LPS로 유도된 RAW 264.7 세포와 마우스 귀 조직에 대한 주름까막살 에탄올 추출물의 항염증 효과 Anti-Inflammatory Effect of Ethanol Extract from Grateloupia crispata on Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Responses in RAW 264.7 Cells and Mice Ears원문보기
본 연구는 해조류 중에서도 홍조류인 주름까막살 에탄올 추출물(GCEE)의 항염증 효과를 확인하기 위한 실험으로 proinflammatory cytokines의 분비량 및 iNOS, COX-2, $NF-{\kappa}B$와 MAPKs의 발현량을 관찰하고 마우스모델에서 항염증 효과를 확인하였다. GCEE가 세포 생존율에 있어 독성을 나타내지 않음을 MTT assay를 통해 확인한 후 같은 농도로 추후실험을 진행하였다. NO 분비량이 GCEE에 의해 농도 의존적으로 감소하였으며 전염증성 매개물질인 사이토카인(IL-6, $TNF-{\alpha}$ 및 $IL-1{\beta}$)의 분비량 또한 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과가 전염증성 매개인자의 전사인자인 $NF-{\kappa}B$와 MAPKs 경로에 의한 것인지 확인하기 위하여 발현량을 관찰한 결과, GCEE가 LPS 처리로 현저히 증가한 염증 관련 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 농도 의존적으로 유의성 있게 억제하였고 전사인자인 $NF-{\kappa}B$ 및 MAPKs의 발현을 억제하였다. 또한, GCEE는 croton oil로 부종을 유발한 마우스모델에서 귀 부종 억제 효과를 나타내었고 250 mg/kg 농도에서 조직의 경피 및 진피 두께의 발달을 prednisolone 50 mg/kg 처리구와 유사한 정도까지 현저히 억제하고 염증성 세포인 mast cell의 침윤 억제 효과도 확인하였다. 이를 통해 주름까막살 에탄올 추출물은 염증반응의 전사인자인 $NF-{\kappa}B$와 MAPKs의 발현을 조절함으로써 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하고 그에 따라 전염증성 매 개인자인 NO, IL-6, $TNF-{\alpha}$ 및 $IL-1{\beta}$의 분비를 억제하여 항염증 활성을 가지는 것을 확인하였으며, 이 결과를 종합해 볼 때 주름까막살 에탄올 추출물이 염증 치료제의 소재로 이용될 가치가 충분할 것으로 생각한다.
본 연구는 해조류 중에서도 홍조류인 주름까막살 에탄올 추출물(GCEE)의 항염증 효과를 확인하기 위한 실험으로 proinflammatory cytokines의 분비량 및 iNOS, COX-2, $NF-{\kappa}B$와 MAPKs의 발현량을 관찰하고 마우스모델에서 항염증 효과를 확인하였다. GCEE가 세포 생존율에 있어 독성을 나타내지 않음을 MTT assay를 통해 확인한 후 같은 농도로 추후실험을 진행하였다. NO 분비량이 GCEE에 의해 농도 의존적으로 감소하였으며 전염증성 매개물질인 사이토카인(IL-6, $TNF-{\alpha}$ 및 $IL-1{\beta}$)의 분비량 또한 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과가 전염증성 매개인자의 전사인자인 $NF-{\kappa}B$와 MAPKs 경로에 의한 것인지 확인하기 위하여 발현량을 관찰한 결과, GCEE가 LPS 처리로 현저히 증가한 염증 관련 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 농도 의존적으로 유의성 있게 억제하였고 전사인자인 $NF-{\kappa}B$ 및 MAPKs의 발현을 억제하였다. 또한, GCEE는 croton oil로 부종을 유발한 마우스모델에서 귀 부종 억제 효과를 나타내었고 250 mg/kg 농도에서 조직의 경피 및 진피 두께의 발달을 prednisolone 50 mg/kg 처리구와 유사한 정도까지 현저히 억제하고 염증성 세포인 mast cell의 침윤 억제 효과도 확인하였다. 이를 통해 주름까막살 에탄올 추출물은 염증반응의 전사인자인 $NF-{\kappa}B$와 MAPKs의 발현을 조절함으로써 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하고 그에 따라 전염증성 매 개인자인 NO, IL-6, $TNF-{\alpha}$ 및 $IL-1{\beta}$의 분비를 억제하여 항염증 활성을 가지는 것을 확인하였으며, 이 결과를 종합해 볼 때 주름까막살 에탄올 추출물이 염증 치료제의 소재로 이용될 가치가 충분할 것으로 생각한다.
The anti-inflammatory effects of ethanol extract from Grateloupia crispata (GCEE) were investigated in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated murine macrophages. Anti-inflammatory effects were detected by enzyme-linked immunosorbent assay, Western blotting, and immunohistochemistry. There was no cytoto...
The anti-inflammatory effects of ethanol extract from Grateloupia crispata (GCEE) were investigated in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated murine macrophages. Anti-inflammatory effects were detected by enzyme-linked immunosorbent assay, Western blotting, and immunohistochemistry. There was no cytotoxic effect on proliferation of macrophages treated with GCEE compared to the control. GCEE significantly inhibited production of pro-inflammatory cytokines [interleukin (IL)-6, tumor necrosis $factor-{\alpha}$, and $IL-1{\beta}$] as well as nitric oxide in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. In addition, GCEE suppressed expression of inducible nitric oxide synthase, cyclooxygenase-2, and nuclear $factor-{\kappa}B$ in a dose-dependent manner. GCEE significantly reduced activation of mitogen-activated protein kinases. In the in vivo test, evaluation of anti-inflammatory activity of GCEE was performed using croton oil-induced ear edema in ICR mice. Oral administration of 10 mg/kg to 250 mg/kg of GCEE significantly reduced ear edema in a dose-dependent manner compared to croton oil-induced mice. Moreover, GCEE reduced ear thickness and the number of mast cells compared to croton oil-induced mice in the histological analysis. These data suggest that GCEE could be used as a potential source for anti-inflammatory agents.
The anti-inflammatory effects of ethanol extract from Grateloupia crispata (GCEE) were investigated in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated murine macrophages. Anti-inflammatory effects were detected by enzyme-linked immunosorbent assay, Western blotting, and immunohistochemistry. There was no cytotoxic effect on proliferation of macrophages treated with GCEE compared to the control. GCEE significantly inhibited production of pro-inflammatory cytokines [interleukin (IL)-6, tumor necrosis $factor-{\alpha}$, and $IL-1{\beta}$] as well as nitric oxide in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. In addition, GCEE suppressed expression of inducible nitric oxide synthase, cyclooxygenase-2, and nuclear $factor-{\kappa}B$ in a dose-dependent manner. GCEE significantly reduced activation of mitogen-activated protein kinases. In the in vivo test, evaluation of anti-inflammatory activity of GCEE was performed using croton oil-induced ear edema in ICR mice. Oral administration of 10 mg/kg to 250 mg/kg of GCEE significantly reduced ear edema in a dose-dependent manner compared to croton oil-induced mice. Moreover, GCEE reduced ear thickness and the number of mast cells compared to croton oil-induced mice in the histological analysis. These data suggest that GCEE could be used as a potential source for anti-inflammatory agents.
다른 홍조류의 생리활성에 관한 연구(15-17)에 비해 주름까막살에 관한 생리활성 연구는 전혀 없는 실정이다. 본 연구는 주름까막살 에탄올 추출물이 LPS로 자극한 대식세포에서 NF-κB와 MAPKs pathway의 전사 활성 저해를 통해 나타내는 항염증 효과를 연구하고 마우스모델에서의 항염증 효과를 관찰함으로써 주름까막살 에탄올 추출물을 천연염증 치료제로서 개발의 발판을 마련하고자 하였다.
제안 방법
GCEE가 세포질 내 생성되는 inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2) 및 NF-κB의 발현량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RAW 264.7세포를 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 PBS로 세척한 후, Sheeba와 Asha(20)의 방법에 따라 cytosol lysis buffer[50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES, pH 7.
대상 데이터
연화리에서 2014년도에 채취한 주름까막살은 담수로 여러 차례 깨끗하게 수세한 후 자연건조 하였다. 그 후 동결건조하여 분말화하였으며 진공 포장상태로 -20℃에서 저장하며 실험에 사용하였다.
데이터처리
모든 실험 결과에 대한 유의차 검정은 SAS software(ver. 9.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)에서 평균값을 분산분석한 후, Duncan's multiple range test 법에 따라 P<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
GCEE의 항염증 효과를 in vivo 상에서 알아보기 위하여 Kim 등(23)과 Saraiva 등(24)의 방법으로 귀 부종 측정 실험을 하였다. 생후 8주령의 수컷, ICR 마우스에 GCEE를 2% Tween 80을 용매로 하여 10, 50 및 250 mg/kg body weight 농도로 제조하고 대조 약물로 사용한 prednisolone을 10 및 50 mg/kg body weight 농도로 하여 200 μL씩 단회 경구 투여하고 한 시간 후 오른쪽 귀에 2.
Griess 반응(19)을 이용하여 배양액 내의 nitrite 농도를 측정하였다. RAW 264.
성능/효과
1 μg/mL로 GCEE를 처리하였을 때 인산화를 30% 이상 억제하였으며, 100μg/mL 처리구에서는 58% 이상의 억제 효과를 나타내어 뛰어난 항염증 효과를 나타낸 것을 확인하였다. 따라서 GCEE는 MAPK family인 ERK, JNK, p38의 신호전달을 억제하여 대식세포에서 항염증 작용을 하는 것을 유추할 수 있었다.
이는 홍조류인 가락진두발이 NF-κB, iNOS 및 COX-2의 분비를 농도 의존적으로 저해한 연구 결과와 유사하다(10). 이 결과들은 iNOS와 COX-2 효소의 억제를 통해 NO와 사이토카인의 분비를 억제하였으며 IκBα의 발현 감소로 자유로워진 NF-κB가 핵으로 전위되는 과정을 GCEE가 효과적으로 억제하여 항염증 효과를 나타내고 있음을 의미한다.
IL-1β 또한 LPS 처리 때문에 급격히 증가한 분비량을 50 μg/mL 농도의 GCEE 처리로 68% 이상 억제하는 결과를 확인하였다. 이러한 결과를 종합해볼 때 GCEE는 pro-inflammatory cytokine인 IL-6, TNF-α 및 IL-1β 분비 억제를 통해 항염증 효과를 나타냄을 유추할 수 있다.
이는 홍조류인 가락진두발(10)과 꽃지누아리(11) 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 NO 분비량을 억제한 연구 결과와 유사함을 확인하였다. 이를 통해 주름까막살 에탄올 추출물은 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 NO의 생성 억제에 효과를 나타내는 것으로 판단된다.
후속연구
또한, GCEE가 toluidine-blue 염색한 진피에서의 mast cell의 침윤을 눈에 띄게 억제하였음을 확인하였다. In vitro 상에서 확인한 GCEE의 항염증 효과를 in vivo 상에서 확인한 결과, 염증반응인 부종을 완화하고 mast cell의 침윤을 효과적으로 억제한 것으로 보아 항염증제로 이용할 가능성이 충분한 천연물로 생각한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
주름까막살의 외형적 특징은?
한편 해조류는 일상생활에서 섭취 가능한 천연물로 생리활성에 관한 연구가 많이 이루어지고 있다(12,13). 주름까막살은 지누아리과 홍조류로 한국의 남해안 및 제주도 연안에 주로 서식하며 적갈색의 연골질로 띠 모양에 두 갈래로 가지를 내고 가장자리에 작은 가지를 내는 특징이 있다(14). 다른 홍조류의 생리활성에 관한 연구(15-17)에 비해 주름까막살에 관한 생리활성 연구는 전혀 없는 실정이다.
염증반응은 어떤 만성질환의 근본적인 병태생리학적 기전으로 알려져 있는가?
외부자극에 대응하기 위해 생체에서 일어나는 정상적인 방어 기작인 염증반응은 화학적이나 물리적인 조직 손상과 병원체의 감염 등으로부터 인체를 보호하기 위해 일어난다. 이는 암이나 신경변성질환, 심혈관질환, 관절염 등의 많은 만성질환에서 근본적인 병태생리학적 기전으로 알려져 있다(1). 염증반응에는 다양한 면역세포가 관여하는데 그중 대식세포는 혈액 내 존재하며 분화된 형태로 인체의 모든 조직 내에 분포하고 있다.
LPS에 의해 촉진된 염증반응이 분비하게 만드는 염증 매개 물질은?
대표적으로 염증 유발물질로 알려진 그람음성균의 외막성분인 lipopolysaccharide(LPS)에 의해 전염증성 매개물질들의 분비를 촉진하고 세포 내 염증반응의 신호전달 경로 또한 다양한 연구를 통해 알려져 있다(2). LPS에 의해 촉진된 염증반응은 interleukin(IL)-6, tumor necrosis factorα(TNF-α) 및 IL-1β와 같은 전염증성 매개물질 및 nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE2) 등의 염증 매개물질을 분비시킨다(3,4). 신호전달 경로에서 nuclear factor kappa B(NF-κB)와 extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2), c-Jun NH2-terminal kinase(JNK), p38 kinases(p38)와 같은 mitogen-activated protein kinases(MAPKs)에 의해 전염증성 매개물질인 사이토카인의 분비가 촉진된다(5).
참고문헌 (41)
Trowbridge HO, Emling RC, Fornatora M. 1997. Inflammation. A review of the process. Implant Dent 6: 238.
Higuchi M, Higashi N, Taki H, Osawa T. 1990. Cytolytic mechanisms of activated macrophages. Tumor necrosis factor and L-arginine-dependent mechanisms act synergistically as the major cytolytic mechanisms of activated macrophages. J Immunol 144: 1425-1431.
Yi HS, Heo SK, Yun HJ, Choi JW, Jung JH, Park SD. 2008. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of Draconis Resina in mouse macrophage cells. Kor J Herbol 23: 179-192.
Hinz B, Brune K. 2002. Cyclooxygenase-2 - 10 years later. J Pharmacol Exp Ther 300: 367-375.
Choi C, Cho H, Park J, Cho C, Song Y. 2003. Suppressive effects of genistein on oxidative stress and $NF{\kappa}B$ activation in RAW 264.7 macrophages. Biosci Biotechnol Biochem 67: 1916-1922.
Kim MJ, Bae NY, Kim KBWR, Park JH, Park SH, Jang MR, Ahn DH. 2016. Anti-inflammatory effect of Chondrus nipponicus Yendo ethanol extract on lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in RAW 264.7 cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 45: 194-201.
Kim MJ, Bae NY, Kim KBWR, Park JH, Park SH, Choi JS, Ahn DH. 2016. Anti-inflammatory effect of Grateloupia imbricata Holmes ethanol extract on LPS-induced RAW 264.7 cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 45: 181-187.
Jeong DH, Ahn NK, Choi YU, Park JH, Bae NY, Park SH, Kim KBWR, Ahn DH. 2015. Inhibitory effect of Sargassum fulvellum water extract on 2,4-dinitochlorobenzene-induced atopic dermatitis-like skin lesions in mice. Microbiol Biotechnol Lett 43: 150-157.
Park JH, Bae NY, Park SH, Kim MJ, Kim KBWR, Choi JS, Ahn DH. 2015. Antioxidant effect of Sargassum coreanum root and stem extracts. Korean Soc Biotechnol Bioeng J 30: 155-160.
Lee YP. 2008. Marine algae of Jeju. Academy Publishing Co., Seoul, Korea. p 381.
Bae NY, Kim MJ, Kim KBWR, Ahn NK, Choi YU, Park JH, Park SH, Ahn DH. 2015. Anti-inflammatory effect of ethanol extract from Grateloupia elliptica Holmes on lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in RAW 264.7 cells and mice ears. J Korean Soc Food Sci Nutr 44: 1128-1136.
Park YM, Won JH, Yun KJ, Ryu JH, Han YN, Choi SK, Lee KT. 2006. Preventive effect of Ginkgo biloba extract (GBB) on the lipopolysaccharide-induced expressions of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 via suppression of nuclear factor- ${\kappa}B$ in RAW 264.7 cells. Biol Pharm Bull 29: 985-990.
Yee ST, Jeong YR, Ha MH, Kim SH, Byun MW, Jo SK. 2000. Induction of nitric oxide and $TNF-{\alpha}$ by herbal plant extracts in mouse macrophages. J Korean Soc Food Sci Nutr 29: 342-348.
Sheeba MS, Asha VV. 2009. Cardiospermum halicacabum ethanol extract inhibits LPS induced COX-2, $TNF-{\alpha}$ and iNOS expression, which is mediated by $NF-{\kappa}B$ regulation, in RAW264.7 cells. J Ethnopharmacol 124: 39-44.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A 76: 4350-4354.
Kim DW, Chi YS, Son KH, Chang HW, Kim JS, Kang SS, Kim HP. 2002. Effects of sophoraflavanone G, a prenylated flavonoid from Sophora flavescens, on cyclooxygenase-2 and in vivo inflammatory response. Arch Pharm Res 25: 329-335.
Lee HJ, Lee CW, Choi MS, Son DJ, Hong JT. 2006. Effects of esthetic essential oils on LPS-induced nitric oxide generation in murine macrophage RAW 264.7 cells. J Soc Cosmet Sci Korea 32: 111-116.
Knowles RG, Moncada S. 1992. Nitric oxide as a signal in blood vessels. Trends Biochem Sci 17: 399-402.
Seo SW. 2015. The anti-inflammatory effect of Portulaca oleracea 70% EtOH extracts on lipopolysaccharide-induced inflammatory response in RAW 264.7 cells. Kor J Herbol 30: 33-38.
Cassim B, Mody G, Bhoola K. 2002. Kallikrein cascade and cytokines in inflamed joints. Pharmacol Ther 94: 1-34.
Sato T, Nakajima H, Fujio K, Mori Y. 1997. Enhancement of prostaglandin $E_2$ production by epidermal growth factor requires the coordinate activation of cytosolic phospholipase $A_2$ and cyclooxygenase 2 in human squamous carcinoma A431 cells. Prostaglandins 53: 355-369.
Huang M, Stolina M, Sharma S, Mao JT, Zhu L, Miller PW, Wollman J, Herschman H, Dubinett SM. 1998. Non-small cell lung cancer cyclooxygenase-2-dependent regulation of cytokine balance in lymphocytes and macrophage: up-regulation of interleukin 10 and down-regulation of interleukin 12 production. Cancer Res 58: 1208-1216.
Ruegg C, Zaric J, Stupp R. 2003. Non steroidal anti-inflammatory drugs and COX-2 inhibitors as anti-cancer therapeutics: hypes, hopes and reality. Ann Med 35: 476-487.
Seo UK, Lee JI, Park JH, Park YK. 2008. The ethylacetate extract of North Kangwhal (Ostericum koreanum) attenuates the inflammatory responses in PMA/A23187-stimulated mast cells. Kor J Herbol 23: 81-89.
Towbin H, Pignat W, Wiesenberg I. 1995. Time-dependent cytokine production in the croton oil-induced mouse ear oedema and inhibition by prednisolone. Inflamm Res 44: S160-S161.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.