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문제 정의
- 본 연구에서는 국내에 서식중인 개구리 중 넓은 지역에 분포하며 산란시기가 빠르고 채집이 용이한 두꺼비(Bufo gargarizans)를 대상으로 지금까지 알려지지 않았던 두꺼비 배아의 정상발달과정을 확립하고 두꺼비 배아를 이용하여 FETAX 시험방법에 따라 최기형성물질로 알려진 Zn(Luo et al., 1993)과 농약류인 Benomyl(Choi et al., 2002)에 의한 치사율, 기형율, 기형양상, 성장에 미치는 영향 등의 효과를 확인하고 이를 통해 화학 물질 및 환경오염물질의 독성 평가 가능 여부를 알아보고 화학 물질 및 환경오염물질의 유해성을 평가할 수 있는 기법으로 활용하고자 한다.
제안 방법
- 각 농도별 치사율은 24시간마다 관찰하여 죽은 것을 제거하였고 120시간 후 생존된 것을 3% Formalin에 고정하고, 이들 고정된 개체들을 대상으로 기형 개체 수 및 양상을 조사하였다. 그 결과들을 (죽은 개체/노출 개체)×100으로 계산하여 한 농도의 치사율을 구하였다.
- 그 결과들을 (죽은 개체/노출 개체)×100으로 계산하여 한 농도의 치사율을 구하였다.
- 그 결과들을 (죽은 개체/노출 개체)×100으로 계산하여 한 농도의 치사율을 구하였다. 기형율은 120시간 배양 후 생존한 유생들을 대상으로 개체당 머리, 복부 및 꼬리 등 각 부위별로 기형 여부를 조사하였다. 정상적인 Tadpole의 범위에서 벗어나면 기형으로 판정하였으며 120시간 후 생존한 개체 중 (영향을 받은 개체/영향을 받지 않은 개체)×100으로 계산하여 한 농도의 기형율을 구하였다.
- 5이상이 되면 최기형성이 있는 물질로 판정하였다(Bantle and Courchesne, 1985). 기형의 종류는 정상발생 올챙이를 기준으로 머리의 형성이나 안구 등에 이상이 나타난 경우 머리(Head)기형으로 판정하였고 복부의 돌출현상 등을 관찰하여 복부(Abdomen)기형으로 판정하였다. 또한 몸 전체 또는 일부에 수포가 형성되거나 부풀어 오른 경우 수포형성기형(Edema)으로 판정하였으며 두 가지 이상의 기형이 관찰되는 경우 복합(Propound)기형으로 판정하였다(Bantle et al.
- 두꺼비의 배아 발생에 미치는 Benomyl의 효과를 알아보기 위해 Benomyl이 전혀 포함되지 않은 대조군과 Benomyl을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25 ㎎/ℓ가 포함된 시험군을 각각 처리하여 120시간 배양 후 배아들에게 나타난 치사율과 기형율, 기형양상, 배아의 전장(total length) 등을 조사하였다. 5 ㎎/ℓ에서부터 죽는 배아들이 16.
- 두꺼비의 배아 발생에 미치는 Zn의 효과를 알아보기 위해 낭배기까지 배양된 배아들을 Zn이 첨가되지 않는 대조 군과 Zn 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50㎎/ℓ를 각각 처리하여 120시간 배양 후 치사율 및 기형율, 기형양상 등을 조사하였다. 1 ㎎/ℓ에서 5.
- , 1998). 배아의 발달과정과 시험물질이 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해 AM-423x와 Dinocapture 2.0 프로그램(ANMO)을 사용하여 배아의 직경 및 유생의 머리끝부터 꼬리 끝까지의 전 체장의 길이를 측정하였다.
- 시험물질은 매 24시간마다 새로운 용액으로 교환하였다. 시험물질의 농도는 Zn 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50㎎/ℓ, Benomyl 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25 ㎎/ℓ로 정하여 실시하였고 모든 농도구간에 대해 각기 다른 개체에서 채취한 배아들을 사용하여 3회 이상 반복 시험하였다.
- 유리 배양접시에 시험물질이 농도별로 포함된 실험군과 시험물질이 포함되지 않는 대조군의 배양액 10㎖에 낭배기까지 배양된 배아들을 각 농도별로 10개씩 넣고 20±1℃의 온도에서 120시간 배양하였다.
- 정상적인 Tadpole의 범위에서 벗어나면 기형으로 판정하였으며 120시간 후 생존한 개체 중 (영향을 받은 개체/영향을 받지 않은 개체)×100으로 계산하여 한 농도의 기형율을 구하였다.
- 직경 100㎜의 유리 배양접시에 시험물질이 첨가되지 않은 배양액 60 ㎖에 30개의 배아를 배양하면서 2세포에서 올챙이의 꼬리지느러미 순환시기까지 진행되는 정상발생 과정과 각 발생단계에 소요되는 시간 등을 조사하였다. 배양과정 중 24시간마다 새로운 배양액으로 교환하면서 배양 하였다.
- 정상적인 Tadpole의 범위에서 벗어나면 기형으로 판정하였으며 120시간 후 생존한 개체 중 (영향을 받은 개체/영향을 받지 않은 개체)×100으로 계산하여 한 농도의 기형율을 구하였다. 치사율과 기형율 값을 대상으로 Probit analysis Program을 활용하여 LC50, EC50을 구하였으며 아울러 LC50 값을 EC50 값으로 나누어 Teratogenic Index(TI)를 구하고 TI 값이 1.5이상이 되면 최기형성이 있는 물질로 판정하였다(Bantle and Courchesne, 1985). 기형의 종류는 정상발생 올챙이를 기준으로 머리의 형성이나 안구 등에 이상이 나타난 경우 머리(Head)기형으로 판정하였고 복부의 돌출현상 등을 관찰하여 복부(Abdomen)기형으로 판정하였다.
대상 데이터
- O, Junsei Chem.)을 구입하여 사용하였으며 Benomyl(Methyl [1-[(butylamino)carbonyl]-1H-benzimidazol-2-yl]carbama te Methyl 1-(butylcarbamoyl)-2-benzimidazolecarbamate, C14H18N4O3, 농업진흥청 제공)은 DMSO에 녹여 1,000ppm Stock solution으로 제조한 후 이를 AR용액으로 희석하여 사용하였다. 유리 배양접시에 시험물질이 농도별로 포함된 실험군과 시험물질이 포함되지 않는 대조군의 배양액 10㎖에 낭배기까지 배양된 배아들을 각 농도별로 10개씩 넣고 20±1℃의 온도에서 120시간 배양하였다.
- Amphibian Ringer 용액(AR; 6.6g/ℓ NaCl, 0.15g/ℓ KCl, 0.15g/ℓ CaCl2, 0.2g/ℓ NaHCO3, 0.05g/ℓ Streptomycin, 0.03g/ℓ Penicillin G)을 제조하여 pH 7.4로 맞추어 사용하였다.
- 시험에 사용된 두꺼비는 2015년 2월~3월까지 광주 전남 일대에서 번식 시기에 포접 중인 두꺼비 암·수 성체를 직접 채집하여 사용하였다.
- 포접중인 두꺼비 암·수 5쌍을 광주광역시 광산구 인근에서 채집하여 실험실에서 자연 배란 및 수정과정에 의해 2세포의 배아들이 출현하기 시작하면(Johnson and Volpe, 1973; Mathews, 1986) 2세포 배아들 중 세포질들이 정확히 나누어져 균일한 할구들을 가진 배아들을 선택하여 예리한 포셉으로 젤리층을 제거하고 20±1℃에서 포배기까지 배양하여 시험에 사용하였다.
이론/모형
- 기형의 종류는 정상발생 올챙이를 기준으로 머리의 형성이나 안구 등에 이상이 나타난 경우 머리(Head)기형으로 판정하였고 복부의 돌출현상 등을 관찰하여 복부(Abdomen)기형으로 판정하였다. 또한 몸 전체 또는 일부에 수포가 형성되거나 부풀어 오른 경우 수포형성기형(Edema)으로 판정하였으며 두 가지 이상의 기형이 관찰되는 경우 복합(Propound)기형으로 판정하였다(Bantle et al., 1998). 배아의 발달과정과 시험물질이 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해 AM-423x와 Dinocapture 2.
성능/효과
- 1㎎/ℓ의 농도에서는 소수의 개체에서 복합기형만이 관찰되었다. 0.5㎎/ℓ에서는 머리기형, 복부기형, 복합기형 등 다양한 기형양상을 나타냈으며 머리기형이 50%로 가장 높게 관찰되었고 이어 복합기형 (33.3%), 복부기형(16.7%)의 순으로 나타났다. 1㎎/ℓ의 농도에서는 머리기형과 복합기형의 비율이 62.
- 7%)의 순으로 나타났다. 1㎎/ℓ의 농도에서는 머리기형과 복합기형의 비율이 62.5%, 37.5%의 비율로 나타났으며 5㎎/ℓ에서는 머리기형이 3.5%, 수포 형성기형 44.8%, 복합기형 51.7%로 복합기형의 비율이 가장 높게 나타났다. 10㎎/ℓ에서는 수포형성기형과 복합기형의 비율이 각각 30.
- 7을 나타내었다(Table 1). Benomyl의 영향에 의해 발생된 기형의 종류는 복부기형과 복합기형을 나타내었으며 복합기형의 비율이 높게 나타났다. 이들의 비율을 농도별로 살펴보면 EC50을 나타내는 농도보다 낮은1 ㎎/ℓ의 농도에서는 복부기형의 비율이 높았고 LC50과 가까운 농도인 5 ㎎/ℓ으로 농도가 높아지면서 복합기형의 비율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 3.
- Zn의 효과를 시험 결과 1㎎/ℓ에서 치사된 배아들이 나타나기 시작하였으며 25㎎/ℓ이상의 농도에서는 모든 배아가 치사하였고 5, 10, 25㎎/ℓ으로 농도가 높아지면서 치사된 배아들의 비율도 5.0%, 37.5%, 100%로 증가하여 나타났다. 또한 Benomyl의 시험결과 5㎎/ℓ에서부터 죽는 배아들이 16.
- 7로 계산되어 시험물질 모두 두꺼비 배아에 있어 최기형성을 갖는 것으로 나타났다(Bantle and Courchesne, 1985). 따라서 Zn 과 Benomyl 모두 두꺼비 배아발달에 최기형성 물질로 작용하는 것으로 나타났다. 한편, Zn과 Benomyl의 영향에 의해 나타난 기형의 종류는 Zn의 경우 머리기형, 복부기형, 수포형성기형, 복합기형 등이 나타났고 Benomyl 의 경우 복부기형, 복합기형 등이 나타났으며 이들은 Zn과 Benomyl의 농도에 의존하여 그 비율도 증가하였다.
- 5%, 100%로 증가하여 나타났다. 또한 Benomyl의 시험결과 5㎎/ℓ에서부터 죽는 배아들이 16.8%의 비율로 나타나기 시작하여 10, 25㎎/ℓ으로 농도가 높아지면서 86.8%, 100%로 비율도 각각 증가하여 Zn과 Benomyl 모두 농도에 의존하여 치사율이 증가하는 경향을 나타냈다. 체장의 경우 Zn의 시험 결과 대조군 (10.
- 배아의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해 체장을 비교한 결과 대조군(10.8±0.7㎜)에 비해 Benomyl의 농도가 1, 5, 10㎎/ℓ로 증가함에 따라 유생의 체장은 10.7±1.1, 6.8±0.5, 4.0±0.5㎜로 감소하여 나타났다(Figure 3. D).
- 배아의 성장에 미치는 영향을 조사한 결과 대조군(10.8±0.7㎜)에 비해 Zn 0.001, 0.01, 0.1, 1㎎/ℓ의 농도에서는 10.8±0.9, 10.9±1.1, 10.8±1.3, 10.7±1.6㎜로 유지되다가 5, 10 ㎎/ℓ에서는 10.3±1.1, 10.0±1.0㎜로 감소하여 나타났다 (Figure 2. D).
- , 2011). 본 연구에서 두꺼비의 자연배란을 통해 수정란을 채취하고 얻어진 배아들을 통해 두꺼비의 발생과정 및 배양조건 등을 확립 할 수 있었다 (Figure 1). 두꺼비에서 나타나는 유생의 발달단계는 Rana pipiens (Johnson and Volpe, 1973; Mathews, 1986), X.
- 본 연구의 결과들을 기존의 보고와 비교해보면 Zn의 경우 X. leavis의 배아에 노출된 경우 수포형성기형(Edema), 복부기형(Cardiac, gut), 척추기형(notochord), 머리기형(eye, fa- cial) 등으로 본 실험과 유사한 결과를 나타냈으며, LC50 850µ㏖(ZnCl2), 12.8㎎/ℓ(Zn), 56.4㎎/ℓ(ZnSO4), EC50 40µ㏖(ZnCl2), 8.5㎎/ℓ(Zn)의 값을 나타냈다.
- 아가미구멍에 의해 열려있는 점막의 주름을 갖는 아가미 뚜껑주름시기에는 유생의 전장이 9.1±0.5㎜정도로 성장하였으며 수정 후 대략 124시간 정도가 소요됐다.
- laevis(Deuchar, 1972)의 발달단계와 매우 유사한 경향을 나타내었다. 암컷 두꺼비 1개체에서 배란되어진 난자는 약 13,000개 정도였으며 대부분의 배아들이 수정되어 난할과정이 정상적으로 진행되어 시험에 활용 가능한 배아들이 다량으로 확보가 가능했으며 배양이 용이하여 화학물질에 대한 독성을 평가하는데 좋은 시험재료로 사용 될 수 있음을 확인하였다.
- 유생이 꼬리지느러미를 움직여 헤엄치는 것이 가능한 꼬리지느러미 순환시기에는 전장이 7.2±0.3㎜ 정도까지 성장하였으며 수정후 대략 105시간 가량이 소요되었다.
- Benomyl의 영향에 의해 발생된 기형의 종류는 복부기형과 복합기형을 나타내었으며 복합기형의 비율이 높게 나타났다. 이들의 비율을 농도별로 살펴보면 EC50을 나타내는 농도보다 낮은1 ㎎/ℓ의 농도에서는 복부기형의 비율이 높았고 LC50과 가까운 농도인 5 ㎎/ℓ으로 농도가 높아지면서 복합기형의 비율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 3. C). 배아의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해 체장을 비교한 결과 대조군(10.
- 이상의 결과들로 보아 Zn과 Benomyl은 모두 치사율, 기형율, 기형양상, 성장에 미치는 영향 등이 농도에 따라 비율이 증가하고 체장이 감소하여 배아의 발달과정에 유해하게 작용하였으며 각각의 문헌결과와 비교하였을 때 배아발달에 유사한 양상을 나타내 두꺼비 배아를 활용한 화학물질의 독성평가시험기법은 신뢰성을 확보한 것으로 생각되며 화학물질 및 환경오염물질에 대한 독성평가에 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 체장의 경우 Zn의 시험 결과 대조군 (10.8±0.7㎜)에 비해 농도가 1, 5, 10㎎/ℓ로 증가함에 따라 유생의 체장은 10.7±1.6, 10.3±1.1, 10.0±1.0㎜로 감소하였으며 Benomyl의 시험결과도 대조군(10.8±0.7㎜)에 비해 농도가 1, 5, 10㎎/ℓ로 증가함에 따라 유생의 체장은 10.7±1.1, 6.8±0.5, 4.0±0.5㎜로 감소하여 나타났다.
- 따라서 Zn 과 Benomyl 모두 두꺼비 배아발달에 최기형성 물질로 작용하는 것으로 나타났다. 한편, Zn과 Benomyl의 영향에 의해 나타난 기형의 종류는 Zn의 경우 머리기형, 복부기형, 수포형성기형, 복합기형 등이 나타났고 Benomyl 의 경우 복부기형, 복합기형 등이 나타났으며 이들은 Zn과 Benomyl의 농도에 의존하여 그 비율도 증가하였다. 본 연구의 결과들을 기존의 보고와 비교해보면 Zn의 경우 X.
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