[논문]차세대 염기서열 분석을 이용한 굴참나무(Quercus variabilis)의 microsatellite 마커 개발 및 특성 분석

백승훈; 이제완; 홍경낙; 이석우; 안지영; 이민우

doi:10.14578/jkfs.2016.105.2.186

차세대 염기서열 분석을 이용한 굴참나무(Quercus variabilis)의 microsatellite 마커 개발 및 특성 분석
Identification and Characterization of Polymorphic Microsatellite Loci using Next Generation Sequencing in Quercus variabilis 원문보기

韓國林學會誌 = Journal of Korean Forest Society, v.105 no.2, 2016년, pp.186 - 192

백승훈 (국립산림과학원 산림유전자원과) , 이제완 (국립산림과학원 산림유전자원과) , 홍경낙 (국립산림과학원 산림유전자원과) , 이석우 (국립산림과학원 산림유전자원과) , 안지영 (국립산림과학원 산림유전자원과) , 이민우 (국립산림과학원 산림유전자원과)

초록
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본 연구는 차세대 염기서열 분석방법을 이용하여 굴참나무의 microsatellite 마커를 개발하고 특성을 분석하기 위해 수행되었다. GS-FLX Titanium 차세대 염기서열 분석 장비를 이용하여 305,771개의 read를 얻었고, 117 Mbp의 데이터를 생산하였다. De novo assembly를 통하여 7,326개의 contig를 확보하였다. 크기가 500 bp 이상이 되는 contig는 2,921개로 나타났다. 그 중 microsatellite 영역을 포함하는 contig는 606개(20.75%)로 나타났으며, 총 microsatellite의 수는 911개로 확인되었다. 그 중 13개의 microsatellite 유전자좌에서 굴참나무 개체 간 다형성이 관찰되었다. 이들 microsatellite 유전자좌에 대하여 주왕산 집단에서 관찰된 유효 대립유전자수($A_e$)는 평균 4.966(2.439~7.515)로 나타났다. 평균 이형접합도 관측치($H_o$)와 평균 이형접합도 기대치($H_e$)는 각각 0.873(0.731~1.000)과 0.766(0.590~0.867)으로 나타났다. 다형성이 관찰된 모든 microsatellite 유전자좌에서 null 대립유전자는 관찰되지 않았으며, 마커 간 연관불평형은 나타나지 않았다. 따라서 본 연구에서 개발된 13개의 microsatellite 마커는 굴참나무 집단의 유전변이 분석에 유용할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to develop microsatellite markers in Quercus variabilis using next generation sequencing. A total of 305,771 reads (384 bp on average) were generated on a Roche GS-FLX system, yielding 117 Mbp of sequences. The de novo assembly resulted in 7,346 contigs. A total of 606 contigs (20.75%) including 911 microsatellite loci were derived from the 2,921 contigs longer than 500 bp. A total of 180 primer sets were designed from the 911 microsatellite loci and screened in eight Q. variabilis individual trees sampled from a natural stand to obtain polymorphic loci. As a result, a total of thirteen polymorphic microsatellite loci were selected and used for estimating population genetic parameters in the 54 individual trees. The mean number of effective alleles was 4.996 ranging from 2.439 to 7.515. The observed heterozygosity and the expected heterozygosity ranged between 0.731 and 1.000 with an average of 0.873 and from 0.590 to 0.867 with an average of 0.766, respectively. Null alleles were not detected in all loci. No significant linkage disequilibrium was detected after Bonferroni correction in all loci. In the near future, these novel polymorphic microsatellite markers will be used to study population and conservation genetics of Q. variabilis of Korea in more detail.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 굴참나무 유전변이 분석을 위한 microsatellite 마커를 개발하기 위하여, NGS를 이용하여 굴참나무의 염기서열 정보를 확보하고, 염기서열 정보로부터 microsatellite 영역을 탐색하였으며, 이들 영역에서의 다형성 탐색을 위한 특이적인 마커를 개발하고 유전적인 특성을 분석하였다.

대상 데이터

Microsatellite 마커 개발에 필요한 굴참나무의 염기서열 정보를 얻기 위하여 천연기념물 271호로 지정된 ‘신림동 굴참나무’로부터 DNA를 추출하였다. DNA 추출은 DNA 추출 키트(DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Germany)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다.

데이터처리

다형성이 확인된 유전자좌에 대하여 주왕산 지역의 굴참나무 집단에서 채취된 54개체를 대상으로 PCR분석을 수행하였으며, 분석 조건은 위와 동일하였다. 굴참나무 집단에서 분석된 SSR 증폭 결과에 따라 GenAlEx(v 6.5; Peakall and Smouse, 2006)프로그램을 이용하여 각 유전자좌별 대립유전자수(A), 유효 대립유전자수(A_e), 이형접합도 관측치(H_o), 이형접합도 기대치(H_e), 고정지수(F), polymorphism information content(PIC)를 계산하였다. Null 대립유전자의 존재는 MICRO-CHECKER (v 2.

성능/효과

본 연구는 국내 굴참나무의 유전변이 분석을 위한 microsatellite 마커를 개발하고자 차세대 염기서열 분석 (NGS)을 수행하여 염기서열을 확보하였다. De novo assembly를 통하여 확보한 염기서열에서 직접 microsatellite 를 추출하는 방법을 통하여 180개의 후보 microsatellite 마 커에서 13개의 다형성 마커를 개발하였다. 이들 마커를 주 왕산 굴참나무 집단에 적용한 결과 충분한 다형성이 나타 났으며, null 대립유전자와 연관불평형성이 나타나지 않아 굴참나무 집단의 유전변이 분석에 유용한 것으로 확인되었다.
De novo assembly를 통하여 확보한 염기서열에서 직접 microsatellite 를 추출하는 방법을 통하여 180개의 후보 microsatellite 마 커에서 13개의 다형성 마커를 개발하였다. 이들 마커를 주 왕산 굴참나무 집단에 적용한 결과 충분한 다형성이 나타 났으며, null 대립유전자와 연관불평형성이 나타나지 않아 굴참나무 집단의 유전변이 분석에 유용한 것으로 확인되었다.

후속연구

근연종에서 개발 된 염기서열 정보와 마커를 이용하는 방법이 대안이 될 수 있으나, 근연관계의 정도에 따라 직접 활용이 어려운 경우가 많다. 따라서 국내 분포하는 자생수종의 유전자원 보존을 위하여 보존 대상 수종의 충분한 DNA 마커를 개발할 필요가 있으며, 이를 위하여 차세대 염기서열 분석 등의 관련 연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	산림유전자원이란?	산림유전자원은 산림에 존재하는 현재 또는 미래의 경 제적 가치를 갖는 생물자원을 의미한다. 산림유전자원의 보존은 산림 생태계를 구성하는 생물 종이 지속적으로 세 대를 거듭하여 진화적 동력을 유지하고, 생물종으로서의 영속성을 지속하기 위한 측면에서 매우 중요한 의미를 갖 는다.
	근연종의 염 기서열 정보가 유연관계에 따라 적합하지 않은 이유는?	그러나 근연종의 염 기서열 정보는 유연관계에 따라 적합하지 않을 수 있다. EST 정보를 이용하는 경우 microsatellite 영역을 증폭하기 위한 primer 제작 시 전사 과정에 포함되지 않은 intron 영 역을 고려하지 못하기 때문에 PCR과정에서 목표한 microsatellite 영역이 잘 증폭되지 않는 경우가 발생할 수 있으며, 발현 부위에 해당하므로 전체 유전체 중 일부 영 역에 편중될 가능성이 있다. Probe를 이용한 selective hybridization protocol 방법은 반복서열로 구성된 probe에 따라 제한된 microsatellite 정보만을 확보할 수 있고, 개발 절차가 복잡한 단점이 있다. 또한, 근연종에서 이미 개발 된 마커를 이용하는 경우에도 종간 유연관계에 따라 활용 이 제한되는 단점이 있다. 최근에는 NGS(next generation sequencing)를 이용하여 마커 개발 대상종으로 부터 대량 의 염기서열 정보를 분석하고, microsatellite 영역을 직접 탐색함으로써 microsatellite 마커를 개발하는 방법이 이용 되고 있다(Gardner et al.
	RAPD와 ISSR의 단점은?	초기의 DNA 마커는 다 수의 유전자좌를 용이하게 확인할 수 있는 RAPD (randomly amplified polymorphic DNA), ISSR(inter-simple sequence repeat) 등의 우성 마커(dominant marker)가 주 로 이용되었다. 그러나 RAPD와 ISSR의 경우 재현성이 떨 어질 뿐만 아니라 우성마커의 특성상 2배체에서 우성 동 형접합체와 이형접합체 유전자형의 구분이 불가능한 단 점이 있다(Welsh and McClelland, 1990). 반면, microsatellite (또는 SSR; simple sequence repeat)는 생물체 genome상 에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism) 이 나타나는 공우성 마커이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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