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문제 정의
- 이에 저자는 체내의 濕熱 및 痰濁 제거에 효능이 있는 중만분소환의 비알코올성 지방간 질환에 대한 효능과 작용 기전을 연구하고자 HepG2 cell에 Palmitate 처리로 지방증을 유도한 후, 중만분소환 추출물을 투여하여 세포 내 지방량 및 SREBP-1c(sterol regulatory element-binding transcription factor-1c), ACC(acetyl-CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), SCD-1(stearoyl-CoA desaturase-1), AMPK(AMP-activated protein kinase)에 미치는 영향을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Palmitate 0.5 mM을 함유한 배지에서 24시간 동안 HepG2 cell을 배양하고, JMBSH 처리군에는 Nile Red staining 16시간 전 추출물 1,000 μg/mL을 투여하였다. Palmitate 및 JMBSH 처리된 HepG2 cell을 15분간 상온에서 4% paraformaldehyde로 고정하였다.
- JMBSH 투여에 따른 SREBP-1c와 AMPK의 변화를 관찰하고자 Western blot 분석을 시행하였다. Palmitate 0.5 mM을 함유한 배지에서 HepG2 cell을 24시간 배양하였고, JMBSH 투여군에는 검사 16시간 전 각각 추출물 700, 1,000 μg/mL을 처리한 후 Western blot으로 SREBP-1c 및 pAMPK protein level을 측정하였다. Total cell lysate는 protease inhibitor Cocktail(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 포함한 radioimmunoprecipitation assay(RIPA) buffer(50 mM Tris-HCl(pH 8.
- JMBSH 투여에 따른 ACC, FAS, SCD-1의 발현을 확인하기 위해 semi-quantitative RT-PCR을 시행하였다. Palmitate 0.5 mM을 함유한 배지에서 HepG2 cell을 24시간 배양하였으며, JMBSH 투여군에는 검사 16시간 전 각각 추출물 700, 1,000 μg/mL을 처리한 후 semi-quantitative RT-PCR로 ACC, FAS, SCD-1의 mRNA level을 측정하였다. total RNA를 추출하기 위해 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용했고, M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 추출된 total RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다.
- 5 mM을 함유한 배지에서 24시간 동안 HepG2 cell을 배양하고, JMBSH 처리군에는 Nile Red staining 16시간 전 추출물 1,000 μg/mL을 투여하였다. Palmitate 및 JMBSH 처리된 HepG2 cell을 15분간 상온에서 4% paraformaldehyde로 고정하였다. PBS로 세척한 뒤, 5분간 상온에서 Nile Red(100 ng/mL)로 처리하여 세포 내 중성 지방을 염색하였다.
- 본 실험에서는 HepG2 cell에 palmitate를 처리하여 비알코올성 지방간 질환 세포를 배양하였다. JMBSH이 간세포 내 지방 축적을 줄이는지 확인하기 위해 palmitate와 함께 JMBSH을 처리하였다.
- 또한 carbohydrate responsive element-binding protein(ChREBP), sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase(GPAT), 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase(HMG-CoA reductase)의 활성을 저해하여 anti-lipogenic effect를 갖는다37-39. 본 연구에서는 JMBSH의 anti-lipogenic effect가 AMPK와 관계가 있는지 확인하고자 HepG2 cell에 JMBSH을 투여하고 pAMPK의 변화를 관찰하였다. 그 결과 JMBSH은 pAMPK 단백을 증가시킨다는 점을 확인할 수 있었다.
- 중만분소환 추출물이 비알코올성 지방간에 미치는 영향을 연구하기 위해 palmitate 처리로 HepG2 cell에 지방증을 유도한 후, 세포 내 지방량 및 SREBP-1c, ACC, FAS, SCD-1, AMPK에 미치는 영향을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 지방증을 유도하기 위해 HepG2 cell에 Palmitate를 처리하였다. Palmitate를 isopropanol에 50 mM 농도가 되도록 용해시킨 후 최종 투약 농도 0.
대상 데이터
- Human hepatocellular carcinoma 세포주인 HepG2 cell은 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 중만분소환(Jungmanbunso-hwan)은 ≪醫學入門≫9에 수록된 처방으로, 약재들의 비율은 동일하게 하되 그 용량은 1/2로 줄여 구성하였다(Table 1). 약재는 동신대학교 부속 순천한방병원에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 중만분소환(Jungmanbunso-hwan)은 ≪醫學入門≫9에 수록된 처방으로, 약재들의 비율은 동일하게 하되 그 용량은 1/2로 줄여 구성하였다(Table 1). 약재는 동신대학교 부속 순천한방병원에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- JMBSH 투여에 따른 ACC, FAS, SCD-1의 발현을 확인하기 위해 semi-quantitative RT-PCR을 시행하였다. Palmitate 0.
- JMBSH 투여에 따른 SREBP-1c와 AMPK의 변화를 관찰하고자 Western blot 분석을 시행하였다. Palmitate 0.
- Nile red staining을 통해 JMBSH을 함께 처리한 경우 지방 축적이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. JMBSH이 간 내 지질 축적을 감소시키는 기전을 확인하기 위해 Western blot을 통해 JMBSH이 SREBP-1c에 미치는 영향을 관찰하였다. SREBP-1c는 간에서 지질의 합성을 유도하는 주요 전사 활성 인자로 ACC, FAS, 및 SCD-1과 같은 유전자들의 발현을 유도시켜 간 내 지방 합성을 촉진한다16.
성능/효과
- 1) 중만분소환 추출물은 모든 농도에서 세포 독성을 유발하지 않았다.
- 2) 중만분소환 추출물은 세포 내 지방 축적을 유의하게 감소시켰다.
- 3) 중만분소환 추출물은 lipogenesis에 관여하는 주요 전사 인자인 SREBP-1c를 유의하게 억제시켰다.
- 4) 중만분소환 추출물은 지방 합성 인자(ACC, FAS, SCD-1)들의 전사를 유의하게 억제시켰다.
- 5) 중만분소환 추출물은 pAMPK protein level을 유의하게 증가시켰다.
- 또한 semi-quantitative RT-PCR을 통해 JMBSH을 함께 처리한 경우 SREBP-1c에 의해 발현이 유도되는 ACC, FAS, SCD-1 역시 유의하게 감소하였음을 확인하였다. 따라서 JMBSH이 간세포 내 지방 축적을 완화시키는 작용은 SREBP-1c 억제를 통한 ACC, FAS, SCD-1의 발현 감소로 인해 나타난다는 것을 알 수 있었다.
- 이를 종합하면 JMBSH은 AMPK를 활성화시켜 SREBP-1c의 억제를 유발하고, 그에 따라 ACC, FAS, SCD-1의 발현을 감소시켜 anti-lipogenic effect를 나타내는 것으로 사료된다. 본 연구는 세포 단위 실험이므로 향후 비알코올성 지방간 질환 치료제로서의 중만분소환 활용 가능성에 대한 지속적인 동물 실험 및 임상 연구가 필요할 것으로 생각된다.
후속연구
- 이를 종합하면 JMBSH은 AMPK를 활성화시켜 SREBP-1c의 억제를 유발하고, 그에 따라 ACC, FAS, SCD-1의 발현을 감소시켜 anti-lipogenic effect를 나타내는 것으로 사료된다. 본 연구는 세포 단위 실험이므로 향후 비알코올성 지방간 질환 치료제로서의 중만분소환 활용 가능성에 대한 지속적인 동물 실험 및 임상 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이렇듯 비알코올성 지방간 질환의 발생과 관계된 것으로 알려져 있는 원인 질환들 모두 체내의 濕痰과 유의한 관계가 있다. 이에 저자는 체내의 濕熱 및 痰濁을 제거하는 효능을 갖고 있는 중만분소환이 비알코올성 지방간 질환 치료에 활용될 수 있을 것이라 생각하고 본 연구를 시행하였다.
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