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문제 정의
- 있다. 따라서 본 연구에서는 MLE 처리가 fibroblast 세포의 피부섬유구조 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 분석하고자 하였다. HSF에 독성을 나타내지 않은 10, 100, 그리고 200 ㎍/ml의 MLE를 24시간 동안 처리하고 fibronectin, COL1A2, 그리고 CCN2의 mRNA 발현수준을 분석하였다.
- 최근 아름다움에 대한 욕구 및 매스컴 등으로 인한 외모에 대한 관심의 증가를 통해 미용기능에 대한 수요가 급격히 증가하고 있으나, 이에 부합하는 미용소재에 대한 발굴은 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 기존에 항당뇨 소재로 잘 알려진 상엽의 미용기능 소재로서의 가능성에 대해 연구하고 그 작용기전을 탐색하고자 하였다.
- 따라서 MLE 처리에 의한 fibronectin 및 collagen 단백질의 발현 증가는 MLE가 피부의 탄력 및 구조를 유지하는데 기여할 수 있음을 의미한다. 또한 본 연구에서는 MLE의 미용기능이 CCN2 단백질에 의해 작용하는지 inhibitor assay를 통해 분석하였다. CCN2 하위 신호전달체계로 잘 열려진 TGF-β의 특이적 저해제인 SB431542를 MLE와 같이 처리한 후 fibronectin 및 CCN2 단백질의 발현을 분석한 결과, MLE는 CCN2 활성화를 통해 피부섬유구조단백질의 발현을 증가시키는 것으로 생각된다.
- 본 연구는 상엽 물 추출물 MLE가 기능성 미용소재로 효과적으로 사용될 수 있음을 제시하며, MLE의 미용 기능성은 CCN2 활성화와 밀접한 관련이 있음을 제시하였다. 추후 체계적인 기전분석 및 임상실험을 통해 MLE의 효능과 기전이 확보된다면 천연물을 활용한 의약품 및 기능성 식품 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것이라 생각한다.
- 본 연구에서는 상엽 물 추출물(MLE)을 제조하여 B16F10 melanoma 세포에서 melanin축적 억제활성 및 human skin fibroblasts (HSF)에서 피부섬유 단백질인 collagen, 그리고 fibronectin의 발현에 영향을 미치는지 알아보고자 하였으며, 상엽 추출물의 피부미용 소재로서의 이용 가능성에 대해 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 5% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, and phosphatase inhibitor cocktail)를 이용하여 cell extract를 모은 뒤 SDS/PAGE를 통해 단백질을 분리하고 이를 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane으로 transfer 하였다. 1%(w/v) bovine serum albumin (BSA) 용액으로 PVDF membrane을 blocking하고 표적 단백질에 관한 특정 항체를 반응시켰다. 이를 TBST (10 mM Tris, pH 7.
- B16F10 melanoma 세포에 1, 10, 50, 100, 200, 400, 그리고 800 ㎍/ml의 MLE를 72시간 처리한 후 B16F10 세포의 생존률을 MTT 분석법을 통해 알아보았다. B16F10 세포에 1, 10, 50, 100, 200, 그리고 400, ㎍/ml의 농도로 MLE를 처리한 결과, B16F10 세포의 생존률은 각각 105.
- B16F10 세포에 1 μM의 α-MSH 및 100 μM IBMX를 72시간 동안 처리하여 melanin 형성을 유도하였으며, Melanin 형성 유도기간에 각각 10, 100, 그리고 200 ㎍/ml의 MLE를 하여 melanin 축적 억제활성을 분석하였다. MLE를 각각 10, 100, 그리고 200 ㎍/ml의 농도로 처리하였을 때 대조군대비 melanin 축적 억제활성은 각각 95.
- 분석하였다. B16F10 세포와 HSF가 confluent 상태가 된 후, 두 세포에 MLE를 1, 10, 50, 100, 200, 400, 그리고 800 ㎍/ml의 농도로 처리하였다 (B16F10 세포 72시간, HSF는 24시간). MLE를 처리한 후 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.
- HSF 세포에 MLE를 24시간 동안 처리하고, 200 ㎕의 TRIzol®을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출된 total RNA에 100 ㎕의 chloroform을 넣고 15분 동안 상온에 정치한 뒤 14, 000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다.
- 따라서 본 연구에서는 MLE 처리가 fibroblast 세포의 피부섬유구조 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 분석하고자 하였다. HSF에 독성을 나타내지 않은 10, 100, 그리고 200 ㎍/ml의 MLE를 24시간 동안 처리하고 fibronectin, COL1A2, 그리고 CCN2의 mRNA 발현수준을 분석하였다. 아무것도 처리하지 않은 대조군 대비 MLE 처리는 fibronectin 및 CCN2의 발현수준을 농도 의존적으로 증가시켰으며 COL1A2 역시 MLE 처리군에서 증가하는 경향을 나타냈다 (Fig.
- 72시간 동안 처리하여 유도하였다. MLE를 10, 100, 그리고 200 ㎍/ml 농도로 α-MSH 및 IBMX와 병행 처리하여 B16F10 melanoma에서 melanin 축적 억제활성을 평가하였다. MLE를 처리한 후, B16F10 세포는 200 ㎕의 trypsin-EDTA 용액을 첨가하여 부착된 세포를 떼어 주었다.
- 400 ㎕의 dimethxylsulfoxide (DMSO)를 이용하여 3T3-L1 전지방세포내의 MTT formazan을 녹인 후, DMSO에 용해 된 MTT formazan을 96-well plate에 200 ㎕/well 씩 옮겨 microplate reader (VersaMax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. MLE를 처리하지 않은 B16F10 및 HSF 세포를 대조군으로 하여 세포생존률 (cell viability, % of control)을 계산하였다.
- 그 후 다시 18, 472xg에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 96-well plate에 200 ㎕/well 씩 옮겨 microplate reader (VersaMax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. MLE의 melanin 축적 억제활성은 MLE를 처리하지 않은 B16F10 세포를 대조군으로 하여 melanin 축적활성을 평가하였다.
- 본 실험에서는 MLE에 의해 발현이 증가되는 피부 섬유구조 단백질이 CCN2 활성화에 의한 것인지 확인해 보고자 CCN2의 하위신호전달체계인 transforming growth factor β (TGF-β) 특이적 저해제인 SB431542를 5 μM의 농도로 처리하였다. 10, 그리고 200 ㎍/ml의 MLE 처리는 예상데로 CCN2 및 fibronectin의 단백질 발현 수준을 증가시켰으나, SB431542를 병행 처리한 결과 MLE에 의해 증가된 CCN2 및 fibronectin의 발현 수준이 감소됨을 확인하였다 (Fig.
- 1%(w/v) bovine serum albumin (BSA) 용액으로 PVDF membrane을 blocking하고 표적 단백질에 관한 특정 항체를 반응시켰다. 이를 TBST (10 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% NP-40)로 여러 번 세척한 다음 horse radish peroxidase (HRP)와 결합한 2차 항체와 반응시키고 ECL을 이용하여 목적 단백질을 ChemiDoc Molecular Imager (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 확인하였다.
대상 데이터
- (Piscataway, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다. 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 그리고 chloroforme Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. dimethyl sulfoxide (DMSO), isopropanole Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
- (Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. AccuPower® Cycle Script RT PreMix와 각각의 primer들은 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구입하였으며, PCR PreMix (i-Taq)는 iNtRON (Seongnam, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dellas, TX, USA)에서 공급받아 사용하였다.
- B16F10 melanoma와 human skin fibroblasts (HSF)는 American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD USA)에서 분양받아 사용하였다. B16F10과 HSF 세포는 10%(v/v) FBS와 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin 이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 환경에서 2일 주기로 배지를 교체해주면서 배양하였다.
- 사용하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), penicillinstreptomycin, 그리고 phosphate-buffered saline (PBS)는 Welgene Inc. (Daegu, Korea)에서 구입하였다. Fetal bovine serum (FBS)은 GE Healthcare Bio-Sciences Co.
- (Daegu, Korea)에서 구입하였다. Fetal bovine serum (FBS)은 GE Healthcare Bio-Sciences Co. (Piscataway, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다. 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 그리고 chloroforme Sigma-Aldrich Co.
- dimethyl sulfoxide (DMSO), isopropanole Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. Trizol®은 Life Technologies, Inc. (Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. AccuPower® Cycle Script RT PreMix와 각각의 primer들은 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구입하였으며, PCR PreMix (i-Taq)는 iNtRON (Seongnam, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. dimethyl sulfoxide (DMSO), isopropanole Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. Trizol®은 Life Technologies, Inc.
- 또한 HSF에 동일한 농도의 MLE를 24시간 동안 처리하였을 때 1-200 ㎍/ml의 MLE는 HSF에 유의적인 독성을 나타내지 않았다. 따라서 본 연구에서는 독성이 나타나지 않은 상대적으로 안전한 200 ㎍/ml 이하의 MLE를 분석에 이용하였다. B16F10 melanoma 세포에 MLE를 처리하였을 때 melanin 축적이 유의적으로 감소하였다.
- 분리된 RNA는 정량한 뒤 SuperScriptII kit (Invitrogen)을 이용하여 42℃에서 1시간 동안 cDNA를 합성하였다. 본 실험에 사용된 fibronectin, collagen 1α2 (COL1A2), CCN2, 그리고 β-actin의 primer sequences는 Table 1과 같다.
- 본 실험에 사용된 상엽은 대한민국 부안에서 재배된 것으로 ㈜비아이지 (Daejeon, Korea)에서 제공받아 사용하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), penicillinstreptomycin, 그리고 phosphate-buffered saline (PBS)는 Welgene Inc.
- AccuPower® Cycle Script RT PreMix와 각각의 primer들은 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구입하였으며, PCR PreMix (i-Taq)는 iNtRON (Seongnam, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dellas, TX, USA)에서 공급받아 사용하였다.
데이터처리
- MLE for 24 h. Significant differences were analyzed by one-way ANOVA followed by t-test (*<0.05 vs untreated cells).
- 05에서 평균값들에 대한 유의성을 검증하였다. 각 항목은 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 시행하였으며, Student t-test 방법에 의하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다 (*<0.05, **<0.01, 그리고 ***<0.001).
- 모든 데이터는 평균±표준편차로 표현하였으며, 데이터의 통계처리는 Statistical Package for Social Science (SPSS, Chicago, USA)을 이용하여 분석하였다. 신뢰수준 p<.
- USA)을 이용하여 분석하였다. 신뢰수준 p<.05에서 평균값들에 대한 유의성을 검증하였다. 각 항목은 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 시행하였으며, Student t-test 방법에 의하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다 (*<0.
이론/모형
- B16F10 및 HSF에서 MLE의 세포독성은 MTT assay를 이용하여 분석하였다. B16F10 세포와 HSF가 confluent 상태가 된 후, 두 세포에 MLE를 1, 10, 50, 100, 200, 400, 그리고 800 ㎍/ml의 농도로 처리하였다 (B16F10 세포 72시간, HSF는 24시간).
성능/효과
- 1. B16F10 세포에서 MLE를 72시간 처리하였을 때 400 ㎍/ml의 농도까지 유의적인 세포독성이 관찰되지 않았으며, HSF 세포에 MLE를 24시간 처리하였을 때 200 ㎍/ml의 농도까지 유의적인 세포독성이 관찰되지 않았다.
- 본 실험에서는 MLE에 의해 발현이 증가되는 피부 섬유구조 단백질이 CCN2 활성화에 의한 것인지 확인해 보고자 CCN2의 하위신호전달체계인 transforming growth factor β (TGF-β) 특이적 저해제인 SB431542를 5 μM의 농도로 처리하였다. 10, 그리고 200 ㎍/ml의 MLE 처리는 예상데로 CCN2 및 fibronectin의 단백질 발현 수준을 증가시켰으나, SB431542를 병행 처리한 결과 MLE에 의해 증가된 CCN2 및 fibronectin의 발현 수준이 감소됨을 확인하였다 (Fig. 4). 이는 MLE 처리가 CCN2를 활성화 시켜 fibronectin 및 collagen 등의 피부섬유구조 단백질을 활성화 시키는 것으로 생각된다 (Fig.
- 2. 세포독성이 나타나지 않은 농도범위의 MLE를 1 μM의 α-MSH 및 100 μM IBMX를 72시간 동안 처리하여 melanin 형성을 유도한 후, 각각 10, 100, 그리고 200 ㎍/ml의 MLE를 병행 처리한 결과 MLE 처리는 유의적으로 melanin 축적을 억제하였다.
- 3. HSF에 MLE를 10, 100, 그리고 200 ㎍/ml의 MLE를 처리한 결과, MLE 처리는 fibronectin 및 CCN2의 발현수준을 농도 의존적으로 증가시켰으며 COL1A2 역시 MLE 처리군에서 증가하는 경향을 나타냈다.
- 4. 10, 그리고 200 ㎍/ml의 MLE 처리는 HSF 세포의 CCN2 및 fibronectin의 단백질 발현 수준을 증가시켰으나, TGF-β 특이적 저해제인 SB431542의 병행처리는 MLE에 의해 증가된 CCN2 및 fibronectin의 발현수준이 감소시켰다. 이는 MLE 처리가 CCN2 활성화를 통해 피부섬유구조 관련 단백질의 발현을 증가시키는 것으로 추측된다.
- 따라서 본 연구에서는 독성이 나타나지 않은 상대적으로 안전한 200 ㎍/ml 이하의 MLE를 분석에 이용하였다. B16F10 melanoma 세포에 MLE를 처리하였을 때 melanin 축적이 유의적으로 감소하였다. 이전 연구에 따르면 호장근 추출물이 α-MSH로 유도된 melanin 형성을 SK-MEL-2 세포에서 유의적으로 억제하였음을 보고하였고 18), 민들레 추출물이 B16F10 melanoma에서 tyrosinase 효소 활성을 억제하여 melanin 축적을 억제한다고 보고한 바 있다8).
- 생존률을 MTT 분석법을 통해 알아보았다. B16F10 세포에 1, 10, 50, 100, 200, 그리고 400, ㎍/ml의 농도로 MLE를 처리한 결과, B16F10 세포의 생존률은 각각 105.21%, 104.52%, 97.65%, 99.68%, 그리고 91.58%로 유의적인 세포독성은 관찰되지 않았다. 그러나 800 ㎍/ml 농도의 MLE를 72시간 처리하였을 때, 대조군 대비 세포생존률은 83.
- 또한 본 연구에서는 MLE의 미용기능이 CCN2 단백질에 의해 작용하는지 inhibitor assay를 통해 분석하였다. CCN2 하위 신호전달체계로 잘 열려진 TGF-β의 특이적 저해제인 SB431542를 MLE와 같이 처리한 후 fibronectin 및 CCN2 단백질의 발현을 분석한 결과, MLE는 CCN2 활성화를 통해 피부섬유구조단백질의 발현을 증가시키는 것으로 생각된다. 본 결과는 기존의 보고와 같이 CCN2는 세포의 부착, 이동, 상처회복, extracellular matrix (ECM)을 형성하고 유지하는데 기여할 것으로 생각되며, 기존에 보고된 CCN2 및 TGF-β의 기능에 대한 결과와 부합한다19).
- 1A). HSF에 MLE를 1, 10, 50, 100, 그리고 200 ㎍/ml의 농도로 처리한 결과, HSF의 세포 생존률은 100.87%, 95.42%, 95.41%, 그리고 97.68%로 세포의 성장에 영향을 미치지 않았으나 400 그리고 800 ㎍/ml의 MLE를 처리하였을 때 세포 생존률은 87.63%, 그리고 85.47%로 유의적으로 감소하였다 (Fig. 1B). 따라서 이후 실험에서는 200 ㎍/ml 이하의 MLE를 선택적으로 사용하였다.
- 24%로 나타났다. MLE 처리는 B16F10 세포에서 농도 의존적으로 melanin 축적을 억제하였으며, 200 ㎍/ml MLE 처리에서 melanin 축적이 유의적으로 감소하였다 (Fig. 2).
- melanin 축적 억제활성을 분석하였다. MLE를 각각 10, 100, 그리고 200 ㎍/ml의 농도로 처리하였을 때 대조군대비 melanin 축적 억제활성은 각각 95.47%, 88.65%, 그리고 58.24%로 나타났다. MLE 처리는 B16F10 세포에서 농도 의존적으로 melanin 축적을 억제하였으며, 200 ㎍/ml MLE 처리에서 melanin 축적이 유의적으로 감소하였다 (Fig.
- 않았다. 또한 HSF에 동일한 농도의 MLE를 24시간 동안 처리하였을 때 1-200 ㎍/ml의 MLE는 HSF에 유의적인 독성을 나타내지 않았다. 따라서 본 연구에서는 독성이 나타나지 않은 상대적으로 안전한 200 ㎍/ml 이하의 MLE를 분석에 이용하였다.
- 본 연구에서 MLE 처리는 human skin fibroblasts의 피부섬유구조 단백질의 유전자 발현 수준을 현저히 증가시켰다. 피부섬유구조 단백질은 피부의 진피층에 주로 존재하며, ECMe 피부섬유구조를 지탱하는 구조물의 역할로서 다량의 collagen, 그리고 fibronectin 등에 의해 구성된다1).
- 본 연구에서 상엽 물 추출물 MLE를 B16F10 melanoma 세포에 1, 10, 50, 100, 200, 400, 그리고 800 ㎍/ml의 MLE를 72시간 처리한 후 B16F10 세포의 생존률을 분석한 결과 1-400 ㎍/ml의 MLE는 B16F10 세포에 독성을 유발하지 않았다. 또한 HSF에 동일한 농도의 MLE를 24시간 동안 처리하였을 때 1-200 ㎍/ml의 MLE는 HSF에 유의적인 독성을 나타내지 않았다.
- HSF에 독성을 나타내지 않은 10, 100, 그리고 200 ㎍/ml의 MLE를 24시간 동안 처리하고 fibronectin, COL1A2, 그리고 CCN2의 mRNA 발현수준을 분석하였다. 아무것도 처리하지 않은 대조군 대비 MLE 처리는 fibronectin 및 CCN2의 발현수준을 농도 의존적으로 증가시켰으며 COL1A2 역시 MLE 처리군에서 증가하는 경향을 나타냈다 (Fig. 3).
- 위의 결과로부터 MLE에 의해 피부섬유구조 단백질인 fibronectin, COL1A2, 그리고 CCN2의 발현이 증가됨을 확인하였다. 본 실험에서는 MLE에 의해 발현이 증가되는 피부 섬유구조 단백질이 CCN2 활성화에 의한 것인지 확인해 보고자 CCN2의 하위신호전달체계인 transforming growth factor β (TGF-β) 특이적 저해제인 SB431542를 5 μM의 농도로 처리하였다.
- 최근의 연구에 따르면 피부세포의 성장과 증식이 ECM의 형성과 밀접하게 관련되어 있음이 보고되었고8), CCN2 단백질이 transforming growth factor-β (TGF-β) 신호전달체계 활성화를 통해 ECM의 합성에 관여하고 있으며, 상처를 회복하는 작용에도 CCN2 단백질이 밀접하게 관련되어 있음이 알려졌다9). 이상의 기 보고된 연구결과는 피부건강을 유지하는데 CCN2 단백질의 활성화는 피부세포의 성장, 분화, 상처 회복에 도움을 줄 수 있음을 시사한다.
후속연구
- 다양한 연구를 통해 천연물의 미백활성은 다양하게 보고되어 왔으며, 본 연구에서도 상엽 추출물 MLE는 B16F10의 melanin 형성을 효과적으로 억제하여 미백소재로서의 가능성을 나타냈다. 그러나 melanin 형성 억제에 있어 MLE 처리에 의한 tyrosinase의 활성에 미치는 효과, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), dopachrome tautomerase, 그리고dopaquinone 형성에 미치는 영향 등을 체계적으로 분석하여 MLE의 미백 활성에 대한 기전을 규명하는 연구가 추가로 요구된다. 또한 본 연구에 사용된 B16F10 melanoma 세포는 melanin 형성억제에 대해 다방면으로 활용되기는 하지만 암세포의 성격을 지니고 있어, 추후 동물에서 분리한 primary 세포모델을 확립하여 일반 세포주에서 MLE의 melanin 형성 억제에 대한 추가적인 검증이 필요하다고 생각한다.
- 그러나 melanin 형성 억제에 있어 MLE 처리에 의한 tyrosinase의 활성에 미치는 효과, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), dopachrome tautomerase, 그리고dopaquinone 형성에 미치는 영향 등을 체계적으로 분석하여 MLE의 미백 활성에 대한 기전을 규명하는 연구가 추가로 요구된다. 또한 본 연구에 사용된 B16F10 melanoma 세포는 melanin 형성억제에 대해 다방면으로 활용되기는 하지만 암세포의 성격을 지니고 있어, 추후 동물에서 분리한 primary 세포모델을 확립하여 일반 세포주에서 MLE의 melanin 형성 억제에 대한 추가적인 검증이 필요하다고 생각한다.
- 이상의 연구는 상엽 추출물의 미백 활성 및 피부섬유구조단백질의 발현증가를 통해 기능성 미용소재로 활용될 수 있다는 가능성을 제시하였다. 또한 상엽 추출물의 기능성에 있어 CCN2의 활성화가 관여하고 있음을 밝혔다.
- 활성화와 밀접한 관련이 있음을 제시하였다. 추후 체계적인 기전분석 및 임상실험을 통해 MLE의 효능과 기전이 확보된다면 천연물을 활용한 의약품 및 기능성 식품 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것이라 생각한다.
- 또한 상엽 추출물의 기능성에 있어 CCN2의 활성화가 관여하고 있음을 밝혔다. 향후 본 연구의 결과는 피부관련 의약품 보조제, 처방, 화장품 및 미용기능식품의 개발에 유용한 연구자료로 사용될 수 있을 것이라 사료된다.
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