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문제 정의
- 따라서 본 연구는 사육 중 배추좀나방 죽은 유충에서 세균을 분리하여 동정하고 접종하여 생물활성을 확인하였다. 그리고 나비목 해충인 파밤나방에 대한 생물 검정을 진행하였다.
- 이러한 조건을 갖출 수 있는 유기농자제로서는 식물의 추출물보다는 미생물 유래의 살충제가 우선시 되고 있다. 따라서 본 연구실에서 새로운 미생물 살충제의 탐색과정에서 발견된 미생물의 산업화를 위하여 특성을 검토하였다.
제안 방법
- 분자생물학적 동정을 위하여 16S rRNA를 PCR 증폭하였으며, Primer는 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3') primer와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하였다. 16S rRNA 유전자 PCR 증폭산물은 PCR Product purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였고, PCR 정제산물은 Genetic analyzer 3730xl (Applied biosystems)로 염기서열을 분석하였고, 염기서열은 NCBI/Genebank와 Ribosomal Database Project II (RDP II)의 database에서 상동성 검색을 수행 하였다.
- Clear zone은 배양 6, 8 그리고 10일 차에 확인하였다. S. marcescens 균주에 의한 식물병원성 곰팡이의 inhibition zone의 길이는 Dogmatic caliper (Mitutoyo)를 사용하여 측정하고 control value를 측정하였다.
- S. marcescens 균주의 chitin 분해력을 조사하기 위해 chitin 고채배지에 균주를 도말하여 clear zone을 조사하였다. Fig.
- 따라서 본 연구는 사육 중 배추좀나방 죽은 유충에서 세균을 분리하여 동정하고 접종하여 생물활성을 확인하였다. 그리고 나비목 해충인 파밤나방에 대한 생물 검정을 진행하였다. 또한 십자화과와 가지과에 병원성을 일으키는 곰팡이에 대해 항균능력을 검정하였다.
- marcescens 균주의 식물병원균에 대한 항균활성을 조사하였다. 농작물의 주요 식물병원성 5종의 곰팡이에 대하여 PDA고체배지상에서 대치 배양하여 Digimatic caliper (Mitutoyo) 로 clear zone을 측정하여 검토하였다.
- 또한 새로운 균주의 chitin분해 능력을 확인하기 위해 chitin agar (colloidal chitin 0.5%, Na2HPO4 0.2%, KH2PO4 0.1%, NaCl 0.5%, NH4Cl 0.1%, MgSO4 7H2O 0.05%, CaCl2 2H2O 0.05%, Yeast extract 0.05%, bactoagar 2%) plate에 균주를 도말 하여 27℃의 조건으로 배양하였다. Clear zone은 배양 6, 8 그리고 10일 차에 확인하였다.
- 그리고 나비목 해충인 파밤나방에 대한 생물 검정을 진행하였다. 또한 십자화과와 가지과에 병원성을 일으키는 곰팡이에 대해 항균능력을 검정하였다.
- 위에서 분리한 Serratia marcescens 균주를 LB배양액에 배양기간에 따라 5일, 7일 그리고 10일 간격으로 배양하여 배양원액을 배추좀나방에 생물 검정하였다. 또한 이 균주의 살충기작을 일으키는 주요 독소성분이 어디에 포함되어있는 지를 확인하기 위해 배양한 원액과 상층액으로 나누어서 각각 시험하였다. 우선 배양액의 시험은 90 mm petri dish에 배추잎을 넣고 배추좀나방을 dish당 5마리씩 접종하였다.
- 배추좀나방의 죽은 유충에서 분리된 S. marcescens 균주의 식물병원균에 대한 항균활성을 조사하였다. 농작물의 주요 식물병원성 5종의 곰팡이에 대하여 PDA고체배지상에서 대치 배양하여 Digimatic caliper (Mitutoyo) 로 clear zone을 측정하여 검토하였다.
- 배추좀나방의 죽은 유충에서 분리한 S. marcescens 균주의 살충활성을 검토하기 위하여 LB배양액에 몇 종류의 해충에 대하여 생물검정을 실시하였다. 생물검정은 Fig.
- 마쇄된 혼합액의 상청액 200 µl를 적절하게 희석하여 NA 고체배지에 배양하여 세균을 분리하였다. 분리한 세균을 Phase contrast microscope (Olympus BX51)로 형태를 관찰하고, 목원대학교 미생물생태자원연구센터에서 분류동정하였다. 분자생물학적 동정을 위하여 16S rRNA를 PCR 증폭하였으며, Primer는 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3') primer와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하였다.
- 분자생물학적 동정을 위하여 16S rRNA를 PCR 증폭하였으며, Primer는 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3') primer와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하였다.
- marcescens 균주의 살충활성을 검토하기 위하여 LB배양액에 몇 종류의 해충에 대하여 생물검정을 실시하였다. 생물검정은 Fig. 1A에서 볼 수 있듯이 처리 2일 후부터 감염되어 죽은 배추좀나방의 유충과 번데기가 용화하여 죽은 상태까지 조사했다. Fig.
- 선발된 S. marcescens 균주의 chitinase 생성을 유도하기 위해 chitin 배양액으로 파밤나방에 대한 생물활성을 조사하였다. Chitin 배양액의 상청액을 파밤나방 유충에 처리하였을 때 접촉은 4%, 섭식은 1.
- 또한 이 균주의 살충기작을 일으키는 주요 독소성분이 어디에 포함되어있는 지를 확인하기 위해 배양한 원액과 상층액으로 나누어서 각각 시험하였다. 우선 배양액의 시험은 90 mm petri dish에 배추잎을 넣고 배추좀나방을 dish당 5마리씩 접종하였다. 처리방법은 손 스프레이를 사용하여 배양액 300 µl를 분무하였다.
- 위에서 분리한 Serratia marcescens 균주를 LB배양액에 배양기간에 따라 5일, 7일 그리고 10일 간격으로 배양하여 배양원액을 배추좀나방에 생물 검정하였다. 또한 이 균주의 살충기작을 일으키는 주요 독소성분이 어디에 포함되어있는 지를 확인하기 위해 배양한 원액과 상층액으로 나누어서 각각 시험하였다.
- 죽은 곤충의 유충으로 분리된 새로운 균주가 유기농자제로서 개발되는 과정 에서 우선 외부 형태적 특성을 phase contrast microscope (Olympus BX51)로 관찰 하였다. 균주의 분리학적 특성을 유전학적으로 구명하기 위하여 16srRNA 염기 서열을 분석한 결과, Serratia marcescens ATCC13880 균주와 99.
- 처리방법은 손 스프레이를 사용하여 배양액 300 µl를 분무하였다.
- 파밤나방의 생물검정도 배추좀나방과 동일한 방법으로 수행하였으며, 또한 LB와 chitin 배양액으로 작용기작의 특성을 검토하기 위하여 각각 인공 사료인 먹이에 혼합하여 섭식독성을 시험하였으며, 파밤나방에만 배양액을 살포하는 접촉독성 시험을 하고, 양쪽을 동시에 시험하기 위하여 먹이를 주고 살포를 하는 섭식 및 접촉독성 등 3가지 방법으로 나누어 수행하였다.
- 한편 S. marcescens 균주가 나비목 곤충인 파밤나방에도 살충력을 나타내는지 여부를 조사하기 위하여 LB배양액으로 생물 검정하였다. 파밤나방 3령 유충에 섭식, 접촉 그리고 섭식과 접촉 합한 3가지 방법으로 나누어 처리하였을 때 파밤 나방 유충에서도 몸이 붉게 변하여 죽었다.
대상 데이터
- 곤충사육실에서 사육중이던 배추좀나방의 개체군에서 죽은 유충 12마리를 채집하였다. 죽은 유충의 표면소독은 1% NaClO3에 1분간 침지한 후 70% (w/w)에탄올에 또다시 1분 침지하였다.
- 배추좀나방은 충남대학교 응용생물학과 곤충사육실에서 사육하였으며, 사육 조건은 온도 25 ± 2℃, 광조건 16L:8D, 상대습도 50~60%로 열무를 먹이로 공급하며 누대 사육하였다.
- 위에서 분리한 Serratia marcescens의 식물병원성균에 대한 길항작용은 십자화과에 밑둥썩음병을 일으키는 Rhizoctonia solani 균주, 균핵병을 일으키는 Sclerotinia sclerotiorum 균주, 시들음병을 일으키는 Fusarium oxysporum 균주, 가지과에 역병을 일으키는 Phytophthora capsici 균주, 시들음병을 일으키는 Fusarium oxysporum 균주, 그리고 탄저병을 일으키는 Colletotrichum gloeosporioides 균주 등 총 6종의 식물병원성 곰팡이를 충남대학교 응용생물학과 식물병리학 실험실에서 분양받아 사용하였다.
- 배추좀나방은 충남대학교 응용생물학과 곤충사육실에서 사육하였으며, 사육 조건은 온도 25 ± 2℃, 광조건 16L:8D, 상대습도 50~60%로 열무를 먹이로 공급하며 누대 사육하였다. 파밤나방도 동일한 조건에서 먹이는 인공사료(Goh et al., 1991)를 이용하여 누대 사육하였다.
성능/효과
- marcescens 균주의 chitinase 생성을 유도하기 위해 chitin 배양액으로 파밤나방에 대한 생물활성을 조사하였다. Chitin 배양액의 상청액을 파밤나방 유충에 처리하였을 때 접촉은 4%, 섭식은 1.33% 그리고 접촉과 섭식은 6.66%의 낮은 사충률을 보였다(Table 3). 반면에 S.
- sclerotiorum과의 생물활성 사진이다. S. marcescens 균주는 5종의 주요 식물병원성 곰팡이의 생육을 뚜렷하게 저해 하지는 못하는 것으로 나타났다. Someya와 Kataoka (2000)은 S.
- 파밤나방 3령 유충에 섭식, 접촉 그리고 섭식과 접촉 합한 3가지 방법으로 나누어 처리하였을 때 파밤 나방 유충에서도 몸이 붉게 변하여 죽었다. Table 2에서 볼 수 있는 것 같이, LB 배양액의 상청액 만으로 파밤나방 유충에 처리하였을 때, 접촉은 5.3%, 섭식은 0% 그리고 접촉과 섭식은 10.66%의 사충률을 보였다. 반면에 균체가 포함된 배양액 전부를 처리하였을 때, 접촉은 20%, 섭식은 8%, 접촉과 섭식은 28%의 사충률을 확인하였다.
- 6%의 사충률을 보였으며, 무처리로 LB양액만을 처리한 대조구는 모두 살아있었다(Table 1). 결과적으로 배양 원액과 균을 제거한 상청액과의 독성 비교실험에서 균주가 혼재되어 있는 원액이 방제효과가 좋은 것으로 나타났다.
- 죽은 곤충의 유충으로 분리된 새로운 균주가 유기농자제로서 개발되는 과정 에서 우선 외부 형태적 특성을 phase contrast microscope (Olympus BX51)로 관찰 하였다. 균주의 분리학적 특성을 유전학적으로 구명하기 위하여 16srRNA 염기 서열을 분석한 결과, Serratia marcescens ATCC13880 균주와 99.8%의 상동성으로 나타났다.
- marcescens 균주의 최고 활성이 높은 10일간 배양액을 배추좀나방 3령 유충에 100배 희석액으로 처리하고 2일 후면 100%의 사충률을 보였다(Table 1). 또한 독성의 특성을 구명하기 위하여 배양액을 원심 분리 하고 나서 상청액만을 배추좀나방에 처리하였을 때 처리 7일 후에 배양 원액은 100% 사망하였고, 10배 희석액에서는 86.6%의 사충률을 보였으며, 무처리로 LB양액만을 처리한 대조구는 모두 살아있었다(Table 1). 결과적으로 배양 원액과 균을 제거한 상청액과의 독성 비교실험에서 균주가 혼재되어 있는 원액이 방제효과가 좋은 것으로 나타났다.
- 66%의 사충률을 보였다. 반면에 균체가 포함된 배양액 전부를 처리하였을 때, 접촉은 20%, 섭식은 8%, 접촉과 섭식은 28%의 사충률을 확인하였다. 이 결과로 배추좀나방에 비하여 살충 활성은 낮게 나타났고 파밤나방의 결과에서도 상청액보다 균체를 포함한 배양액에서 더 높은 살충 활성을 보였고, 섭식보다는 접촉에서 살충 활성이 높았으며, 접촉과 섭식을 함께 처리하였을 때 높은 사충률을 나타냈다.
- 반면에 균체가 포함된 배양액 전부를 처리하였을 때, 접촉은 20%, 섭식은 8%, 접촉과 섭식은 28%의 사충률을 확인하였다. 이 결과로 배추좀나방에 비하여 살충 활성은 낮게 나타났고 파밤나방의 결과에서도 상청액보다 균체를 포함한 배양액에서 더 높은 살충 활성을 보였고, 섭식보다는 접촉에서 살충 활성이 높았으며, 접촉과 섭식을 함께 처리하였을 때 높은 사충률을 나타냈다.
- 0%의 사충률로 나타냈다. 이 결과에서도 chitin 배양액은 LB 배양액에서와 마찬가지로 배양액을 접촉과 섭식을 함께 처리하였을 때 사충률이 가장 높았으며, LB 배양액보다 chitin 배양액에서 26% 인데 반하여 36%로 사충률이 약간 높았다. 이러한 결과로서 균체는 exotoxin으로 판단되나 균체도 지속적으로 독소물질을 만들어 내고 있다는 증거로 판단할 수 있는 결과이다.
- marcescens가 생산하는 hydrolytic enzymes인 proteases와 chitinase는 곤충에 병원성을 보였다. 이 실험에서 사용한 S. marcescens 균주도 chitinase와 proteases를 생성하여 살충력을 갖는 것을 추측할 수 있었다.
- 이 결과에서도 chitin 배양액은 LB 배양액에서와 마찬가지로 배양액을 접촉과 섭식을 함께 처리하였을 때 사충률이 가장 높았으며, LB 배양액보다 chitin 배양액에서 26% 인데 반하여 36%로 사충률이 약간 높았다. 이러한 결과로서 균체는 exotoxin으로 판단되나 균체도 지속적으로 독소물질을 만들어 내고 있다는 증거로 판단할 수 있는 결과이다.
- 죽은 배추좀나방에서 분리한 균주이므로 S. marcescens 균주의 최고 활성이 높은 10일간 배양액을 배추좀나방 3령 유충에 100배 희석액으로 처리하고 2일 후면 100%의 사충률을 보였다(Table 1). 또한 독성의 특성을 구명하기 위하여 배양액을 원심 분리 하고 나서 상청액만을 배추좀나방에 처리하였을 때 처리 7일 후에 배양 원액은 100% 사망하였고, 10배 희석액에서는 86.
- 처리방법은 손 스프레이를 사용하여 배양액 300 µl를 분무하였다. 처리 후 24시간 간격으로 치사여부를 확인하였으며, 충체가 빨간색으로 나타나거나 움직임이 없는 것을 죽은 것으로 판단하였다.
후속연구
- marcescens와 chitin을 함께 처리하였을 때 더 큰 효과를 나타낸다고 보고하였다. 이처럼 S. marcescens는 살충뿐만 아니라 어느 정도의 항균능력도 있는 것으로 확인되어 생물적방제에 사용할 수 있을 것으로 보인다.
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