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문제 정의
- 본 연구에 서는 가시복의 장내미생물의 다양성을 파악하였다. 그리고 다양한 균주 중 어류 또는 인체 유해세균 가능성을 확인하고자 항균 활성 탐색을 수행하였다.
- 이러한 기후 변화는 난대성 어류가 서식할 수 있는 환경이 되며, 최근 제주 연안에서는 가시복(diodon holoanthus)이 발견되고 있다. 본 연구에 서는 가시복의 장내미생물의 다양성을 파악하였다. 그리고 다양한 균주 중 어류 또는 인체 유해세균 가능성을 확인하고자 항균 활성 탐색을 수행하였다.
- 본 연구에서는 가시복의 장내미생물 군집을 파악하고자 하였고 어류질병세균과 인체 유해세균에 대한 항균활성을 확인하였으며, 어류질병세균과 인체유해세균의 항균활성을 확인하여 추후 질병에 대한 치료 및 예방에 있어 필요한 기초 자료를 제시하고자 하였다.
- 본 연구에서는 주변 환경의 영향을 가장 많이 받을 수 있는 가시복의 장내 미생물의 다양성을 확인하였다. 장내 세균의 군집은 추후 타 열대어종과 비교 분석하여 생태계 환경의 변화를 관찰 할 수 있을 것이다.
제안 방법
- 5) 30 μl로 elution 하였다. PCR products의 염기서열의 분석은 (주)솔젠트(Korea)에 의뢰하여 결과를 얻었다. 분석 된 염기서열은 EzTaxone (http://eztaxon-e.
- PCR 반응 조건은 Intial denaturation (95℃, 2분), Denaturation (95℃, 30초), Annealing (55℃, 30초), Extension (72℃, 30초)으로 총 30 cycle로 수행한 후 마지막 으로 다시 한번 Extension (72℃, 5분) 하였다. 증폭 된 PCR products는 Red safe (Intron, USA)가 첨가된 1% agarose (PromegaCo.
- net/)을 이용하여 homology를 확인하였다. 다음 ClustalX로 multiple alignment를 수행한 뒤 MEGA 6.0로 계통도(phylogenetic tree)를 작성하였다.
- 다음 genomic DNA 1 μl와 27F/1492R universal primer 각각 0.5 μM primer와 DNA polymerase, dNTPs, reaction buffer가 포함된 20 μl PreMix (Bioneer)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
- 다음 세척된 장을 꺼내어 1g만 잘라 내어 0.85% 멸균된 생리식염수에 옮겨 단계별(10-3−10-5)로 희석시켜 Brain Heart Infusion agar (BHIA, USA), Marine agar (USA), R2A agar (R2A, Difco., USA), Tryptic soy agar (TSA, Difco., USA), MRS agar (MRS, USA)에 각각 100 μl씩 넣고 도말하였다.
- 다음 여과 된 상등액과 현탁 된 균체는 각각 멸균 된 8 mm paper disc (ADVANTEC, Japan) 에 50, 100 μl씩 분주하고 25℃에서 24시간동안 건조시켰다. 병원균은 MacFarland turbidity 0.4로 조절한 후 Muller Hinton Agar (MHA, USA)에 도말하여 각각의 배양 온도에 맞추어 48시간 동안 형성 된 억제환의 크기를 측정하였다.
- 그리고 25% glycerol에 현탁시켜 -80℃에서 보관하였다가 사용하였다. 병원성 세균은 적절한 배지 안에서 배양되었고, 가시복에서 분리한 균주는 BHIA, MA, R2A, TSA에 접종시켜 25℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 균주는 1.
-
16S rRNA 염기서열 분석
분리한 균주는 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)로 DNA를 추출하였다. 다음 genomic DNA 1 μl와 27F/1492R universal primer 각각 0.
- PCR products의 염기서열의 분석은 (주)솔젠트(Korea)에 의뢰하여 결과를 얻었다. 분석 된 염기서열은 EzTaxone (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)을 이용하여 homology를 확인하였다. 다음 ClustalX로 multiple alignment를 수행한 뒤 MEGA 6.
- PCR 반응 조건은 Intial denaturation (95℃, 2분), Denaturation (95℃, 30초), Annealing (55℃, 30초), Extension (72℃, 30초)으로 총 30 cycle로 수행한 후 마지막 으로 다시 한번 Extension (72℃, 5분) 하였다. 증폭 된 PCR products는 Red safe (Intron, USA)가 첨가된 1% agarose (PromegaCo., USA) gel에서 전기 영동하여 확인하였다. 다음 AccuprepTM PCR purification Kit (Bioneer)를 사용하여 PCR products에 남은 primers, nucleotides, polymerase, salts를 제거 및 정제하고 elution buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 가시복은 2018년 11월 14일 제주도 서귀포시에서 채집하여 아이스박스에 담아 -4℃를 유지시키며 운송시킨 후 분리된 장은 실험에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
- 항균 활성 탐색을 위해 사용된 어류질병세균과 인체 유해 세균은 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)와 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양받아 사용하였고(Table 1), Wild type은 인체의 피부 및 병어를 통해 각각 분리하였다. 그리고 25% glycerol에 현탁시켜 -80℃에서 보관하였다가 사용하였다.
성능/효과
- α-proteobactera강은 5속 5종으로 Brevundimonas속, Allorhizobium속, Pseudoceanicola속, Erythrobacter속 및 Methylobacterium속이 각각 1%로 나타났다.
- Actinobacteria문 Actinobacteria강은 99−100%의 상동성을 보였고 3속 3종으로 Janibacter속, Micrococcus속 및 Isoptericola속이 각각 1%를 차지했다.
- α-proteobactera강은 5속 5종으로 Brevundimonas속, Allorhizobium속, Pseudoceanicola속, Erythrobacter속 및 Methylobacterium속이 각각 1%로 나타났다. Firmicutes문 Bacilli강은 6속 10종으로 Bacillus속 5%가 가장 높았고 나머지 Terribacillus 속, Paenibacillus속, Salinicoccus속, Staphylococcus속 및 Streptococcus속은 1%로 관찰됐다.
- Firmicutes문 Bacilli강은 99−99%의 상동성으로 6속 10종으로 Bacillus속 5%로 가장 높았고 나머지 Terribacillus속, Paenibacillus속, Salinicoccus속, Staphylococcus속 및 Streptococcus속은 1%로 관찰됐다.
- Proteobacteria는 분리 된 균주 중 91%를 차지한 우점문으로 γ-proteobacteria강은 11속 142종으로 Vibrio속 35%, Photobacterium속 32%, Shewanella속 6%, Psychrobacter속 4%, Acinetobacter속 3% 및 나머지 Enterovibrio, Moraxella_g2속이 각각 1%를 차지했다.
- Proteobacteria문 α-proteobacteria강은 96−100%의 상동 성을 보였고 5속 5종으로 Brevundimonas속, Allorhizobium 속, Pseudooceanicola속, Erythrobacter속 및 Methylobacterium 속이 각각 1%로 나타났다.
- Proteobacteria문 γ-proteobacteria강은 96−100%의 상동 성을 보였고 11속 142종으로 Vibrio속 35%, Photobacterium속 32%, Shewanella속 6%, Psychrobacter 4%, Acinetobacter 속 3% 및 나머지 Enterovibrio, Moraxella_g2속이 각각 1%를 차지했다.
- Shewanella속 Shewanella carassii는 통성혐기성 균주로 여러 해양 생물에서 분리되며, 사람에게 기회성병원체가 될수 있다고 알려져 있고[5], Shewanella submarina는 최근에동정[19]을 통해 분리되고 있고 본 연구에서 분리된 두 종 모두 97.65−97.94%의 상동성을 보였다.
- 가시복 장내 미생물은 16S ribosomal RNA PCR로 증폭하고 EZbiocloud을 통해 3문(Phylum) 4강(Class) 10목(Order) 17과(Family) 24속(Genus)으로 총 161 균주로 분석되었다 (Table 4). 그리고 가장 가까운 속 또는 종의 계통수를 작성하였다(Fig.
- 가시복 장내 미생물의 항균 활성 탐색 결과, 일반적으로 비 병원성 상태로 인체 피부와 공생하는 균이지만 면역이 저하된 환자에게 기회성병원체[18]가 될 수 있는 M. luteus균에서 T6, T8, B21, B22 및 B23이 항균 활성을 나타났다 (Table 3). 그 중 T8은 22 mm으로 가장 높은 항균 활성을 나타내었고 B21은 20 mm, B22와 B23은 19 mm, 나머지 T6 은 18 mm으로 관찰되었다.
- 전반적으로 호기성과 혐기성 배양 모두 MA와 BHIA에서 높게 계수되었고, 혐기성에 비해 호기성에서 여러 속(Genus) 이 관찰되었다. 젖산균 또는 유산균은 장내 pH를 낮춰 유해 세균의 침입을 막아주고, 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
- 흥미롭게도, 본 연구에서는 어류질병세균 B21 (Streptococcus parauberis sp.)이 인체유해세균으로 작용할 수 있는 M.luteus균에서 항균 활성을 나타냈다. 그리고 T8은 Vibrio 속에 해당하나 종에 관한 연구 결과는 미비하고 본 연구 결과에서는 항균 능력을 갖고 있음이 관찰됐다.
후속연구
- 94%의 상동성을 보였다. 그리고 어류 장[26]에서 분리되는 Enterovibrio norvegicus도 97.35%로 신종 실험이 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 제주 연안 가시복에서 분리 된 주요 종은 Vibrio leiognathi로 이에 관한 연구는 미비한 실정이며 추가적인 계절별 변동에 따른 다양성 조사가 필요할 것으로 사료된다. 그리고 종간의 그룹 조사는 생태계 변화 흐름을 파악하는데 필요한 기초 자료로 사용될 수 있을 거라 생각된다. Phobacterium속은 대부분 호기성이라 알려져 있으나 가시복에서 분리한 Photobacterum panuliri는 혐기성균주로 알칼리에 내성[4]을 지녔다고 보고됐다.
- Actinobacteria문 Actinobacteria강은 99−100%의 상동성을 보였고 3속 3종으로 Janibacter속, Micrococcus속 및 Isoptericola속이 각각 1%를 차지했다. 두 속은 아직까지 어류에서 분리된 보고가 없는 바 본 자료가 추후 기초 자료로 쓰이는데 도움이 될 것이라 생각된다.
- 장내 세균의 군집은 추후 타 열대어종과 비교 분석하여 생태계 환경의 변화를 관찰 할 수 있을 것이다. 또한 인체 세균에 대한 항균 활성은 추가 연구를 통해 생물적 제제로 이용할 수 있을 것이라 사료된다.
- Phobacterium속은 대부분 호기성이라 알려져 있으나 가시복에서 분리한 Photobacterum panuliri는 혐기성균주로 알칼리에 내성[4]을 지녔다고 보고됐다. 이 종은 96.43%의 상동성을 나타냈고 주로 해양이나 감염된 어류 에서 분리[15]되는 Vibrio ponticus 또한 96.35%의 상동성을 보여 추가적인 신종 실험이 필요하다 생각된다.
- 본 연구에서는 주변 환경의 영향을 가장 많이 받을 수 있는 가시복의 장내 미생물의 다양성을 확인하였다. 장내 세균의 군집은 추후 타 열대어종과 비교 분석하여 생태계 환경의 변화를 관찰 할 수 있을 것이다. 또한 인체 세균에 대한 항균 활성은 추가 연구를 통해 생물적 제제로 이용할 수 있을 것이라 사료된다.
- parahaemolyticus가 검출됨에 따라 해양의 온도의 상승 또는 온대 지역에서 넘어 온 아열 대성 균주일 것이라고 시사했다[27]. 제주 연안 가시복에서 분리 된 주요 종은 Vibrio leiognathi로 이에 관한 연구는 미비한 실정이며 추가적인 계절별 변동에 따른 다양성 조사가 필요할 것으로 사료된다. 그리고 종간의 그룹 조사는 생태계 변화 흐름을 파악하는데 필요한 기초 자료로 사용될 수 있을 거라 생각된다.
- 해수[9]에서 분리되는 Pseudoceanicola lipolyticus는 96.39%로 추가적인 신종 실험이 필요하다.
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