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문제 정의
- 본 연구에서는 생쥐에 LPS를 투여하여 패혈성 쇼크를 유발한 동물모델을 이용하여 丹蔘의 패혈성 쇼크에 대한 효과를 알아보고, 그 기전을 생쥐의 복강으로부터 대식세포를 분리하여 그 활성을 다양한 면역학적 분석 방법을 통해 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- LPS에 의해 유도되는 sepsis는 다양한 염증성 사이토카인과 반응성 산호종(ROS)을 분비하는 대식세포의 활성에 기인하므로 생쥐의 복강으로부터 분리한 대식세포의 염증성 사이토카인 합성 및 분비에서 SME의 효과를 조사하였다. SME의 농도를 1, 5, 25 μg/㎖ 로 달리하여 대식세포를 처리한 후에 LPS로 자극하였다.
- SME가 어떤 기전을 통해서 생쥐의 생존율을 높여 주는지 분석하기 위해 SME를 투여한 septic shock 생쥐모델의 혈액 내 염증성 사이토카인 분비량과 간과 페조직의 상태를 관찰하였다. LPS 접종 1시간 전에 생쥐에게 SME를 투여하고, LPS 접종 3시간 경과 후에 혈액과 장기 조직을 채취하였다.
- 네 그룹으로 생쥐 (그룹 당 n=5)를 구분하여 식염수 (콘트롤) 또는 丹蔘 추출물 (Salviae Miltiorrhizae Radix Extract, SME) 1, 5, 10 ㎎/㎏을 구강으로 주입하였다
- 본 연구에서는 생쥐에 LPS를 투여하여 패혈성 쇼크를 유발한 동물모델을 이용하여 丹蔘의 패혈성 쇼크에 대한 효과를 알아보고, 그 기전을 생쥐의 복강으로부터 대식세포를 분리하여 그 활성을 다양한 면역학적 분석 방법을 통해 조사하였다. 우선 SME의 in vivo에서의 독성을 조사하여 농도를 결정하였다.
대상 데이터
- 6-8주 female C57BL/6 생쥐를 이용하였고, 실험동물의 관리와 모든 실험과정은 "the National Institutes of Health (NIH) Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals" 지침에 따라 수행하였다.
- 본 실험에 사용된 丹蔘은 꿀풀과 (Labiatae)에 속한 다년생 초본인 丹蔘 Salvia miltiorrhiaza Bge.의 뿌리와 뿌리줄기를 건조한 것으로 동의대학교 부속 한방병원을 통하여 구입 정제하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 one way ANOVA test를 이용하여 p-value를 구하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 또한 다양한 농도의 SME를 1시간 처리한 후 LPS로 24시간 동안 자극한 후, 각 well로 부터 상층액을 얻어 ELISA 방법에 의해 분비된 cytokine을 측정하였다
- 복강으로부터 분리한 대식세포에 LPS를 자극하여 염증관련 사이토카인 분비를 ELISA assay로 측정하였다. SME는 염증관련 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α 분비를 농도 의존적으로 감소시켰다(Fig.
- 세포의 생존율은 살아있는 세포가 tetrazolium compound 3-(4,5 dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)를 보라색 formazan crystals으로 변환시키는 능력을 이용하는 비색법(colorimetric technique)을 사용하여 분석하였다
- 이 혈액으로부터 혈청을 분리하여 ELISA 방법에 의해서 IL-1β, IL-6, TNF-α의 분비량을 측정하였다
성능/효과
- 10 ㎎/㎏ 이하에서는 생쥐에 유의미한 독성을 나타내지 않음을 확인하였고 1, 5, 10 ㎎/㎏의 농도로 SME를 생쥐에 구강 투여한지 1시간 후 LPS를 복강 내로 주사하여 12시간 단위로 5일간 경과를 관찰했다. LPS 단독으로 septic shock이 유도된 생쥐는 모두 24시간만에 생존율 0%를 나타냈고, SME를 투여한 생쥐에서 농도 의존적으로 생존율이 증가함을 관찰할 수 있었다(Fig. 1).
- SME가 LPS에 의해 유도되는 NO, iNOS 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 SME의 농도를 1, 5, 25 μg/㎖ 로 달리하여 대식세포를 처리한 후에 LPS로 자극하였다. LPS에 의해 분비되는 NO의 대사산물인 nitrite 농도를 측정하여 NO 생성의 지표로 표현하였으며 SME가 NO 생성을 현저히 억제하는 결과를 관찰할 수 있었다 (Fig. 7).
- 丹蔘은 LPS에 의해 유도되는 생쥐의 패혈성 쇼크에 대해 억제 기능을 보이는 것으로 사료된다.
- 생쥐 복강 대식세포를 대상으로 한 상기 실험을 통해 SME가 염증성 사이토카인의 합성 및 분비를 감소시키고, NO 및 iNOS의 생성을 억제하는 기전을 통해서 septic shock 생쥐 모델에 유효한 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 실험 결과는 U-937 세포를 대상으로 丹蔘 추출물이 PMA 또는 LPS에 의해 활성화되는 TNF-α와 COX-2 mRNA 발현을 유의성 있게 감소시키고46,47), LPS 처리된 RAW 264.
후속연구
- 이상의 연구 결과들로 보아 血熱에 효과적인 SME가 염증성 사이토카인 발현 및 NO 생성을 조절하는 기전을 통해 패혈성 쇼크에 대해 억제 기능을 보이는 것으로 생각되며, 이에 SME가 血熱에 의해 발생할 수 있는 패혈증 및 다양한 염증성 질환에 의한 제반 증상 치료에 효과적일 것으로 기대되는 바이다. 향후 丹蔘의 다양한 약리 성분들에 대한 개별적인 효과 연구 및 추출물 자체 혹은 약침용 제제 등으로의 임상적 활용을 위한 추가적인 연구 수행이 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 연구 결과들로 보아 血熱에 효과적인 SME가 염증성 사이토카인 발현 및 NO 생성을 조절하는 기전을 통해 패혈성 쇼크에 대해 억제 기능을 보이는 것으로 생각되며, 이에 SME가 血熱에 의해 발생할 수 있는 패혈증 및 다양한 염증성 질환에 의한 제반 증상 치료에 효과적일 것으로 기대되는 바이다. 향후 丹蔘의 다양한 약리 성분들에 대한 개별적인 효과 연구 및 추출물 자체 혹은 약침용 제제 등으로의 임상적 활용을 위한 추가적인 연구 수행이 필요할 것으로 사료된다.
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