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문제 정의
- 본 연구에서는 현재 제주연안에 문제가 되고 있는 구멍갈파래(Ulva pertusa)에서 서식하는 세균을 탐색하기 위해 분리·배양하고 2종(HaeⅢ, RsaⅠ)의 제한효소를 이용한 RFLP 분석과 16S rRNA을 비교하여 세균의 다양성을 파악하고자 한다.
제안 방법
- 16S rRNA gene 염기서열로 세균군집 다양성을 분석하고계통수를 작성하였다. 그 결과, 구멍갈파래의 세균 군집구조는 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-proteobacteria), Firmicutes, Actinobacteria, Bacter- oidetes로 4개의 문, 7개의 강, 13개의 목, 18개의 과, 27개의 속으로 구성되었다.
- primer를 사용하였다. AccuPowerTM PCR Pre- Mix (Bioneer, USA)에 DNA 1 μl를 첨가한 후 최종부피 25 μl로 맞추어 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 Initial denatura- tion 5분, 94℃에서 Denaturation 1분, 55℃에서 Annealing 1 분, 72℃에서 Extention 1분을 30 cycle 수행한 후 72℃ Final extention 10분간 PCR (Base for Gene Pro Thermal cycler, BIOER) 조건하에 실시하였다.
- AccuPowerTM PCR Pre- Mix (Bioneer, USA)에 DNA 1 μl를 첨가한 후 최종부피 25 μl로 맞추어 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 Initial denatura- tion 5분, 94℃에서 Denaturation 1분, 55℃에서 Annealing 1 분, 72℃에서 Extention 1분을 30 cycle 수행한 후 72℃ Final extention 10분간 PCR (Base for Gene Pro Thermal cycler, BIOER) 조건하에 실시하였다. 증폭된 PCR product는 1% agarose에서 전기영동(Mupid®-ex, ADVANCE) 하여 확인하였다.
- PCR을 하기 위해 27 Forward (5’-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3’) primer와 1522 Reverse (5’-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3’) primer를 사용하였다. AccuPowerTM PCR Pre- Mix (Bioneer, USA)에 DNA 1 μl를 첨가한 후 최종부피 25 μl로 맞추어 PCR을 수행하였다.
- UV로 관찰하여 총 145 균주의 PCR- RFLP 패턴을 비교하였다. RFLP 패턴결과 균주를 선정하여 ㈜ 제노텍(Daejeon, Korea)에 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 분리 균주의 계통학적 분석
- Tree topology의 작성은 Jukes and Cantor (1969) 방법으로 계산하고 neighbor-joining 방법으로 작성하였다. Tree topology의 신뢰성 평가를 위해 1, 000 회의 replication을 적용한 bootstrap 분석[21]을 하였다.
- 5% agarose에 loading하여 50 vol에 4시간 동안 전기영동 하였다. UV로 관찰하여 총 145 균주의 PCR- RFLP 패턴을 비교하였다. RFLP 패턴결과 균주를 선정하여 ㈜ 제노텍(Daejeon, Korea)에 16S rRNA 염기서열을 분석하였다.
- 균질화한 시료를 연속희석방법으로 희석한 후, Marine Agar (MA, Difco, USA)배지와 R2A Agar (Difco, USA)배지에 도말 하여 25℃에 일주일 동안 배양하였다. 각 배지에 자라난 Colony를 모양, 크기, 색깔 등 형태적 특징에 따라 선별하여 순수분리 하였다. 분리된 균주는 -80℃ 에 20%(v/v) Glycerol로 동결 보관하였다.
- 분석한 염기서열을 EzTaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud. net/)[16]에서 유사한 염기서열과 비교하고, 가장 가까운 속또는 종으로 나타나는 서열을 확인하였다. 본 연구에서 결정된 염기서열과 EzTaxon-e 에서 나타난 염기서열의 multiple alignment정렬은 Mega 6.
- 선별된균주는 EzTaxon-e 를 이용하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하고, 계통수를 작성하였다(Fig. 2).
- 순수분리한 균주는 2.5% Chelex (Chelex® 100 Molecular Biology Grade Resin, BIO-RAD, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 2.
- PCR 조건은 Initial denatura- tion 5분, 94℃에서 Denaturation 1분, 55℃에서 Annealing 1 분, 72℃에서 Extention 1분을 30 cycle 수행한 후 72℃ Final extention 10분간 PCR (Base for Gene Pro Thermal cycler, BIOER) 조건하에 실시하였다. 증폭된 PCR product는 1% agarose에서 전기영동(Mupid®-ex, ADVANCE) 하여 확인하였다.
대상 데이터
- RFLP 분석에 의해 총 104개의 균주를 선별하였다. 선별된균주는 EzTaxon-e 를 이용하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하고, 계통수를 작성하였다(Fig.
- RFLP을 위해 제한효소 HaeⅢ (Ezynomics, Korea)와 RsaⅠ (Ezynomics, Korea)를 사용하였다. 증폭된 PCR산물 10 μl, 제한효소 1 μl, EZ Buffer Ⅳ 2 μl, 멸균 증류수 7 μl를 넣은 후 최종부피 20 μl로 맞추어 37℃에서 2시간 30분 반응시켰다.
- 본 연구에서 사용한 구멍갈파래(Ulva pertusa)는 제주도 제주시 조천 신흥리에서 채집하였다. 채집한 구멍갈파래는 멸균된 핀셋을 이용하여 지퍼백에 담아 운반하여 실험에 사용하였다.
- 조천 신흥리에서 채집하였다. 채집한 구멍갈파래는 멸균된 핀셋을 이용하여 지퍼백에 담아 운반하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- net/)[16]에서 유사한 염기서열과 비교하고, 가장 가까운 속또는 종으로 나타나는 서열을 확인하였다. 본 연구에서 결정된 염기서열과 EzTaxon-e 에서 나타난 염기서열의 multiple alignment정렬은 Mega 6.0 software [29]에 포함된 Clustal X [30]프로그램을 이용하였다. Tree topology의 작성은 Jukes and Cantor (1969) 방법으로 계산하고 neighbor-joining 방법으로 작성하였다.
이론/모형
- 0 software [29]에 포함된 Clustal X [30]프로그램을 이용하였다. Tree topology의 작성은 Jukes and Cantor (1969) 방법으로 계산하고 neighbor-joining 방법으로 작성하였다. Tree topology의 신뢰성 평가를 위해 1, 000 회의 replication을 적용한 bootstrap 분석[21]을 하였다.
성능/효과
- 65%의 유사도를 나타내었다. Bacteroi- detes 그룹에 속하는 균주는 91.09-99.93%의 상동성을 보여주며, 그 중 Flavobacterium 속은 낮은 유사도를 나타내었다. R11 은 Flavobacterium jumunjinense HME 7102T와 95.
- Firmicutes 그룹에 속해 있는 균주는 모두 기존에 보고된염기서열과 99.21-99.73%의 상동성을 보여주며, Actinobacter- ia 그룹은 98.38-99.65%의 유사도를 나타내었다. Bacteroi- detes 그룹에 속하는 균주는 91.
- 81%의 상동성을 보여주었다. M87은 Alteromonas mediterranea DET와 97.44%의 유사도를 나타내었고, M66, M84은 각각 Paracoccus homiensis DD-R11T, Leisingera daeponensis TF-218T와 97.49%와 97.15% 의상 동성을 보여주었다. M102은 Paraglaciecola aquimarina GCW- M5T와 95.
- 분리되었다. MA배지에서 분리한 82개의 균주를 두 종류의 제한효소를 이용한 결과, HaeⅢ에서는 39 type, RsaⅠ에서는 36 type이 관찰되었다. R2A배지에서 분리한 63개의 균주는 HaeⅢ에서는 32 type, RsaⅠ에서 33 type이 관찰되었다(Fig.
- Proteobacteria 그룹은 기존에 보고된 염기서열과 95.60-100%의 상동성을 나타내었다. M64와 M80은 Alteromonas litorea TF-22T와 97.
- Proteobacteria 분류군은 Alpha-proteobacteria 22%, Beta- proteobacteria 4%, Gamma-proteobacteria 37%에 속하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Ulva sp.
- 10%의 유사도를 나타내었다. R54, R91, R92는 Flavobacterium pectinovorum DSM 6368T와 각각 97.19%, 97.12%, 97.25%의 상동성을 보여주었다. 이와 같이 16S rRNA 유전자 염기서열과비교한 104개의 균주 중 10개의 균주는 표준균주와 유전자염기서열이 97% 이하의 유사도를 보여 신종 후보 균주임을알 수 있다.
- 구멍갈파래에서 분리한 104개의 균주는 27속 50종으로 동정 되었다. Proteobacteria 그룹은 기존에 보고된 염기서열과 95.
- 구멍갈파래의 분류군은 Flavobacterium 12%, Pseudoalter- omonas, Alteromonas 각각 10%, Pseudomonas 8%, Aeromonas, Microbacterium 각각 6%, Vibrio, Bacillus, Exiguobacterium 각각 4%, Hydrogenophaga, Cellulophaga, Nonlabens, Maribacter, Olleya, Lacihabitans, Streptococcus, Ruegeria, Loktanella, Paracoc- cus, Leisingera, Octadecabacter, Erythrobacter, Cobeta, Oceanospi- rillum, Paraglaciecola, Shewanella, Actinbacter 각각 2%로 구성되었다(Fig. 3).
- 작성하였다. 그 결과, 구멍갈파래의 세균 군집구조는 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-proteobacteria), Firmicutes, Actinobacteria, Bacter- oidetes로 4개의 문, 7개의 강, 13개의 목, 18개의 과, 27개의 속으로 구성되었다. 그 중 Proteobacteria 문의 Alpha-proteo- bacteria 강은 2개의 목, 2개의 과 6개의 속으로 Gamma-pro- teobacteria 강은 5개의 목, 9개의 과, 10개의 속으로 Bacteroi- detes 문은 2개의 강, 2개의 목, 2개의 과, 6개의 속으로 구성된 분류군이 나타났다(Table 1).
- 그 결과, 구멍갈파래의 세균 군집구조는 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-proteobacteria), Firmicutes, Actinobacteria, Bacter- oidetes로 4개의 문, 7개의 강, 13개의 목, 18개의 과, 27개의 속으로 구성되었다. 그 중 Proteobacteria 문의 Alpha-proteo- bacteria 강은 2개의 목, 2개의 과 6개의 속으로 Gamma-pro- teobacteria 강은 5개의 목, 9개의 과, 10개의 속으로 Bacteroi- detes 문은 2개의 강, 2개의 목, 2개의 과, 6개의 속으로 구성된 분류군이 나타났다(Table 1).
- 그리고 호주에서 채집한 Ulva sp.에서는 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria)와, Bacteroi- detes로 2개의 문에 속하는 그룹이 보고되었으나[34], 본 연구에서는 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Beta-proteo- bacteria, Gammaproteobacteria), Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes로 4개의 문에 속하는 그룹이 확인되었다(Fig. 4). 이러한 결과와 비교하면 공통적으로 나타난 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria), Bacteroidetes 의 2개의 문을 제외하고는 세균의 군집구조가 서로 다르며, U.
- 4). 이러한 결과와 비교하면 공통적으로 나타난 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria), Bacteroidetes 의 2개의 문을 제외하고는 세균의 군집구조가 서로 다르며, U. pertusa에서 더 다양한 세균의 군집구조를 확인할 수 있다. 이러한 결과는 배양조건과 환경 등에 따라 세균군집이 달라지는 연구와 일치한다고 볼 수 있다[19, 20].
- 25%의 상동성을 보여주었다. 이와 같이 16S rRNA 유전자 염기서열과비교한 104개의 균주 중 10개의 균주는 표준균주와 유전자염기서열이 97% 이하의 유사도를 보여 신종 후보 균주임을알 수 있다. 따라서 앞으로 표준균주와 함께 신종 실험이 진행되어야 할 것으로 판단된다.
- 형태적 특징에 따라 분리된 배양 가능한 세균은 MA 배지에서 82개의 균주와 R2A배지에서 63개의 균주로 총 145개의 균주가 분리되었다. MA배지에서 분리한 82개의 균주를 두 종류의 제한효소를 이용한 결과, HaeⅢ에서는 39 type, RsaⅠ에서는 36 type이 관찰되었다.
후속연구
- 그리고 Ulva sp.에서 분리한 균주의 항균효과에 대한 연구결과로 볼 때[18], U. pertusa에서 분리한 균주도 가능성이 있다고 보며, 추후 분리된 균주로부터 항균실험이 진행되어야 된다고 생각되며, 우리나라에서 해조류에 대한 군집구조의 연구는 적기 때문에 이와 관련하여 많은 연구가 필요하다고 사료된다.
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