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문제 정의
- 본 연구에서는 Benomyl과 Thiobencarb의 선행연구결과를 참고하여, 국내에 서식중인 두꺼비 배아의 정상발달 과정을 관 찰하면서 두꺼비 배아의 발달단계를 이용하여 FETAX 기법에 따라 Benomyl(살균제), Carbofuran(살충제), Thiobencarb (제초제)의 독성을 비교 평가하고자 한다.
제안 방법
- , 1996). FETAX 방법에 따른 독성유발 여부는 사망률(Mortality)과 기형율(Malformation) 등을 측정하여 평 가한다. 사망률과 기형율을 기준으로 반수치사농도(LC50) 및 반수영향농도(EC50)로 나타내며 두 값의 비율인 LC50/ EC50을 기형유발 지수(teratogenic index, TI)로 표시하며 시험 대상 물질에 의한 TI 지수의 범위가 1.
- 배양액 에 시험물질이 전혀 포함되지 않은 대조군과 농도별로 시험물 질을 포함된 실험군을 대상으로 대상종의 번식기 실외온도인 20℃에 맞춰 배아를 배양했으며, 외부의 영향이 없는 독립된 공간에서 배양을 진행했다. 각각의 실험군은 10개의 배아를 배양하면서 24시간마다 새로운 배양액과 시험물질로 교환하여 120시간 동안 배양하였으며 모든 시험은 3회 반복 하였다.
- 기관 형성 전에는 운동성이 없거나 세포질 붕괴가 일어 난 배아를, 기관이 형성된 후에는 심장 박동이 멈춘 것을 치사 된 개체로 판정하였으며 한 농도의 사망률은 시험물질에 120 시간 노출된 배아들 중 치사된 배아의 수를 노출된 배아의 수로 나누어 계산하였다(치사된 배아의 수/노출된 배아의 수×100).
- 기형성 지수(TI)는 Probit 분석법을 통해 구한 LC50를 EC50 으로 나누어(LC50/EC50) 그 값이 1.5 이상으로 나타나면 시험 에 사용된 두꺼비의 배아 발달과정에 최기형성을 나타내는 것 으로 판정하였다(ASTM, 1993).
- 대조군과 실험군의 배아 중 치사된 개체를 제외하고 120시간 배양 후 생존한 배아를 대상으로 머리, 척추, 복부, 꼬리 등에 나타난 기형을 각각 부위별로 조사하였다(Bantle et al., 1998). 기형율은 120시간 동안 노출된 배아 중 살아서 영향을 받은 개체를 정상 개체로 나누어 계산하였으며(살아서 영향을 받은 배아/정상 생존 배아×100) 농도 구간을 5개 이상으로 설정하고 Probit 분석법을 활용하여 반수영향농도(half maximal effective concentration; EC50)를 구하였다(Goh and Neff, 2003).
- 5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000㎎/\(l\)의 농도 구간을 설정하였다. 배양액 에 시험물질이 전혀 포함되지 않은 대조군과 농도별로 시험물 질을 포함된 실험군을 대상으로 대상종의 번식기 실외온도인 20℃에 맞춰 배아를 배양했으며, 외부의 영향이 없는 독립된 공간에서 배양을 진행했다. 각각의 실험군은 10개의 배아를 배양하면서 24시간마다 새로운 배양액과 시험물질로 교환하여 120시간 동안 배양하였으며 모든 시험은 3회 반복 하였다.
- 척추기 형(Spine Abnormality)의 경우 척추가 아치형으로 휘어지거 나 굽어지는 형태의 경우 기형으로 판정하였다. 복부가 돌출되 거나 소화기관의 형태, 내부장기의 팽만 등이 확인된 경우 복부 기형(Abdominal Abnormality)으로 판정하였다. 두 가지 이 상의 다양한 기형이 동시에 확인된 경우 복합기형(Profound Abnormality)으로 판정하였다(Bantle et al.
- 사망률의 경우 실험군과 대조군을 매 24시간마다 확인하여 치사된 배아를 제거한 뒤 노출 120시간 후 생존한 것만을 관찰 하였다. 기관 형성 전에는 운동성이 없거나 세포질 붕괴가 일어 난 배아를, 기관이 형성된 후에는 심장 박동이 멈춘 것을 치사 된 개체로 판정하였으며 한 농도의 사망률은 시험물질에 120 시간 노출된 배아들 중 치사된 배아의 수를 노출된 배아의 수로 나누어 계산하였다(치사된 배아의 수/노출된 배아의 수×100).
- 유리로 된 배양접시에 정상적으로 발생이 진행되어 세포질이 균일하게 나누어진 배아의 젤리층을 포셉으로 제거한 후 매 24시 간마다 시험물질이 첨가되지 않은 배양액으로 교환하면서 배양했 다. 배아의 발달과정은 Gosner(1960)의 방법에 따라 판별했다.
- 정상개체는 대조군 중에서 정상적으로 발생이 이루어진 개 체를 기준으로 정했으며, 기형양상은 꼬리가 물결치는 것 같은 모양을 나타내거나, 휘어지는 양상 혹은 길이가 짧아지는 등의 양상을 꼬리기형(Tail Abnormality)으로 판정하였다. 척추기 형(Spine Abnormality)의 경우 척추가 아치형으로 휘어지거 나 굽어지는 형태의 경우 기형으로 판정하였다.
대상 데이터
- Benomyl(농촌진흥청 제공), Carbofuran(Sigma-aldrich), Thiobencarb(농촌진흥청 제공)는 각각 AR용액에 희석하여 사용하였다. Benomyl과 Thiobencarb는 0.
- 성장에 대한 영향을 조사하기 위해 대조군 30개체와 시험 후 생존한 실험군 전체를 대상으로 측정을 실시했다. 대조군의 체장 은 11.
- 실험에 사용한 두꺼비(Bufo gargarizans)는 2019년 2월 하 순에서 3월 초까지 광주광역시 일대 서식지를 중심으로 포접 중인 개체들을 직접관찰 및 채집하여 실험실에서 자연배란을 유도하였으며 수정된 배아들 중 세포질이 균일하게 나누어진 배아들을 선택하여 포셉으로 젤리층을 제거한 후 낭배기까지 배양하여 시험에 사용하였다.
데이터처리
- 배아의 체장을 중심으로 발달과 성장에 미치는 시험물질의 영향을 확인하기 위해 120시간 동안 시험물질에 노출되어 시 험종료까지 생존한 배아를 대상으로 AM-423x Dino-Eye와 Dinocapture 2.0 program (ANMO)을 이용하여 배아 및 유생의 직경 또는 체장을 측정하여 Independent t-test로 대조군과 실험 군 간의 유의성을 SPSS 20.0 program을 사용하여 분석하였다. Independent t-test의 수식은 다음과 같으며, p<0.
이론/모형
- 기형율은 120시간 동안 노출된 배아 중 살아서 영향을 받은 개체를 정상 개체로 나누어 계산하였으며(살아서 영향을 받은 배아/정상 생존 배아×100) 농도 구간을 5개 이상으로 설정하고 Probit 분석법을 활용하여 반수영향농도(half maximal effective concentration; EC50)를 구하였다(Goh and Neff, 2003).
- 복부가 돌출되 거나 소화기관의 형태, 내부장기의 팽만 등이 확인된 경우 복부 기형(Abdominal Abnormality)으로 판정하였다. 두 가지 이 상의 다양한 기형이 동시에 확인된 경우 복합기형(Profound Abnormality)으로 판정하였다(Bantle et al., 1991).
- 유리로 된 배양접시에 정상적으로 발생이 진행되어 세포질이 균일하게 나누어진 배아의 젤리층을 포셉으로 제거한 후 매 24시 간마다 시험물질이 첨가되지 않은 배양액으로 교환하면서 배양했 다. 배아의 발달과정은 Gosner(1960)의 방법에 따라 판별했다.
- 사망률과 기형율 분석은 회귀분석 중 Probit 분석법을 활용 하였다. 이를 통해 반수치사농도 및 반수영향농도를 구하였으며, 수식은 다음과 같다.
- 기관 형성 전에는 운동성이 없거나 세포질 붕괴가 일어 난 배아를, 기관이 형성된 후에는 심장 박동이 멈춘 것을 치사 된 개체로 판정하였으며 한 농도의 사망률은 시험물질에 120 시간 노출된 배아들 중 치사된 배아의 수를 노출된 배아의 수로 나누어 계산하였다(치사된 배아의 수/노출된 배아의 수×100). 시험 농도 구간은 5개 이상으로 설정하고 Probit 분석법을 활 용하여 반수치사농도(half maximal lethal concentration; LC50)를 구하였다(Goh and Neff, 2003).
성능/효과
- 개체의 치사는 Benomyl 1㎎/\(l\)에서 확인되기 시작하여 농도가 높아지면서 치사 개체의 비율도 증가하는 것으로 나타났 다. 또한, Carbofuran과 Thiobencarb 역시 각각 100㎎/\(l\), 0.
- 대조군의 체장 은 11.8±0.3㎜로 나타났으며, Benomyl의 경우 1, 5, 10㎎/\(l\)로 농도가 증가함에 따라 11.6±0.3, 8.4±0.7, 5.3±0.9㎜로 농도 가 증가함에 따라 체장이 감소하였으며 5㎎/\(l\)이상의 농도에서 유의미한 차이를 나타냈다.
- 에서 확인되기 시작하여 농도가 높아지면서 치사 개체의 비율도 증가하는 것으로 나타났 다. 또한, Carbofuran과 Thiobencarb 역시 각각 100㎎/\(l\), 0.5 ㎎/\(l\)의 농도에서 치사된 배아가 확인되기 시작하여 농도에 비 례하여 치사율도 증가하였으며, Benomyl과 Thiobencarb의 경 우 각각 10㎎/\(l\), 25㎎/\(l\)의 농도에서 전치사 되는 것으로 확인 되었다. 기형개체의 경우 Benomyl 0.
- 75로 LC50과 EC50역시 두꺼비에 노출된 Carbofuran이 더 높은 농도에 서 영향을 나타냈고 Benomyl과 Thiobencarb는 유사한 농도 에서 영향을 미치는 것으로 확인되었다(Yoon and Ko, 2019). 또한, 실험에 사용된 농약 3종은 모두 TI 1.5이상을 나타내어 두꺼비의 배아발달에 최기형성물질로 작용하는 것을 확인 할 수 있었으며 특히, 본 실험에서는 Carbofuran과 Thiobencarb 가 0.1㎎/\(l\)의 농도부터 기형이 확인되어 Benomyl보다 낮은 농도에서 두꺼비 배아에 영향을 미치는 것으로 나타났으며 TI 값이 64.15로 확인되어 Benomyl 7.05, Thiobencarb 3.39에 비해 강력한 최기형성물질로 작용함을 알 수 있었다.
- 87㎎/\(l\)에 비해 더 민감하게 반응하는 것을 알 수 있었다(Saka, 2010). 또한, 청개구리를 대상으로 시험한 결과와 비교했을 때 Benomyl 7.04, Carbofuran 49.50, Thiobencarb 3.39의 TI값을 나타내어 Carbofuran을 제외한 Benomyl과 Thiobencarb은 두 종이 유 사한 농도에서 영향을 받는 것을 확인 할 수 있었으며, LC50Benomyl 7.04, Carbofuran 24.87, Thiobencarb 16.12, EC50 benomyl 1.00, Carbofuran 0.58, Thiobencarb 4.75로 LC50과 EC50역시 두꺼비에 노출된 Carbofuran이 더 높은 농도에 서 영향을 나타냈고 Benomyl과 Thiobencarb는 유사한 농도 에서 영향을 미치는 것으로 확인되었다(Yoon and Ko, 2019). 또한, 실험에 사용된 농약 3종은 모두 TI 1.
- 본 실험을 통해 Carbamate계 농약인 Benomyl과 Carbofuran, Thiobencarb 모두 두꺼비 배아발달에 있어 최기형성물질로 작 용하는 것으로 나타났다. 또한, 치사율 및 성장저해에 가장 민감 하게 반응하는 농약은 Benomyl로 확인되었으며, 기형유발 및 최기형성에 관해서는 Carbofuran이 가장 민감한 것으로 확인되 었다. 이러한 결과로 미루어보아 두꺼비의 번식기 및 활동기에 사용되는 농약류의 특성 상 두꺼비의 서식에 영향을 미칠 수 있을 것으로 판단되며, 사용시기가 비슷한 농약의 특성 상 다양 한 농약이 혼합되어 유입될 경우 이들의 공동상승효과(synergic effect)가 나타날 가능성이 클 것으로 판단되어지나 이에 대한 결과는 아직 없다.
- 본 실험을 통해 Carbamate계 농약인 Benomyl과 Carbofuran, Thiobencarb 모두 두꺼비 배아발달에 있어 최기형성물질로 작 용하는 것으로 나타났다. 또한, 치사율 및 성장저해에 가장 민감 하게 반응하는 농약은 Benomyl로 확인되었으며, 기형유발 및 최기형성에 관해서는 Carbofuran이 가장 민감한 것으로 확인되 었다.
- 3%, 50㎎/\(l\)이상에서는 모든 배아가 치사되어 나타났다(Figure 2). 이 를 통해 얻어진 결과를 probit 분석법으로 회귀분석을 시행한 결과 Benomyl의 LC50는 7.26㎎/\(l\), Carbofuran의 경우 560.74㎎/\(l\), Thiobencarb 16.70㎎/\(l\)를 나타냈다(Table 1, Figure 2).
- 0% 기형을 나타냈다(Figure 3). 이를 통해 얻어진 결과를 probit 분석법으로 회귀분석을 시행한 결과 Benomyl의 EC50는 1.03㎎/\(l\), Carbofuran의 경우 8.56㎎/\(l\), Thiobencarb 4.98㎎ /\(l\)를 나타냈다(Table 1).
- laevis 가 10μM이상의 농도부터 대조군과 차이를 나타내는 성장저 해가 일어난 것으로 확인되었다(Jin, 2005). 이상의 결과들은 농도에 따라 치사율과 기형율의 증가 및 성장이 저해되는 본 실험에서 확인된 결과와 유사한 경향을 나타내는 것으로 확인 되어지나 대부분의 결과가 두꺼비의 배아에 비해 낮은 농도에 서 개체의 치사 및 기형유발, 성장저해 등의 영향을 받는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 이러한 결과로 미루어보아 두꺼비의 번식기 및 활동기에 사용되는 농약류의 특성 상 두꺼비의 서식에 영향을 미칠 수 있을 것으로 판단되며, 사용시기가 비슷한 농약의 특성 상 다양 한 농약이 혼합되어 유입될 경우 이들의 공동상승효과(synergic effect)가 나타날 가능성이 클 것으로 판단되어지나 이에 대한 결과는 아직 없다. 또한, Carbamate계 농약류가 두꺼비 및 양서 류의 배아 발달에 미치는 영향과 그 작용기작을 규명하기 위해 서는 보다 구체적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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