를 0.
- 에탄올 및 아황산 내성 평가는 YPD 고체배지에 각각 농도별로 조제한 에탄올(5, 10 및 15%)또는 K2S2O5 (50, 150 및 250 ppm)를 첨가한 후 효모를 접종하고 28℃에서 24시간 배양한 뒤 균주의 증식 여부에 따라 내성을 확인하였다[1]. 황화수소는 BIGGY agar 배지(bismuth ammonium citrate 5 g/l, so- dium sulfite 3 g/l, glucose 10 g/l, glycine 10 g/l, yeast ex- tract 1 g/l, agar 16 g/l)에 효모를 접종하여 30℃에서 48시간 배양한 다음 균주의 색깔의 진하기에 따라 황화수소 생성능을 평가하였다[1].
- 에탄올 생성량은 전배양한 효모를 25%의 glucose가 함유된 YPD 액체배지 100 ml에 0.1%농도로 접종하고 28℃에서 48시간 동안 정치 배양한 후 10, 000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 회수하여 생성된 에탄올 함량을 측정하였다. 에탄올 함량 측정은 dichromate method [4]에 따라 3 ml의 dichro- mate regent (0.
- 최종적으로 흑마늘와인 제조 시 초기 당도 26 brix, 발효 온도 28℃의 최적 조건에서 흑마늘 와인을 제조하였다. 최종 제조된 흑마늘와인과 흑마늘 진액의 일반성분과 기능성 성분을 분석한 결과, 흑마늘의 기능성 성분인 총 polyphenol 함량은 발효 전 3.
- 황화수소는 BIGGY agar 배지(bismuth ammonium citrate 5 g/l, so- dium sulfite 3 g/l, glucose 10 g/l, glycine 10 g/l, yeast ex- tract 1 g/l, agar 16 g/l)에 효모를 접종하여 30℃에서 48시간 배양한 다음 균주의 색깔의 진하기에 따라 황화수소 생성능을 평가하였다[1].
- 효모 균주 분리를 위해 시판 막걸리, 과일 및 발효 식품을 구매하여 분리원으로 사용하였으며, 각각 시료를 멸균수에 희석하고 PDA 배지에 0.2 ml씩 도말하여 28℃에서 48시간 배양하였다. 배양된 효모는 집락 모양, 크기, 색깔 등 형태적 특징을 관찰하여 효모로 추정되는 균주를 순수 분리하여 사용하였으며, 분리한 균주들은 PDA 배지에 계대보관하며 실험에 이용하였다.
- 효모의 리보솜 DNA의 ITS영역을 솔젠트(SolGent Co., Daejeon, Korea)사에 의뢰하여 ITS1/ITS4 primer를 이용하여 증폭 분석하였다. 효모의 염기서열 분석 결과는 National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank의 BLAST 검색을 이용하여 기존의 등록된 효모의 리보솜 DNA ITS영역 염기서열과 상동성을 비교한 후, Bioedit, MEGA 7를이용하여 계통학적인 위치를 확인하였다[3].
- , Daejeon, Korea)사에 의뢰하여 ITS1/ITS4 primer를 이용하여 증폭 분석하였다. 효모의 염기서열 분석 결과는 National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank의 BLAST 검색을 이용하여 기존의 등록된 효모의 리보솜 DNA ITS영역 염기서열과 상동성을 비교한 후, Bioedit, MEGA 7를이용하여 계통학적인 위치를 확인하였다[3].
- brix)을 이용하여 발효하였다. 흑마늘 농축액을 희석하고 설탕(Samyang, Seoul, Korea)을 첨가하여 당도를 조절한 후에 산화 방지와 잡균 오염을 예방하기 위해 K2S2O5를 200 ppm 첨가하여 흑마늘 와인 제조용으로 이용하였다. Saccharomyces sp.
- 흑마늘 와인 제조 시 초기 당 함량이 와인 발효에 미치는 영향을 조사하기 위하여 흑마늘 농축액에 24, 26, 28 brix로보당하고 25, 30 및 35℃에서 각각 발효를 진행하면서 2일 간격으로 ethanol 농도 및 당도를 측정하여 최적 발효 조건을 탐색하였다.
대상 데이터
- 따라서 에탄올 발효능이 가장 높은 Saccharomyces sp. BCNU 6006 을 와인 발효 균주로 최종 선별하였다(Fig. 4).
- Saccharomyces sp. BCNU 6006을 발효 효모로 발효하였다.
- 남해보물섬마늘영농조합법인에서 제조한 흑마늘 농축액 (62 brix)을 이용하여 발효하였다. 흑마늘 농축액을 희석하고 설탕(Samyang, Seoul, Korea)을 첨가하여 당도를 조절한 후에 산화 방지와 잡균 오염을 예방하기 위해 K2S2O5를 200 ppm 첨가하여 흑마늘 와인 제조용으로 이용하였다.
- 배양된 효모는 집락 모양, 크기, 색깔 등 형태적 특징을 관찰하여 효모로 추정되는 균주를 순수 분리하여 사용하였으며, 분리한 균주들은 PDA 배지에 계대보관하며 실험에 이용하였다. 대조군으로 Saccharomyces cerevisiae KACC 30068, S. cerevisiae KACC 30008, S. cerevisiae EC-1118, S. cerevisiae K1-V1116, S. cerevisiae RED FRUIT, S. cerevisiae Fermivin을 농업유전자원정보센터(Korean Agricultureal Culture Collec- tion, KACC)와 Wine Kit Korea Co., Ltd.에서 분양받아 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 흑마늘 농축액(62 brix)은 남해 보물섬 마늘 영농조합에서 제조한 것으로 4℃ 냉장보관하면서 사용하였다.
이론/모형
- 5 ml의 1 N folin-ciocalteu 을 첨가하여 실온에서 60분간 반응시키고 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 5-hydroxymethylfurfural 함량은 Ningyang의 방법에 따라 2개의 튜브에 2 ml의 시료와 5 ml의 0.6% 4-methylani- line 을 혼합한 뒤, 각각 1 ml의 0.5% barbituric acid와 증류수를 첨가한 뒤 즉시 550 nm에서 흡광도를 측정하였다[15]. pH 는 pH meter (Ion meter, Orion 520A)를 이용하여 측정하였고, 당도는 굴절당도계(RHB-55ATC, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다[15].
- Pre-culture were inoculated into YPD medium with 25% glucose concentration and culture condition was 48 hr at 28℃. Ethanol concentration was measured using the dichromate method.
- Pre-cul- tured yeast was inoculated into black garlic juice at vari- ous temperatures. Ethanol contents was measured using Dichromate method, brix was measured using a saccha- rimeter.
- 분리 효모의 β-glucosidase 활성은 Rosiet al. [19]의 방법을 따라 esculin 5 g/l(w/v)와 1% ferric ammonium citrate가 2% (v/v)가 첨가된 YPD 배지(yeast extract 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 20 g/l, agar 15 g/l)에 접종하고 28℃에서 48시간 배양 후 주변에 검은색 환의 생성 여부로 확인하였다. Glycosi- dase 활성은 Comitini [7]의 방법을 따라 측정하여, yeast ni- trogen base (6.
- 1%농도로 접종하고 28℃에서 48시간 동안 정치 배양한 후 10, 000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 회수하여 생성된 에탄올 함량을 측정하였다. 에탄올 함량 측정은 dichromate method [4]에 따라 3 ml의 dichro- mate regent (0.1 M potassium dichromate, 5 M sulfuric acid) 를 비커에 넣고 0.3 ml의 sample이 담긴 튜브를 비커에 실로 고정한 뒤 입구를 parafilm으로 봉하고 30분간 실온에서 반응시킨 뒤 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 총 polyphenol 함량 측정은 folin-ciocalteu법에 따라 3.9 ml 의 증류수에 0.1 ml의 시료와 0.5 ml의 1 N fo lin-ciocalteu용액을 넣고 5분 동안 실온에 반응시킨 뒤 0.5 ml의 34% Na2CO3를넣고 30분 동안 실온에서 정치시킨 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다[20]. 총 flavonoid 함량은 4 ml의 증류수에 1 ml 시료를 넣고 5분 동안 실온에서 반응시킨 뒤 0.
성능/효과
- BCNU 6001-6005를 제외한 나머지 효모의 생육이 양호한 것으로 확인되었다. 15% 에탄올을 첨가한 액체배지에서는 모두 생육이 저조한 것으로 나타났다(Fig. 2). 이 결과는 기존에 연구된 Saccharomyces sp.
- Amino acid decarboxylase 활성을 tyrosine, lysine, phe- nylalanine 및 histidine 등 기질별로 조사한 결과, 활성을 모두 보유하지 않은 효모는 총 60균주로 확인되었다. 따라서, 높은 효소 활성을 보유하고 amino decarboxylase 활성을 가지지 않는 9균주를 최종 선별하여 BCNU 6001-6009로 명명하였다 (Table 1).
- 선별된 9균주와 시판 효모를 이용하여 에탄올 내성을 측정한 결과, 5% 에탄올을 첨가한 액체배지에서 모두 생육이 양호했으며, 10% 에탄올을 첨가한 액체배지에서 Kazachstania sp. BCNU 6001-6005를 제외한 나머지 효모의 생육이 양호한 것으로 확인되었다. 15% 에탄올을 첨가한 액체배지에서는 모두 생육이 저조한 것으로 나타났다(Fig.
- BCNU 6007 그리고 Saccharomyces sp. BCNU 6008 균주는 각각 4.7, 2.7 그리고 2.5%로 나타났으며, 시판 효모인 S. cerevisiae Fermivin는 6.2%로 확인되었다. 따라서 에탄올 발효능이 가장 높은 Saccharomyces sp.
- 42%로 높아지는 것을 확인할 수 있었다. Fe3+에 대한 환원력 측정결과는 농도가 높아질수록 높은 환원력을 보였으며 200 μl/ml 농도에서 발효 전 3.01 발효 후 2.747로 발효 후 환원력이 다소 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 7). 감 와인[9]은 100 μl/ml의 농도에서 DPPH radical 소거활성은 50%이며 ABTS radical 소거활성은 42%로 가지고 있으며, 수박 와인[18]은 100 μl/ml 농도에서 DPPH radical 소거활성은 58%로 보고되고 있으므로, 본 연구에서의 흑마늘 와인이 전반적으로 더 높은 항산화 활성을 나타내고 있는 것으로 확인되었다.
- 51 mg/ ml 측정되어 함량에 큰 변화는 없었다. Tannin 함량은 발효 전 6.32 mg/ml에서 발효 후 5.9 mg/ml로 나타났고, 5-HMF의함량은 발효 전 0.25 mg/ml에서 발효 후 0.07 mg/ml로 측정되어, 발효 후 성분이 다소 줄어든 것으로 확인되었다. 당도 26 brix로 시작한 발효시 12 brix가 되었고 pH는 4.
- 6). 그래서 알코올 생산량, 발효시간, 관능적인 면을 고려할 때 발효온도는 28℃가 가장 적합한 것으로 판단되었다. 단감 와인 제조 시 높은 온도에서 발효할수록이상취가 나는것과 유사한 결과로 나타났으나, 수박 와인[18] 과 단감 와인[9]에서 에탄올 생성량, 색도 및 맛을 고려하여 26℃가 최적 조건이라는 보고와는 다소 상이하였다.
- 적절한 당 농도가 필요하다[9]. 그래서 흑마늘 진액에 설탕으로 24, 26, 28 brix로 보당한 후 28℃에서 알코올 생성량을 살펴본 결과, 당 함량을 높일수록 에탄올 농도가 높아지는 것을 확인할 수 있었으며, 각각 11.12, 15.3 및 18.03%로 나타났다. 알코올 생산량을 고려할 때 26 brix가 적합한 것으로 판단된다(Fig.
- 20%로 발효 후 활성이 다소 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 superoxide anion radical 소거 활성은 25 μl/ml에서 발효 전 61.5% 발효 후 94.42%로 높아지는 것을 확인할 수 있었다. Fe3+에 대한 환원력 측정결과는 농도가 높아질수록 높은 환원력을 보였으며 200 μl/ml 농도에서 발효 전 3.
- 07 mg/ml로 측정되어, 발효 후 성분이 다소 줄어든 것으로 확인되었다. 당도 26 brix로 시작한 발효시 12 brix가 되었고 pH는 4.0에서 4.01 로, 에탄올 함량은 0에서 17.91%로 조사되었다(Table 2). 블루베리 발효주는 발효 후 총 polyphenol 및 총 flavonoid 함량이 증가했다고 보고하고 있으며[23], 감 와인은 발효 후 총 poly- phenol 함량은 증가하나 총 flavonoid 함량은 감소한다고 보고하고 있다[9].
- 에탄올에 대한 내성이 필요하다[1, 9]. 대부분의 분리 효모는 10% 이상의 ethanol 내성과 60 mg/ml SO2에 대한 내성을 보유하는 것으로 나타났으며, BCNU 6006, BCNU 6007, BCNU 6008, BCNU 6009 효모는 시판 효모인 S. cer- evisiae Fermivin와 유사한 ethanol 내성을 보유하는 것을 확인되어 와인이나 주류 제조에 사용이 가능할 것으로 사료된다(Table 1.).
- 않은 효모는 총 60균주로 확인되었다. 따라서, 높은 효소 활성을 보유하고 amino decarboxylase 활성을 가지지 않는 9균주를 최종 선별하여 BCNU 6001-6009로 명명하였다 (Table 1).
- 질병을 유발시킨다[1]. 막걸리, 과일 및 발효식품에서 분리한 균주는 형태학적 특징을 통해 81개의 효모를 선별하였고, β-glucosidase 및 protease 활성을 가진 균주가 각각 51 균주와 10 균주가 확인되었고, glycosidase 활성을 보유하고 있는 효모는 없는 것으로 조사되었다.
- 발효 온도가 흑마늘 와인 발효에 미치는 영향을 살펴본 결과, 25, 30 그리고 35℃에서 각각 15.82, 17.92 및 16.64%로 나타났으며, 25℃는 8일째부터 발효가 시작되었고 35℃에서는 이상취가 나타났다(Fig. 6). 그래서 알코올 생산량, 발효시간, 관능적인 면을 고려할 때 발효온도는 28℃가 가장 적합한 것으로 판단되었다.
- 선별된 효모 9균주의 ITS1/ITS4 primer를 이용하여 리보솜 DNA의 ITS영역의 염기서열을 분석한 결과, BCNU 6001, BCNU 6002, BCNU 6003, BCNU 6004, BCNU 6005는 Kazach- stania sevazzii 표준균주와 99% 상동성을 보였으며, BCNU 6006, BCNU 6007, BCNU 6008, BCNU 6009는 Saccharomyces cerevisiae 표준균주와 99% 상동성을 나타냈으며, 계통적으로도 K. sevazzii 또는 S. cerevisiae의 subcluster에 속하는 균주로 확인되었다(Fig. 1).
- 28℃의 최적 조건에서 흑마늘 와인을 제조하였다. 최종 제조된 흑마늘와인과 흑마늘 진액의 일반성분과 기능성 성분을 분석한 결과, 흑마늘의 기능성 성분인 총 polyphenol 함량은 발효 전 3.85 mg/ml에서 발효 후 3.76 mg/ml로 나타났고 총 flavonoid 함량은 발효 전 0.52 mg/ml에서 발효 후 0.51 mg/ ml 측정되어 함량에 큰 변화는 없었다. Tannin 함량은 발효 전 6.
- 필요하다. 효모 10균주를 대상으로 glucose가 20, 30 및 40%로 첨가된 액체배지에서 생육을 비교한 결과 시판 효모인 S. cerevisiae Fermivin이 가장 높은 생육을 나타냈으며, BCNU 6003, BCNU 6009를 제외하고 glucose 30%가 첨가된 액체배지에서 생육이 양호한 것으로 보아 내당성이 우수하므로, 와인 제조에 사용 가능성이 충분한 것으로 판단된다(Fig. 3).
- 흑마늘 와인과 흑마늘 진액의 항산화 활성은 DPPH, ABTS, superoxide anion (O2 -) radical 소거활성 및 환원력을 한 결과, DPPH radical 소거활성은 100 μl/ml농도에서 발효 전 90.81%, 발효 후 90.77%로 유사하였으나 50 μl/ml 농도에서는 발효 전 81.29%, 발효 후 73.22%로 다소 낮아지는 것으로 나타났으며, ABTS radical 소거활성은 100 μl/ml농도에서 발효 전 99.52% 발효 후 95.20%로 발효 후 활성이 다소 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 superoxide anion radical 소거 활성은 25 μl/ml에서 발효 전 61.
후속연구
- 따라서 분리한 효모의 효소 활성 및 내성을 확인하여 와인 균주로써 가능성을 확인하였고, 최종 선발된 Sac- charomyces sp. BCNU 6006을 이용하여 제조한 흑마늘 와인은 높은 항산화력을 가지고 있어서 본 연구 결과는 고부가가치상품으로서 흑마늘 와인 제조에 있어서 중요한 기초연구 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
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