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문제 정의
- 후)코티 졸">코티졸 상승과 MCH 1, 2mRNA 발현 연관성을 나타냈다. 따라서 무흑화 강도다리를 생산함에 있어 저조도(20 lux)가 환경적 요인으로 작용할 가능성을 확인하였다.
- 본 연구에서는 0 lux(darkness)와 20 lux(low light density)의 조도에 따른 강도다리의 성장과 흑화발현에 미치는 영향을 조사하였다. 빛은 어류의 성장과 생존에 중요한 역할을 한다(Trotter et al.
- 이에 본 연구에서는 강도다리의 무안측 흑화와 조도의 연관성을 확인하기 위해, 강도다리 양성시 자연환경 조도를 고려한 암흑(0 lux)과 저조도(20 lux)의 조건이 흑화발현 억제에 미치는 영향을 조사하여 체색발현 제어기술의 기초자료로 제공하고자 한다.
제안 방법
- qRT-PCR의 수행은 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, USA)을 이용하여 MCH1, MCH2 모두 95℃에서 15분간 initial denaturation하였으며, 95℃에서 15초 denaturation, 56℃에서 15초 annealing, 72℃에서 30초 elongation하여 45 cycles을 반응시켜 주었다.
- 후)강도다리치어의">강도다리 치어의 조도에 따른 무안측 흑화발현 영향에 대한 혈액의 생리생화학적 차이를 비교하기 위하여, 강도다리를 MS-222(Sigma, USA) 100ppm으로 마취한 후 헤파린처리 주사기를 이용하여 미부동맥으로부터 신속하게 채혈하였다. 이후 4℃, 12,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 혈장을 분리한 모든 qRT-PCR 반응은 Topreal™ qPCR 2X PreMIX SYBR Green (Enzynomics, Korea)을 이용하여 분석하였다.
- 후)상대 정량">상대정량 하였다. 모든 샘플은 2반복으로 측정하였다.
- 반응액은 1 ㎕의 cDNA를 주형으로 사용하고, 10 ㎕ Topreal™ qPCR 2XPreMIX SYBR Green, 1 ㎕ primer sets, N.F.W(Nuclease-free water)를 혼합하여 총 20 ㎕의 volume으로 실시하였다.
- qRT-PCR의 수행은 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, USA)을 이용하여 MCH1, MCH2 모두 95℃에서 15분간 initial denaturation하였으며, 95℃에서 15초 denaturation, 56℃에서 15초 annealing, 72℃에서 30초 elongation하여 45 cycles을 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 후에는 melting curve를 분석하였다. β-actin을 7 psu였다. 사료는 1일 2회(오전 9시,오후 2시) 만복으로 공급되었다. 사용된 사육환경은 수질측정기(YSI650 MDS, YSI incorporation, USA)를 이용하여 매일 측정하였으며, 실험기간 동안 평균 수온은 20.9±1.3℃, 염분은 31.1±0.7 psu였다.
- 성장도 측정은 실험 개시일로부터 30일 간격으로 실험구별 30마리씩 실시하였다. 전장은 실험 구간별 시료의 뇌 조직에서 MCH1,MCH2 mRNA 발현량을 알아보기 위해 합성된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR을 실시하였다. MCH1과 MCH2 primer는 Kang and Kim (2013)의 연구에 사용되어진 서열을 바탕으로 합성하였다[Table 1].
- 실험구별 무안측 흑화면적률을 조사하기 위해 0, 30, 60일에 실험구별 강도다리 30마리씩 2반복으로 MS-222(Sigma, USA)를 이용하여 100ppm으로 마취 시킨 후 무안측면을 디지털 카메라로 촬영한 뒤 컴퓨터 영상분석시스템(MoticImages Plus 2.0 KSE, China)을 통해 흑화면적률 (흑화부위 면적/무안측 총면적)×100%를 산정하였다.
- 후)실험 구별">실험구별 조도는 조도계(DX-200, INS, Chinese Taipei)를 사용하여 수표면 위에서 측정하였다. 사육수는 실험어는 실험구별 흑화가 진행되지 않은 강도다리 치어 50마리씩(0 lux : 9.2±0.1 cm, 12.5±0.3g, 20 lux : 9.3±0.1 cm, 체중 12.4±0.3 g) 사용하였으며, 조도 0 lux와 20 lux의 2개 실험구를 설정하여 수조바닥이 편평한 FRP수조(1 m3)에서 60일간 2반복으로 사육하였다.
- 후)막기 위해">막기위해 RQ1 RNase free DNase (Promega, USA)를 처리하였다. 이 total RNA (1㎍)와 M-MLV (Moloney murine leukemia virus) reverse transcriptase(Promega), oligo (dT)15 primer (Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 후)실험 구별">실험구별 30마리씩 실시하였다. 전장은 버니어캘리퍼스를 이용해서 1 mm 단위까지 계측했고, 체중은 전자저울을 사용하여 0.01 g까지 측정하였다. 실험구별 무안측 흑화면적률을 조사하기 위해 0, 30, 60일에 조도는 외부의 빛이 차단된 실내에 인공조명을 이용하여 20 lux를 유지하였고, 1.5 m × 1.5 m의 차광막을 사용하여 빛을 완전 차단하여 0 lux 실험을 진행하였다.
- ,USA)를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA는 genomic DNA 오염을 막기위해 RQ1 RNase free DNase (Promega, USA)를 처리하였다. 이 total RNA (1㎍)와 M-MLV (Moloney murine leukemia virus) reverse transcriptase(Promega), oligo (dT)15 primer (Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 후)흑화면적률(흑화부위">흑화면적률 (흑화부위 면적/무안측 총면적)×100%를 산정하였다. 측정된 개체별 무안측 흑화면적률을 바탕으로 무안측 흑화면적률을 보인 개체를 흑화로 구분하여, 실험구별 흑화개체율을 계산하였다.
- 후)후-74℃에">후 -74℃에 보관하면서 분석하였다. 치어의 치사 혈액채취량을 고려하여 3마리 pooled sample한 실험군별 8개 혈장을 FUJI DRI-CHEM3500i (Fujifilm, Japan)에서 전용 분석 kit 슬라이드를 사용하여 글루코즈(glucose)를 분석하였다. 혈장 코티졸은 cortisol EIA kit (Oxford, USA)를 사용하여 효소면역분석법(enzyme immunoassay, EIA)으로 측정하였다.
대상 데이터
- 후)2시)만복으로">2시) 만복으로 공급되었다. 사용된 강도다리사료는 상업용 넙치 EP 부상사료로, 입자 크기는 1.5~1.6 mm였다.
데이터처리
- 각 실험결과로부터 얻어진 자료값(mean±S.E.M)에 대한 유의성 검정은 SPSS 19.0을 이용하였으며, 혈액분석 및 MCH 분석은 비모수적 방법인 Mann-Whitney U-test를 통해 검증하였고, 성장과 흑화율은 모수적 방법인 Students t-test를 실시하였다(P=0.05).
이론/모형
- β-actin을 참조유전자로 사용하였으며, 2-ΔΔCt 방법(Livak and Schmittgen, 2001)을 이용하여 상대정량 하였다.
- 후)뇌조직에서">뇌 조직에서 MCH1,MCH2 mRNA 발현량을 알아보기 위해 합성된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR을 실시하였다. MCH1과 MCH2 primer는 Kang and Kim (2013)의 연구에 사용되어진 서열을 바탕으로 합성하였다[Table 1]. 모든 qRT-PCR 반응은 Topreal™ qPCR 2X PreMIX SYBR Green (Enzynomics, Korea)을 이용하여 분석하였다.
- 실험 종료 시 실험구별 5마리의 강도다리 뇌조직으로부터 AGPC (acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction)법에 근거한 TRI RegentⓇ (Molecular Research Center, Inc.,USA)를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA는 genomic DNA 오염을 후)혈액 채취량을">혈액채취량을 고려하여 3마리 pooled sample한 실험군별 8개 혈장을 FUJI DRI-CHEM3500i (Fujifilm, Japan)에서 전용 분석 kit 슬라이드를 사용하여 글루코즈(glucose)를 분석하였다. 혈장 코티졸은 cortisol EIA kit (Oxford, USA)를 사용하여 효소면역분석법(enzyme immunoassay, EIA)으로 측정하였다. 혈장 100 ㎕에 ethyl ether를 사용하여 코티졸을 추출하고, 유기상(organic phase)을 분리하여 N2가스로 증발시켰다.
성능/효과
- 0 lux와 20 lux 조도별 흑화면적률을 30일 간격으로 측정한 결과 심험 개시 시 0%에서 30일째에 0 lux 실험구는 1.2±0.1%, 20 lux는 0.5±0.02%로 0 lux에서 20 lux보다 유의하게 높은 흑화면적률을 나타냈다.
- MCH 1은 0 lux의 0.47±0.04보다 20 lux에서 0.65±0.05로 유의하게 높은 수치를 나타내었고, MCH 2 역시 0 lux의 0.40±0.03보다 20 lux에서 0.52±0.04로 유의하게 높아, MCH 1, 2 모두 20 lux에서 높은 발현을 보였다([Fig. 4]).
- 후)강도다리치어">강도다리 치어 사육에 있어서 0 lux와 20 lux를 비교해 본 결과, 보다 높은 성장효과를 나타내는 조도는 0 lux였다. 하지만 0 lux에 비해 20lux의 저조도에서 무안측 흑화 발현을 보다 효과적으로 억제하였고, 또한 60일째에도 0 lux의 흑화면적률은 1.5±0.1%로 20 lux의 0.6±0.1%보다 유의하게 높았다.
- 후)흑화 발현과">흑화발현과 비례적으로 상승하는 경향을 보였다. 또한 60일차에는 0 lux가 20 lux보다 높은 수치를 보여 20 lux에 비해 0lux의 스트레스가 더 높은 것으로 나타났고, 0lux의 흑화면적률과 흑화개체율이 코티졸 상승과 유사한 경향을 보여, 0 lux의 암흑조건이 스트레스로 작용하여 흑화를 더 촉진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 후)또 한">또한 가자미목 어류의 정상적인 색소 발달에 빛이 중요한 역할을 할 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서도 조도에 따른 흑화발현을 비교하였을 때, 30일과 60일에 20 lux에 비해 0 lux에서 흑화개체율과 흑화면적률 모두 유의하게 높게 나타나 조도의 영향을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 결과는 자연계와 사육환경이 다른 일반 양식시설은 어류에게 스트레스로 작용(Barton and Iwama, 후)뇌조직">뇌 조직 내 MCH-immunoreactive cell의 수가 증가하여 노랑가자미의 무안측 흑화 현상을 완화시킬 수 있다는 결과를 보여주었다. 이처럼 MCH가 무안측 흑화와 관련 있다는 점을 고려해 보았을 때, 30, 60일에 0 lux에서 유의하게 증가하는 흑화와 반비례 경향을 보이며 60일차에는 MCH의 발현 수치가 유의하게 낮음으로 조도에 의한 MCH 1, 2 유전자와 흑화 발현에 관한 연관성을 확인할 수 있었다. 이 결과는 가자미목 어류에서 체중 또한 전장과 유사한 결과를 나타냈고, 실험 개시 시 0 lux 12.5±0.3 g, 20lux 12.4±0.3 g에서 실험 종료 시 0 lux는 17.0±0.8 g으로 20 lux의 13.9±0.6 g 보다 유의하게 높게 나타났다([Fig. 1]).
- 후)성장 효과를">성장효과를 나타내는 조도는 0 lux였다. 하지만 0 lux에 비해 20lux의 저조도에서 무안측 흑화 발현을 보다 효과적으로 억제하였고, 코티졸 상승과 MCH 1, 2mRNA 발현 연관성을 나타냈다. 따라서 무흑화 강도다리를 생산함에 있어 저조도(20 lux)가 환경적 요인으로 작용할 가능성을 확인하였다.
- 흑화개체율은 30일째에 0lux(50±1.2%)가 20 lux(29.3±1.2%) 보다 유의하게 높았다.
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