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문제 정의
- 본 시험은 안전식품인 우유단백질에서 분리되어 영유아 식품 등에 세계적으로 사용되고 있는 GMP 내 기본적으로 7%로 결합되어 있는 지표성분인 sialic acid의 함유량이 높게 제조한 23%-GNANA를 기능성 식품 원료 개발함에 최종 연구목표를 두었다. 시험물질은 23% sialic acid와 GMP 단백질로 구성(제품명: HELICOBACTROL-23)되어 있으며, ㈜한일바이오메드사(한국)에서 공여 받아 미생물복귀돌연변이시험을 실시하였다.
- 본 연구에서는 GMP 내 지표성분인 sialic acid를 식품소재로 활용성을 높이기 위하여, GMP 가수분해단백(23%-GNANA)을 미생물복귀돌연변이시험용 공시균주를 이용하여 GLP가이드라인 기준에 준하는 안전성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 GMP 내 지표성분인 sialic acid를 효소분리 시킴과 동시에 GMP 단백질원을 아미노산 형태로 가수분해함으로써 이들의 기능성을 동시에 제품개발에 활용하고자 하였다. 그러나, 인위적으로 원료 GMP의 변형 유발과 기능성 식품으로 개발을 목표로 하고 있기 때문에 시험물질의 안전성 평가는 필수적이다라고 할 수 있다.
제안 방법
- The result of evaluation conducted to evaluate the effect on increase & decrease of reverse mutation colonies by the addition of 23%-GNANA, a test substance, under the presence and absence conditions of metabolic activation system versus the solvent control group.
- typhimurium TA1537 균주는 9-AA를 80 μg/plate으로 양성대조물질을 처리하는 조건으로 실시하였다(Table 2).
- 표준균주별 정상 생장범위를 Sal. typhimurium TA98는 15~60cfu/plate, TA100는 60~200 cfu/plate, TA1535는 10~40 cfu/plate, TA1537는 5~20 cfu/plate 그리고 E. coli WP2uvrA 경우는 10~40 cfu/plate 범위 내에서 집락수를 나타내는 경우를 시험물질에 대하여 안전성을 보이는 정상범위로 평가하였다. 시험물질에 대한 복귀돌연변이 평가는 대사활성계 존재 유무에 관계없이 최소 1개 균주에서 플레이트 당 복귀된 집락 수에 있어서 1개 이상의 농도에서 재현성 있는 증가를 나타낼 때 양성으로 판정하였다
- 대사활성계 처리 및 미처리 조건에서 5,000 μg/plate를 최고농도로 설정하고, 공비 3으로 5단계의 농도군(0,61.7, 185, 556, 1,670, 5,000 μg/plate)을 적용하였다.
- 대사활성계미처리(S9mix-) 조건에서 양성대조물질은 2-AA를 공시균종에 따라 0.5~10 μg/plate 범위에서 농도 처리를 다르게 하였다.
- 미생물복귀돌연변이시험은 시험물질을 5단계의 농도군(0, 61.7, 185, 556, 1,670, 5,000 μg/plate)으로 하여 평가하였다.
- , Australia)을 구입하여 원료로 사용하였다. 시험물질 제조를 위하여, 정제수에 7%(w/v)되게 GMP를 용해시킨 후 효소 Alcalase 2.4FL(NovozymesCo., Denmark)를 기질 대비 0.24%(w/v)로 혼합하여 7시간(57℃) 동안 가수분해를 시켰다(Fig. 1). 그리고 가수분해 용액 2와 에탄올의 비율이 8이 되도록 혼합하였다.
- coli WP2uvrA 경우는 10~40 cfu/plate 범위 내에서 집락수를 나타내는 경우를 시험물질에 대하여 안전성을 보이는 정상범위로 평가하였다. 시험물질에 대한 복귀돌연변이 평가는 대사활성계 존재 유무에 관계없이 최소 1개 균주에서 플레이트 당 복귀된 집락 수에 있어서 1개 이상의 농도에서 재현성 있는 증가를 나타낼 때 양성으로 판정하였다
- 시험물질을 예비농도설정 시험결과를 적용하여 본 시험에서는 최고투여농도인 5,000 μg/plate를 최고농도로 설정하였다(Table 4).
- 양성대조물질처리에 따른 표준균주들에 대한 표준 감수성을 검정한 후, 본 시험을 위해 시험물질을 5,000 μg/plate를 최고농도로 하여 0, 312, 625, 1,250 그리고 2,500 μg/plate에서 모든 균주에서 유의한 생육저해가 없었기 때문에 이를 기준으로 본 시험은 5,000 μg/plate을 최고농도로 설정하였다(Table 4).
대상 데이터
- GMP는 sialic acid가 7%가 결합된 형태로 판매되는 NatraPep GMP(Murry Goulburn Co-Operative Co., Australia)을 구입하여 원료로 사용하였다. 시험물질 제조를 위하여, 정제수에 7%(w/v)되게 GMP를 용해시킨 후 효소 Alcalase 2.
- 그리고 가수분해 용액 2와 에탄올의 비율이 8이 되도록 혼합하였다. 그리고 에탄올 혼합에 따라 생성된 침전물을 제거한 후, 상등액만을 동결건조시켜 제조한 HELICOBACTROL 제품(23%-GNANA)을 한일바이오메드사(한국)로부터 공여 받아 시험물질로 사용하였다(Fig. 2).
- 대사활성계 처리(S9Mix+) 시 복귀돌연변이시험을 위하여, Sprague Dawley male rat에 유도물질인 Aroclor 1254을 도살 5일전 단회 복강투여 후 간조직을 적출 및 균질화한 후 －20℃에서 보관된 S9(MOLTOX사, USA)을 구입하여 시험에 사용하였다. S9 mixture의 조성은 Table 3과 같이 제조하였다.
- 시험물질은 23% sialic acid와 GMP 단백질로 구성(제품명: HELICOBACTROL-23)되어 있으며, ㈜한일바이오메드사(한국)에서 공여 받아 미생물복귀돌연변이시험을 실시하였다. 미생물에 대한 돌연변이 유발성 유무를 검색하기 위해 히스티딘 요구성 균주인 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 및 TA1537과 트립토판 요구성 균주인 Escherichia coli WP2uvrA를 이용하였다. 미생물복귀돌연변이시험은 시험물질을 5단계의 농도군(0, 61.
- 1). 시험물질 내 지표성분인 sialicacid의 분리 여부 및 함유량 검정을 위한 표준체 sialic acid는 Sigma-Aldrich사(A2090)을 구입하여 0.1 ppm(w/w), 1 ppm 및 10 ppm 되게 희석하여 분석간 표준용액으로 사용하였다.
- 본 시험은 안전식품인 우유단백질에서 분리되어 영유아 식품 등에 세계적으로 사용되고 있는 GMP 내 기본적으로 7%로 결합되어 있는 지표성분인 sialic acid의 함유량이 높게 제조한 23%-GNANA를 기능성 식품 원료 개발함에 최종 연구목표를 두었다. 시험물질은 23% sialic acid와 GMP 단백질로 구성(제품명: HELICOBACTROL-23)되어 있으며, ㈜한일바이오메드사(한국)에서 공여 받아 미생물복귀돌연변이시험을 실시하였다. 미생물에 대한 돌연변이 유발성 유무를 검색하기 위해 히스티딘 요구성 균주인 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 및 TA1537과 트립토판 요구성 균주인 Escherichia coli WP2uvrA를 이용하였다.
- 표준균주로 Salmonella typhimurium 계열의 돌연변이 균주인 TA98, TA100 및 TA1535, TA1537을 그리고 Escherichia coli의 돌연변이 균주인 WP2uvrA를 전체 시험 간 이용하였으며, MOLTOXTM(USA)로부터 구입하여 전체 시험 간 사용하였다.
- 표준균주별 감수성 평가를 위한 양성대조물질로서는 sodium azide(NaN3), 9-aminoacridine(9-AA), 4-nitroquinoline-N-oxide(4-NQO) 및 2-aminoanthracene(2-AA)와 용매로서는 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldricd Co., USA)를 사용하였다. 대사활성계미처리(S9mix-) 조건에서 양성대조물질은 2-AA를 공시균종에 따라 0.
이론/모형
- Plate 배지는 Top Agar와 Vogel-Bonner 최소 Glucose 한천배지를 Maron 및 Ames의 방법(1983)의 시험법에 준하여 제조 및 사용하였다.
- 3. Result of evaluation for separation and content of sialic acid in hydrolyzed whey protein (23%-GNANA), a test substance, vs. the standard sialic acid applying the HPLC analysis method. A: Non-enzymatically Modified GMP, B: Standard sialic acid (25 ppm), C: Result of sialic acid detection in 23%-GNANA.
- coli WP2uvrA는 복귀돌연변이 평가 시 염기치환형을 그리고 Sal. typhimuriumTA98과 TA1537의 경우는 Frameshiht형에 대한 평가를 실시하였다.
- 시험균주는 Maron 및 Ames의 방법(1983)에 따라 아미노산 요구성, UV 민감도, rfa 돌연변이 및 R-factor 유지 여부 등의 확인 시험을 수행하여 유전형질이 잘 유지되고 있음을 시험 전에 확인하였다.
- 시험물질 처리에 따른 미생물복귀돌연변이시험은 의약품 등의 독성시험기준(OECD test guideline(OECD), 2008; Schauer et al.,1984)와 OECD guideline for the testing of chemicals(Takahashiet al., 1992; Wang, 2009)에 준하여 Plate법으로 수행하였다.
성능/효과
- TA1535 균주는 허용범위인 32.0±4.58 cfu/plate에서 37.0±1.00 cfu/plate,WP2uvrA 균주는 31.0±1.00~36.7±0.58 cfu/plate, TA98 균주는 42.0±10.3~52.7±3.51 cfu/plate 그리고 TA1537는 최저 16.7±1.53cfu/plate에서 최대 17.3±1.53 cfus/plate 범위에서 콜로니가 출현하였다.
- 평가결과로서, 대사활성계 존재 유무와 관계없이 5균주 모두에서 시험물질의 각 농도에 의한 복귀돌연변이 유발원 양성기준인 콜로니 생성수치가 재현성 있는 증가를 나타내지 않았으며, 용량의존성도 확인되지 않았다. 결론적으로, 시험물질인 23%-GNANA의 식품첨가물로서 등록을 위하여 수행한 미생물돌연변이시험에서 안전성이 확인되었다.
- 본 연구에서도 미생물복귀돌연변이시험 결과에서 대사활성계 존재 유무에 관계없이 모든 균주는 모든 농도에서 재현성 있는 증가를 나타내지 않았으며, 용량의존성도 확인되지 않았음에 따라 GMP를 원료로 제조한 23%-GNANA는 복귀돌연변이 유발원이 아닌 것으로 판정되었다. 따라서, 본 시험의 목표인 안전식품인 GMP를 원료로 23% sialic acid를 분리 및 이를 고농도로 함유토록 제조된 시험물질은 단지 원료인 GMP 수준의 안전한 식품소재임이 확인되었다.
- 대사활성화계 처리의 경우도 시험군별 균수의 차이는 다소 있었지만, 역시 대사활성계 미처리시험 결과와 유사한 결과를 보였다. 따라서, 전체 표준균주에 시험물질인 23%-GNANA를 농도별로 처리 시 대사활성계미처리 및 처리조건에서 안전한 것으로 확인되었다(Table 5,Fig. 4).
- 그러나, 인위적으로 원료 GMP의 변형 유발과 기능성 식품으로 개발을 목표로 하고 있기 때문에 시험물질의 안전성 평가는 필수적이다라고 할 수 있다. 본 연구에서도 미생물복귀돌연변이시험 결과에서 대사활성계 존재 유무에 관계없이 모든 균주는 모든 농도에서 재현성 있는 증가를 나타내지 않았으며, 용량의존성도 확인되지 않았음에 따라 GMP를 원료로 제조한 23%-GNANA는 복귀돌연변이 유발원이 아닌 것으로 판정되었다. 따라서, 본 시험의 목표인 안전식품인 GMP를 원료로 23% sialic acid를 분리 및 이를 고농도로 함유토록 제조된 시험물질은 단지 원료인 GMP 수준의 안전한 식품소재임이 확인되었다.
- 시험물질 내 sialic acid의 분리 및 함유량을 HPLC 분석법을 적용하여 평가한 결과, GMP 내 결합되어 있던 sialic acid는 100% 효율로 분리되었으며, 23.6±1.34%의 sialic acid와 GMP 유래의 단백질로 구성되어 있었다(Fig. 3).
- 음성 대조군 및 동일한 5단계의 농도조건에서 대사활성계미처리 조건에서 균주별 생존콜로니 수치를 확인하여 보았더니, TA100 균주는 음성 대조구의 경우는 124±7.77 cfu/plate였는데, 시험물질 처리구의 경우는 최저 119±13.53 cfu/plate에서 최대 142±10.02 cfu/plate 범위에서 검출되었다.
- 53 cfus/plate 범위에서 콜로니가 출현하였다. 이러한 결과는 표준 균주별로 안전성과 관련한 허용 범위 내에서의 수치였으므로 시험물질은 농도와 상관없이 안전한 것으로 평가되었다. 대사활성화계 처리의 경우도 시험군별 균수의 차이는 다소 있었지만, 역시 대사활성계 미처리시험 결과와 유사한 결과를 보였다.
- 전체균주에 대하여 양성대조물질 처리를 통한 표준 감수성 확인한 결과, 대사활성계 처리의 경우 TA100, TA1535, WP2uvrA,TA98 및 TA1537 균주는 각각 393±19.7, 240±34.7, 248±26.2,355±33.6 그리고 143.3±25.3 colonies/plate이었고, 미처리의 경우는 381±44.6, 185±5.03, 292±23.0, 256±32.0 그리고 267±24.95cfu/plate의 수치를 보였는데, 사전 설정된 표준범위에 해당되었다.
- 7, 185, 556, 1,670, 5,000 μg/plate)으로 하여 평가하였다. 평가결과로서, 대사활성계 존재 유무와 관계없이 5균주 모두에서 시험물질의 각 농도에 의한 복귀돌연변이 유발원 양성기준인 콜로니 생성수치가 재현성 있는 증가를 나타내지 않았으며, 용량의존성도 확인되지 않았다. 결론적으로, 시험물질인 23%-GNANA의 식품첨가물로서 등록을 위하여 수행한 미생물돌연변이시험에서 안전성이 확인되었다.
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