Lactobacillus plantarum K-1 BR 유래 박테리오신의 여드름균에 의한 염증성 사이토카인 억제 효과 The Suppression of Inflammatory Cytokines Induced by Propionibacterium acnes Using Bacteriocin Isolated from Lactobacillus plantarum K-1 BR원문보기
본 실험은 유산균 유래의 박테리오신이 여드름균에 의한 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효능을 가지는지를 확인하기 위해 수행되었다. 본 실험을 위해 인간의 각질형성세포인 HaCaT 세포에 열처리한 여드름균인 P. acnes을 농도별로 처리하여 염증성 사이토카인인 TNF-α, IFN-γ, IL-8의 발현을 유도하였고, 여드름균과 박테리오신을 HaCaT 세포에 함께 처리하여 여드름균에 의해 증가된 사이토카인의 양이 박테리오신에 의해 어떻게 변화하는지를 확인하였다. P. acnes 균을 1×105, 1×106 그리고 1×107 CFU/ml와 같이 농도별로 처리한 결과, 사이토카인의 발현량이 농도 의존적으로 증가하였는데 TNF-α와 IFN-γ의 발현량은 여드름균을 1×107 CFU/ml로 처리했을 때 두 배 이상 증가하였고 IL-8의 발현량은 네 배 이상 증가하였다. 그러나 여드름균에 의해 증가되었던 TNF-α, IFN-γ 그리고 IL-8의 발현량은 박테리오신을 처리하였을 때 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다. 이상의 결과로 보아 김치유산균인 L. plantarum K-1 BR 균주에서 분리한 박테리오신은 여드름균에 의한 염증유발을 완화시키는 효과가 있다고 할 수 있다.
본 실험은 유산균 유래의 박테리오신이 여드름균에 의한 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효능을 가지는지를 확인하기 위해 수행되었다. 본 실험을 위해 인간의 각질형성세포인 HaCaT 세포에 열처리한 여드름균인 P. acnes을 농도별로 처리하여 염증성 사이토카인인 TNF-α, IFN-γ, IL-8의 발현을 유도하였고, 여드름균과 박테리오신을 HaCaT 세포에 함께 처리하여 여드름균에 의해 증가된 사이토카인의 양이 박테리오신에 의해 어떻게 변화하는지를 확인하였다. P. acnes 균을 1×105, 1×106 그리고 1×107 CFU/ml와 같이 농도별로 처리한 결과, 사이토카인의 발현량이 농도 의존적으로 증가하였는데 TNF-α와 IFN-γ의 발현량은 여드름균을 1×107 CFU/ml로 처리했을 때 두 배 이상 증가하였고 IL-8의 발현량은 네 배 이상 증가하였다. 그러나 여드름균에 의해 증가되었던 TNF-α, IFN-γ 그리고 IL-8의 발현량은 박테리오신을 처리하였을 때 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다. 이상의 결과로 보아 김치유산균인 L. plantarum K-1 BR 균주에서 분리한 박테리오신은 여드름균에 의한 염증유발을 완화시키는 효과가 있다고 할 수 있다.
Acne vulgaris is a common chronic skin disorder that affects millions of people. The pathogenesis of acne has been known to be closely associated with the bacterium Propionibacterium acnes. Here we investigated the anti-acne activity of Lactobacillus plantarum K-1 BR by observing the expressions of ...
Acne vulgaris is a common chronic skin disorder that affects millions of people. The pathogenesis of acne has been known to be closely associated with the bacterium Propionibacterium acnes. Here we investigated the anti-acne activity of Lactobacillus plantarum K-1 BR by observing the expressions of proinflammatory cytokines, TNF-α, IFN-γ and IL-8, of human keratinocytes. When we applied heat-killed P. acnes to HaCaT cells, the inflammatory cytokines were induced by two- to four-fold compared to the normal control. When the bacteriocin, purified from L. plantarum K-1 BR, was pretreated to the HaCaT cells, the expression levels of TNF-α and IFN-γ stimulated by P. acnes significantly decreased to 25% and 30% of the induced levels, respectively. The IL-8 levels also significantly decreased with the concentration dependent manner of the bacteriocin. These results suggest that the bacteriocin from L. plantarum K-1 BR could reduce the expression levels of inflammatory cytokines and thus may relieve inflammations caused by acne.
Acne vulgaris is a common chronic skin disorder that affects millions of people. The pathogenesis of acne has been known to be closely associated with the bacterium Propionibacterium acnes. Here we investigated the anti-acne activity of Lactobacillus plantarum K-1 BR by observing the expressions of proinflammatory cytokines, TNF-α, IFN-γ and IL-8, of human keratinocytes. When we applied heat-killed P. acnes to HaCaT cells, the inflammatory cytokines were induced by two- to four-fold compared to the normal control. When the bacteriocin, purified from L. plantarum K-1 BR, was pretreated to the HaCaT cells, the expression levels of TNF-α and IFN-γ stimulated by P. acnes significantly decreased to 25% and 30% of the induced levels, respectively. The IL-8 levels also significantly decreased with the concentration dependent manner of the bacteriocin. These results suggest that the bacteriocin from L. plantarum K-1 BR could reduce the expression levels of inflammatory cytokines and thus may relieve inflammations caused by acne.
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문제 정의
acnes)에 대한 억제성 효과는 아직 연구된 바가 없다. 본 연구에서는 인체 각질형성세포(keratino- cytes)인 HaCaT 세포에 P. acnes를 처리하여 염증성 사이토카인의 발현을 유도하고 유도된 사이토카인이 우리가 발효된 김치에서 새로이 분리한 L. plantarum K-1 BR 균주에서 생성되는 박테리오신에 의해서 억제되는 지를 조사하였다.
제안 방법
배양하였다. 24시간 후에 serum-free medium으로 배지를 교체하고 열처리한 P. acnes를 각각 1×105, 1×106 그리고 1×107 CFU/ml를 처리한 후 다시 24시간 동안 배양하여 염증성 사이토카인의 발현을 유도하였다. 그런 후 배양 배지를 따로 모아 사이토카인 ELISA kit (R&D systems, USA)의 매뉴얼에 명시되어 있는 방법에 따라 TNF-α, IFN-γ 그리고 IL-8의 발현량을 측정하였다.
배양하였다. 24시간 후에 serum-free medium으로 배지를 교체하고 조항균성 물질 시료를 세포독성이 없는 농도인 0.01, 0.1 그리고 1 mg/ml의 농도로 각각 30분간 전처리한 후에 P. acnes를 1×107 CFU/ml로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 후 배양 배지를 모아 TNF-α, IFN-γ 그리고 Ⅱ.
acnes를 각각 1×105, 1×106 그리고 1×107 CFU/ml를 처리한 후 다시 24시간 동안 배양하여 염증성 사이토카인의 발현을 유도하였다. 그런 후 배양 배지를 따로 모아 사이토카인 ELISA kit (R&D systems, USA)의 매뉴얼에 명시되어 있는 방법에 따라 TNF-α, IFN-γ 그리고 IL-8의 발현량을 측정하였다.
시료의 세포독성을 확인하기 위하여 세포생존율을 측정하였다. 실험 전에 96-well plate에 1×104 cells/well의 세포를 분주하여 배양한 후 다음 날 시료를 농도 별로 처리하였다.
여드름균 처리에 의해 염증성 사이토카인이 유도되는 지를 확인하기 위해 세가지 사이토카인인 TNF-α, IFN-γ 그리고 IL-8의 발현량 변화를 조사하였다(Fig. 2). HaCaT 세포에 열처리한 여드름균을 농도별로 처리하고 24시간 후에 사이토카인 변화량을 측정한 결과, TNF-α의 경우 정상군(Normal con-trol, NC)의 발현량이 6.
여드름균 처리에 의해 증가되었던 염증성 사이토카인의발현량이 박테리오신을 함께 처리한 세포에서는 어떠한 변화를 보이는지에 대해 테스트하였다(Fig. 3). 여드름균의 처리농도는 1×107 CFU/ml로 하였고, 박테리오신의 농도는 세포독성실험 결과로서 독성이 나타나지 않은 농도인 0.
3). 여드름균의 처리농도는 1×107 CFU/ml로 하였고, 박테리오신의 농도는 세포독성실험 결과로서 독성이 나타나지 않은 농도인 0.01, 0.1 그리고 1 mg/ml의 세가지 농도로 결정하여 분석하였다. 결과에서 보듯이 TNF-α의 발현량은 여드름균 처리군(P.
plantarum K-1 BR 에서 분리한 박테리오신이 여드름균에 의해 유발되는 세 가지 염증성 사이토카인의 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다. 인간의 각질세포인 HaCaT 세포에 열처리한 여드름균인 P. acnes를 농도별로 처리하여 염증반응을 유발하였고, L. planta- rum K-1 BR에서 분리한 박테리오신이 세포독성을 일으키지 않는 농도를 결정하여 박테리오신을 여드름균과 함께 처리한 후 염증성 사이토카인인 TNF-α, IFN-γ, 그리고 IL-8의 발현량의 변화를 측정하였다. 결과적으로 박테리오신은 TNF-α와 IFN-γ 및 IL-8의 발현량을 약 20~30% 정도 감소시켜 염증성사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다.
조항균성 물질인 박테리오신의 세포독성을 확인하기 위하여 각질세포 유래의 HaCaT 세포를 이용하여 세포 생존율을 분석하였다. 박테리오신은 멸균된 증류수에 희석하여 필터 (0.
대상 데이터
세척한 여드름균을 PBS에 다시 풀은 후 80oC에서 30분간 가열하여 열처리한 여드름균을 제조하였다[16]. Human keratinocyte (HaCaT) 세포는 37oC의 5% CO2 incubator에서 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% antibiotics가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다.
plantarum K-1 BR을 MRS broth (Difco, USA)를 이용하여 배양하였다. P. acnes (KTCC 3318)는 brain heart in- fusion broth (Difco, USA)를 이용하여 37oC 혐기조건에서 배양하였다. 배양한 여드름균을 1, 800× g에서 5분간 원심 분리한 후 PBS (pH 7.
본 연구에 사용된 유산균주는 (주)바이오리듬에서 분리 동정한 L. plantarum K-1 BR을 MRS broth (Difco, USA)를 이용하여 배양하였다. P.
데이터처리
실험 전에 96-well plate에 1×104 cells/well의 세포를 분주하여 배양한 후 다음 날 시료를 농도 별로 처리하였다. 24시간 동안 재배양한 후 cell counting kit-8 (CCK-8) (Dojin- do, USA)을 사용하여 매뉴얼에 명시되어 있는 방법으로 다양한 농도의 시료를 각각의 well에 넣어주고 2시간 동안 5% CO2가 포함된 37oC incubator에서 반응시킨 후, microplate reader로 450 nm의 파장에서 CCK-8의 활성을 측정하였고 세포 생존율은 평균±표준편차로 나타내었다.
0) (SPSS Inc, USA)을 이용하여 통계해석을 하였다. One-way analysis of variation (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과 유의차가 있는 실험군을 확인하기 위해 Dunnett's t-test 다중검정(p<0.05)을 실시하였다.
acnes, respectively. Significant differ- ence from normal control (NC) group by Dunnett's t-test (* p<0.05 and ** p<0.01).
1 and 1 mg/ml) of bacteriocin, respectively. Significant difference from P. acnes-treated (PA) group by Dunnett's t-test (* p<0.05 and ** p<0.01). NC, normal control.
모든 데이터는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었으며 SPSS program (ver.12.0) (SPSS Inc, USA)을 이용하여 통계해석을 하였다. One-way analysis of variation (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과 유의차가 있는 실험군을 확인하기 위해 Dunnett's t-test 다중검정(p<0.
성능/효과
2). HaCaT 세포에 열처리한 여드름균을 농도별로 처리하고 24시간 후에 사이토카인 변화량을 측정한 결과, TNF-α의 경우 정상군(Normal con-trol, NC)의 발현량이 6.91±1.17 pg/ml이었지만 여드름균 1× 105, 1×106 그리고 1×107 CFU/ml를 처리한 세포에서의 발현량은 각각 9.79±0.86, 11.37±2.42, 그리고 16.63±0.73 pg/ml로 여드름균의 농도가 높아질수록 TNF-α의 발현량도 증가하였다(Fig. 2A). IFN-γ의 발현량은 정상군(NC)이 37.
1 그리고 1 mg/ml의 세가지 농도로 결정하여 분석하였다. 결과에서 보듯이 TNF-α의 발현량은 여드름균 처리군(P. acnes, PA)에서 16.20±1.78 pg/ml로 정상군(NC)의 7.14±2.21 pg/ml 보다 두 배 이상 증가하였고, 박테리오신 0.01, 0.1 그리고 1 mg/ml를 함께 처리한 세포군에서는 각각 13.95±0.76, 12.21± 0.39, 11.90±0.85 pg/ml로 박테리오신의 농도가 점점 높아질수록 TNF-α의 발현량이 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 3A). IFN-γ 경우, 염증 유발군 즉 여드름균 처리군(PA)에서 73.
planta- rum K-1 BR에서 분리한 박테리오신이 세포독성을 일으키지 않는 농도를 결정하여 박테리오신을 여드름균과 함께 처리한 후 염증성 사이토카인인 TNF-α, IFN-γ, 그리고 IL-8의 발현량의 변화를 측정하였다. 결과적으로 박테리오신은 TNF-α와 IFN-γ 및 IL-8의 발현량을 약 20~30% 정도 감소시켜 염증성사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 즉, 열처리한 여드름균을 1×107 CFU/ml의 양으로 각질 세포에 처리하였을 때 사이토카인의 발현량이 증가하여 염증이 유발되었음을 확인할 수 있었고 박테리오신을 30분 전처리하였을 때 TNF-α, IFN-γ, IL-8의 발현량 모두 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보여 L.
멸균 증류수를 사용한 음성대조군을 포함하여 처리한 모든 박테리오신 희석액의 양은 동일하게 사용하였다. 결과적으로 박테리오신을 1 mg/ml까지 처리하였을 때 90% 이상의 세포생존율을 보였고 10 mg/ ml 처리 농도에서부터 세포 생존률이 80% 이하로 떨어지며 세포 독성을 보이기 시작하였다(Fig. 1). 이 실험을 통해서 박테리오신의 농도가 1 mg/ml 이하일 때는 세포독성이 나타나지 않는다는 것을 알 수 있었으며 따라서 향후의 실험에서 박테리오신의 농도는 1 mg/ml 이하를 사용하였다.
3B). 마지막으로 IL-8의 발현량은 염증 유발군에서 968.53±21.79 pg/ml로 정상군의 241.30±50.70 pg/ml에 비해 네 배 정도 증가하였고 박테리오신을 0.01과 0.1 mg/ml을 처리한 세포군에서 각각 904.16±17.67, 871.58±43.11 pg/ml의 농도로 IL-8의 발현량은 감소하는 경향을 보였으며 특히 1 mg/ml의 처리군에서의 IL-8의 발현량은 769.92±26.56 pg/ml으로서 IL-8의 발현을 유의적으로 억제하는 효과를 보였다(Fig. 3C). 이와 같은 결과는 여드름균의 처리에 의해 HaCaT 세포에서 유도된 염증성 반응이 L.
본 실험을 통해 우리는 김치유산균인 L. plantarum K-1 BR 에서 분리한 박테리오신이 여드름균에 의해 유발되는 세 가지 염증성 사이토카인의 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다. 인간의 각질세포인 HaCaT 세포에 열처리한 여드름균인 P.
2C). 이와 같은 결과로부터 우리는 여드름균의 처리에의해 HaCaT 세포에서 염증성 반응이 유도되고 있음을 확인할 수 있었다.
이와 같은 연구결과들은 우리가 본 논문에서 제시한 결과와도 매우 잘 일치하고 있다. 즉, Fig. 2에 제시된 바와 같이 각질형성세포에 P. acnes를 처리하였을 때, IFN-γ, TNF- α 그리고 IL-8의 발현은 정상군과 비교하여 유의적으로 증가하였으며 Fig. 3에서 보듯이 L. plantarum K-1 BR에서 분리한 박테리오신을 처리했을 때 IFN-γ, TNF-α, IL-8 각각의 발현량이 박테리오신의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 감소하고 있음을 알 수 있었다.
결과적으로 박테리오신은 TNF-α와 IFN-γ 및 IL-8의 발현량을 약 20~30% 정도 감소시켜 염증성사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 즉, 열처리한 여드름균을 1×107 CFU/ml의 양으로 각질 세포에 처리하였을 때 사이토카인의 발현량이 증가하여 염증이 유발되었음을 확인할 수 있었고 박테리오신을 30분 전처리하였을 때 TNF-α, IFN-γ, IL-8의 발현량 모두 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보여 L. plantarum K-1 BR에서 분리한 박테리오신이 각질형성세포에서 항염증 효과를 보이고 있음을 확인할 수 있었다.
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