[논문]E. coli 유래 pheA 유전자의 되먹임제어 저항성 돌연변이의 구축과 그 단백질의 생화학적 특성 연구

카오틴팟; 이상현; 홍광원; 이성행

doi:10.7845/kjm.2016.6053

E. coli 유래 pheA 유전자의 되먹임제어 저항성 돌연변이의 구축과 그 단백질의 생화학적 특성 연구
Development of the feedback resistant pheAFBR from E. coli and studies on its biochemical characteristics 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.52 no.3, 2016년, pp.278 - 285

카오틴팟 (조선대학교 의과대학 세포분자의과학교실) , 이상현 (고려대학교 대학원 생명공학과) , 홍광원 (동국대학교 식품생명공학과) , 이성행 (조선대학교 의과대학 세포분자의과학교실)

초록
AI-Helper

E. coli의 PheA 단백질은 chorismate mutase and prephenate dehydratase (CMPD) 활성을 가지며 마지막 산물인 페닐알라닌에 의하여 되먹임제어가 되는 생합성 경로의 주요 조절 효소 중의 하나이다. 그러므로, 이 PheA 단백질은 필수 아미노산 중의 하나인 페닐알라닌의 대량 생산에 이용하기 위한 단백질 공학의 타겟이 될 수 있다. 이러한 목적으로 PheA 단백질의 마지막 생산물인 페닐알라닌에 의한 되먹임저해 저항성 유전자원을 선별하였다. 이 유전자의 산물인 $PheA^{FBR}$은 118번째 류신이 페닐알라닌으로 치환되었고, 기질인 prephenate에 대한 친화도가 야생주단백질과 비교하여 약 3.5배 정도 높았다. $PheA^{FBR}$은 세포내에서 축척되어져 되먹임저해를 하는 페닐알라닌 농도에서(약1 mM와 10 mM)에서도 50%와 40%의 활성을 유지 하고 있었고, 페닐알라닌 존재하에서 기질의 결합 성향이 협동적(cooperative) 모드에서 단독적(hyperbolic) 모드로 전환되었다. 이는 기존 연구와 비교해 볼 때, 이 돌연변이 부위는 이 융합기능 효소인 PheA 단백질의 새로운 조절 부위의 존재를 암시 한다. 효소 동력학적 결과는 PheA 단백질의 되먹임저해 저항성 획득이 아미노산 돌연변이에 의한 단백질 구조의 변화 유도에 의한 것으로 생각된다. 더 나아가, 본 연구에서 선별된 돌연변이 유전자는 생물전환법을 이용한 필수아미노산 생산에 산업적으로 응용 가능성이 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

The bifunctional PheA protein, having chorismate mutase and prephenate dehydratase (CMPD) activities, is one of the key regulatory enzymes in the aromatic amino acid biosynthesis in Escherichia coli, and is negatively regulated by an end-product, phenyalanine. Therefore, PheA protein has been thought as useful for protein engineering to utilize mass production of essential amino acid phenylalanine. To obtain feedback resistant PheA protein against phenylalanine, we mutated by using random mutagenesis, extensively screened, and obtained $pheA^{FBR}$ gene encoding a feedback resistant PheA protein. The mutant PheA protein contains substitution of Leu to Phe at the position of 118, displaying that higher affinity (about $290{\mu}M$) for prephenate in comparison with that (about $850{\mu}M$) of wild type PheA protein. Kinetic analysis showed that the saturation curve of $PheA^{FBR}$ against phenyalanine is hyperbolic rather than that of $PheA^{WT}$, which is sigmoidal, indicating that the L118F mutant enzyme has no cooperative effects in prephenate binding in the presence of phenylalanine. In vitro enzymatic assay showed that the mutant protein exhibited increased activity by above 3.5 folds compared to the wild type enzyme. Moreover, L118F mutant protein appeared insensitive to feedback inhibition with keeping 40% of enzymatic activity even in the presence of 10 mM phenylalanine at which the activity of wild type $PheA^{WT}$ was not observed. The substitution of Leu to Phe in CMPD may induce significant conformational change for this enzyme to acquire feedback resistance to end-product of the pathway by modulating kinetic properties.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구에서 사용된 균주 및 플라스미드는 Table 1에 명시하였다. E. coli JH24 균주는 페닐알라닌 생합성 관계 효소들 중 pheA 유전자를 결손시켜, 본 연구의 목적에 최적화 시켰다. pLC150 플라스미드는 pBC322 (pBR322-Δtet) 플라스미드에 E.
본 연구에서는 E. coli에서의 방향족 아미노산 생합성 경로를 조절하는 주요 효소인 PheA 단백질의 되먹임제어 저항성 돌연변이(PheA^FBR)를 선별하고, 그 효소의 효소동력학적(enzyme kinetics) 성상을 연구하였다. 되먹임제어 저항성 돌연변이 유전자를 고농도의 페닐알라닌 유도체 존재하에서 선별하였다.
세포조효소액을 이용한 선행된 활성 연구로 되먹임제어 저항성 유전자원을 선별한 후, 선별된 PheA^FBR 단백질의 되먹임 제어 저항의 메커니즘을 치환된 아미노산과 연계하여 정확히 이해하기 위하여 효소동력학 연구를 수행하였다. 효소동력학 연구는 분리정제된 PheA^WT와 PheA^FBR 단백질이 준비되어야 하기 때문에, 각 단백질을 E.
coli JH24를 NTG로 처리한후, 5 mg/ml의 페닐알라닌 유사체인 m-PF 또는 p-PF를 포함하는 최소배지에서 3–7일이 지난 후 최종적으로 p-PF 함유 배지에서만 8개의 콜로니를 얻을수 있었다. 이 유전자들은 다시 새로운 벡터(pBC322)에 클로닝 시켜 벡터부분의 손상에 의한 실험적 오류를 없애고자 하였다. 얻어진 유사체 저항성 유전자들의 페닐알라닌에 대한 저해도를 알아보기 위하여, 이 p-PF에 저항성이 있는 플라스미드를 함유하는 E.
따라서, 두 가지 기능을 가진 도메인들(CM/PD)이 융합된 PheA 단백질에서 정확한 기질 결합 부위와 다른자리입체성 조절 부위에 대한 정보가 부재하므로, 되먹임저해를 구조적으로 저항성을 나타낼 수 있는 정확한 부위를 예측할 수가 없는 실정이다. 이에, 본 연구에서는 방향족 아미노산 생산에 산업적으로 유용하게 쓰일 수 있는 되먹임저해에 저항성을 보이는 PheA^FBR 유전자를 확보하기 위하여, 무작위적돌연변이 유발법(random mutagenesis)을 이용하여 유전자원을 확보하고, 그 유전자 산물인 PheA^FBR 단백질의 생화학적 연구를 통하여 돌연변이 위치의 기능을 다른자리입체성조절 측면에서의 분석하고자 하였다.

제안 방법

N-말단에 6x His tag을 가진 PheA^WT 또는 PheA^FBR 단백질이 발현된 세포조효소액을 Ni-NTA affinity resin (Qiagen)이 충진된 컬럼을 통과시킨 후, 50 mM imidazole이 함유된 완충용액으로 결합하지 않은 E. coli 단백질들을 씻어 내고 원하는 단백질을 용출용액(50 mM Tris-Cl; pH 7.5, 500 mM NaCl, 200 mM imidazole)을 이용하여 회수하였다(Fig. 2). 얻어진 단백질에서 N-말단에 6x His tag을 thrombin 처리로 제거하기 위하여, 단백질 용액을 투석하여 NaCl의 농도를 150 mM로 낮춘 후에 7 unit의 α-thrombin (Hematogolic Technology Inc.
PheA 단백질 과발현은 pET28a(+)-pheAWT 또는 pheAFBR를 포함하는 E. coli BL21(DE3)을 Kanamycin (50μg/ml)이 포함된 LB 배지에서 대수기(OD600~0.6)까지 37oC 에서 배양한후, 1 mM IPTG로 37℃에서 5시간 동안 과발현을 유도하였다.
PheA 단백질의 기질인 prephenate에 대한 농도의존성 동력학적 지표 결정 실험은 각 기질 농도에 대하여 triplicate 실험에 의한 통계적 처리에 의하여 수행되었다. Km과 Vmax는 Sigmaplot curve-fitting 프로그램(JandelScientific)을 사용하여 계산되었다
PheA 단백질의 분리정제를 위하여, 이에 상응하는 DNA 절편을 pLC150을 template로 사용하여 올리고뉴클레오티드 프리이머로(pheAFor: 5′-GGTGGTCATATGACATCGGAAAACCCGTTACTGGCGC-3′,pheARev: 5′-ACCACCGAATTCTCAGGTTGGATCAACAGGCACTACG-3′) PCR하여 획득하였다.
pLC150 플라스미드는 pBC322 (pBR322-Δtet) 플라스미드에 E. coli의 pheA 유전자를 함유하는 DNA 절편은 EcoRI-BamHI 제한효소 부위에 클로닝하여 구축하였다.
생성된 phenylpyruvate의 농도는 320 nm에서의 몰흡광계수(17,500)를 이용하여 계산하였다. 대조실험군(blank)인 기질 자체에 대한 흡광도는 단백질 첨가 전에 NaOH 용액을 가한 상층액의 흡광도를 이용하여 측정하였다. 효소활성은 위 실험 조건에서 prephenate 1.
되먹임저해에 대한 민감도에 저항성을 나타내는 유전자(pheA^FBR)의 돌연변이 부위를 정확히 알기 위하여, 총1,158 뉴클레오타이드에 대한 염기서열을 결정하였다(Macrogen). 그 결과 야생유전자 서열의 352번째 시토신이 티민으로 치환(C→T)되었다(Table 3).
단백질의 효소동력학적 특성 연구는 돌연변이된 아미노산 부위가 효소 전체의 기능에 미치는 역할을 이해 하는데필수적이다. 따라서 PheA 단백질의 기능인prephaenate dehaydratase (PD)의 활성에 대한 동력학적 변수와 페닐알라닌 존재시 활성을 비교 연구하였다(Table 4). 기질인 prephenate에 대한 PD의 동력학적 변수들은 MichaelisMenten equation에 의한 초기속도로 측정되었다(Table 4).
coli의 배양 조건 및 세포조효소액 준비과정에서 나타난 실험의 부정확성이 있을 수 있다. 따라서 정확한 되먹임제어 저항성 돌연변이 유전자의 정보와 그 산물에 대한 효소동력학적 관점에서의 해석이 필요하므로, pheA^FBR 유전자의 염기서열 결정과 그 단백질의 분리정제를 실시하였다.
본 연구에서 선별된 PheA^FBR 단백질의 정확한 되먹임제어 저항성에 대한 동력학적 성상을 알아보기 위하여, 분리정제된 단백질로 PD 활성에 대한 되먹임저해(feedback inhibition) 실험을 수행하였다(Fig. 3). 이 단백질 활성의 조절자인 페닐알라닌이 1 mM 존재시, 야생주단백질(PheA^WT)은 95%의 활성을 잃었지만 선별된 PheA^FBR 단백질은 같은 페닐알라닌 농도에서 50%의 활성을 유지하고 있었다(Fig.
6)까지 37oC 에서 배양한후, 1 mM IPTG로 37℃에서 5시간 동안 과발현을 유도하였다. 분리 정제를 위한 세포조효소액 준비는 사용한 완충용액(50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT)을 제외하고 위와 동일하게 시행하였다.
이 추출된 pLC150을 제한효소 NdeI-EcoRI으로 처리한후 다시 새로운 플라스미드에 클로닝하여 JH24(pheA-)에 형질전환 시킨 후, 페닐알라닌 구조 유사체(analogue)인 p-fluorophenylalanine(p-FP)과 m-fluorophenylalanine(m-FP)을 5 mg/ml 농도로 포함하는 최소고체 배지에서 3–7일 동안 37℃에서 배양하였다. 생성된 E. coli 군락으로부터 pLC150 플라스미드를 추출하여 pheA 유전자의 염기서열을 결정하였다.
PheA 단백질의 분리정제를 위하여, 이에 상응하는 DNA 절편을 pLC150을 template로 사용하여 올리고뉴클레오티드 프리이머로(pheAFor: 5′-GGTGGTCATATGACATCGGAAAACCCGTTACTGGCGC-3′,pheARev: 5′-ACCACCGAATTCTCAGGTTGGATCAACAGGCACTACG-3′) PCR하여 획득하였다. 얻어진 1.1 kb의 DNA 절편을 NdeI-EcoRI 제한 효소로 절단하여, 과발현 벡터인 pET28a(+)에 클로닝하였다.
얻어진 단백질에서 N-말단에 6x His tag을 thrombin 처리로 제거하기 위하여, 단백질 용액을 투석하여 NaCl의 농도를 150 mM로 낮춘 후에 7 unit의 α-thrombin (Hematogolic Technology Inc.)을 가하여 상온에서 5시간 동안 반응하였다.
그림에서와 같이 발현정도는 높았으며, His tag과 친화도가 높은 resine에 목적 단백질의 크기(~43 kDa)와 결합하는 정도로 보아 정상적인 전사와 번역을 거친 융합단백질이 발현되었음을 알 수 있었다. 얻어진 단백질은 His-tag과 목적단백질 사이에 단백질 분해효소인 thrombin 절단 부위를 포함하기 때문에, 이 단백질 분해 효소를 이용하여 His-tag을 함유한 부위(~2 kDa)를 절단하였다. 최종적으로 얻어진 단백질은 예상과 같이 ~41 kDa 크기의 고순도로 정제되었다(Fig.
얻어진 유사체 저항성 유전자들의 페닐알라닌에 대한 저해도를 알아보기 위하여, 이 p-PF에 저항성이 있는 플라스미드를 함유하는 E. coli JH24의 세포조효소액에 포함된 PheA 단백질의 기능인 prephenate dehayratase (PD)의 활성을 0–10 mM페닐알라닌 존재하에서 측정하였다.
위 두 단백질의 기질친화도와 활성과의 관계를 더 정확히 알기위해, 일정 농도의 페닐알라닌 존재시 기질농도 의존적 활성을 측정하였다(Fig. 4). 페닐알라닌이 각각 0, 0.
0)로 두 번 세척하였다. 이 E. coli들을 세척즉시 완전배지(LB broth)에서 24시간 배양 후, NTG가 처리된 pLC150 플라스미드를 추출하였다. 이 추출된 pLC150을 제한효소 NdeI-EcoRI으로 처리한후 다시 새로운 플라스미드에 클로닝하여 JH24(pheA-)에 형질전환 시킨 후, 페닐알라닌 구조 유사체(analogue)인 p-fluorophenylalanine(p-FP)과 m-fluorophenylalanine(m-FP)을 5 mg/ml 농도로 포함하는 최소고체 배지에서 3–7일 동안 37℃에서 배양하였다.
이 추출된 pLC150을 제한효소 NdeI-EcoRI으로 처리한후 다시 새로운 플라스미드에 클로닝하여 JH24(pheA-)에 형질전환 시킨 후, 페닐알라닌 구조 유사체(analogue)인 p-fluorophenylalanine(p-FP)과 m-fluorophenylalanine(m-FP)을 5 mg/ml 농도로 포함하는 최소고체 배지에서 3–7일 동안 37℃에서 배양하였다.
이러한 목적으로 PheA 단백질의 마지막 생산물인 페닐알라닌에 의한 되먹임저해 저항성 유전자원을 선별하였다.
2: lanes 2 and 3)을 Ni-NTA resin에 통과시켰다. 이어서 resine에 결합하지 않거나 약하게 결합한 단백질을 씻어낸 후(Fig. 2: lane 4), 높은 imidazole 농도의 완충용액으로 N-terminal에 6x His tag을 함유한 PheA^WT와 PheA^FBR 단백질을 추출하였다(Fig. 2: lane 5). 그림에서와 같이 발현정도는 높았으며, His tag과 친화도가 높은 resine에 목적 단백질의 크기(~43 kDa)와 결합하는 정도로 보아 정상적인 전사와 번역을 거친 융합단백질이 발현되었음을 알 수 있었다.
잘려진 6x His tag과 남아있는 thrombin을 제거하기 위하여 prephenate dehydratase(PD) 활성 측정 용액(50 mM Tris-Cl; pH 8.2, 1 mM Na2EDTA, 10 mM β-mercaptoethanol)으로 평형을 이룬HiLoadTM 16/600 Superdex 200 pg column (GE Health)에 위 단백질 용액을 통과 시켜 size-exclusion chromatograpy를 시행하였다.
단백질의 되먹임 제어 저항의 메커니즘을 치환된 아미노산과 연계하여 정확히 이해하기 위하여 효소동력학 연구를 수행하였다. 효소동력학 연구는 분리정제된 PheA^WT와 PheA^FBR 단백질이 준비되어야 하기 때문에, 각 단백질을 E. coli에서 대량발현 시키기 위하여 pET28a(+) 과발현 벡터에 클로닝하여 각 단백질을 대량 발현시켰다.

대상 데이터

coli에서의 방향족 아미노산 생합성 경로를 조절하는 주요 효소인 PheA 단백질의 되먹임제어 저항성 돌연변이(PheA^FBR)를 선별하고, 그 효소의 효소동력학적(enzyme kinetics) 성상을 연구하였다. 되먹임제어 저항성 돌연변이 유전자를 고농도의 페닐알라닌 유도체 존재하에서 선별하였다. 이 돌연변이는 118번째 아미노산인 류신(Leucine)이 페닐알라닌(Phenyalanine)으로 치환된 돌연변이로 판명되었다(Table 3).

데이터처리

PheA 단백질의 기질인 prephenate에 대한 농도의존성 동력학적 지표 결정 실험은 각 기질 농도에 대하여 triplicate 실험에 의한 통계적 처리에 의하여 수행되었다. Km과 Vmax는 Sigmaplot curve-fitting 프로그램(JandelScientific)을 사용하여 계산되었다

이론/모형

PheA^WT shows sigmoidal fitting in the presence of end-product phenylalanine (A), whereas the mutation occurred at L118F in PheA^FBRchanges inhibitor-dependent binding of substrate to hyperbolic (B), indicating that the amino acid substitution might prevent the oligomerization of mutant protein. Data are averages of triplicate determinations and were fitted to Michelis-Menten equation.
따라서 PheA 단백질의 기능인prephaenate dehaydratase (PD)의 활성에 대한 동력학적 변수와 페닐알라닌 존재시 활성을 비교 연구하였다(Table 4). 기질인 prephenate에 대한 PD의 동력학적 변수들은 MichaelisMenten equation에 의한 초기속도로 측정되었다(Table 4). PheA^WT와 PheA^FBR의 Kcat은 거의 비슷하나, 기질인 prephenate와의 친화도를 나타내는 Km은 PheA^WT (0.
, 1999). 방향족 아미노산인 페닐알라닌 생합성 과정에서 주요 효소인 PheA 단백질을 대상으로 페닐알라닌에 의한 되먹임제어 저항성(feedback resistance) 돌연변이 유전자를 확보하기 위하여 NTG를 이용한 무작위적 돌연법이법을 사용하였다. pheA 유전자를 함유한 pLC150 플라스미드로 형질전환된 페닐알라닌 요구주(auxotroph)인 E.

성능/효과

기질인 prephenate에 대한 PD의 동력학적 변수들은 MichaelisMenten equation에 의한 초기속도로 측정되었다(Table 4). PheA^WT와 PheA^FBR의 Kcat은 거의 비슷하나, 기질인 prephenate와의 친화도를 나타내는 Km은 PheA^WT (0.847 mM)이 PheA^FBR(0.287 mM) 보다 약 3배 정도 높았다. 하지만, 효소효율도의 척도인 Kcat/Km은 PheA^FBR이 약3배 더 높았다.
pheA 유전자를 함유한 pLC150 플라스미드로 형질전환된 페닐알라닌 요구주(auxotroph)인 E. coli JH24를 NTG로 처리한후, 5 mg/ml의 페닐알라닌 유사체인 m-PF 또는 p-PF를 포함하는 최소배지에서 3–7일이 지난 후 최종적으로 p-PF 함유 배지에서만 8개의 콜로니를 얻을수 있었다.
그 결과 야생유전자 서열의 352번째 시토신이 티민으로 치환(C→T)되었다(Table 3).
그 이상의 페닐알라닌의 농도(5–10 mM)에서는 PheAFBR은 거의 30–40%의 활성을 유지하는 반면, 야생주의 활성은 거의 보이지 않았다.
2: lane 5). 그림에서와 같이 발현정도는 높았으며, His tag과 친화도가 높은 resine에 목적 단백질의 크기(~43 kDa)와 결합하는 정도로 보아 정상적인 전사와 번역을 거친 융합단백질이 발현되었음을 알 수 있었다. 얻어진 단백질은 His-tag과 목적단백질 사이에 단백질 분해효소인 thrombin 절단 부위를 포함하기 때문에, 이 단백질 분해 효소를 이용하여 His-tag을 함유한 부위(~2 kDa)를 절단하였다.
5배 이상의 활성을 보였다. 또한, E. coli JH24/pLC150 세포조효소액은 1 mM 및 5mM 페닐알라닌 농도에서 보여준 활성과 비교하여 7.2배 및 15배의 활성을 나타내었다(Table 2). E.
3%의 저항성을 유지한다는 것을 의미한다. 또한, 높은 농도의 페닐알라닌(5, 10 mM) 존재하에서의 야생 유전자 함유 세포조효소액(pLC150) 보다 각각 4배와 22배의 증가된 저항성을 나타내었다(Table 2). 위 결과는 선별된 돌연변이 유전자 단백질이 세포내 생화학 경로에서 주요 효소로써 어느 정도 조절능력이 상실(deregulated)되었고, 해당 경로의 마지막 산물에 의한 되먹임저해에 대한 민감도에 저항성을 획득했다고 판단되어 진다.
coli 야생균주인 W3110의 세포조효소액은 1 mM 페닐알라닌 존재하에서 약91%의 활성이 저해 되었고, 5 mM에서는 활성이 거의 측정되지 않았다(Table 2). 반면에 E. coli JH24/pLC150 (pBR322: pheA^WT)에서 얻어진 추출물은 페닐알라닌이 존재하지 않는 조건에서 균주자체보다 약6배의 활성을 보였고, 5 mM의 페닐알라닌 존재하에서도 약 20%의 활성이 남아 있었다. 이는 gene dosage 효과에 의한 되먹임제어 저항성인 것으로 사료된다.
이 결과는 PheAFBR 단백질에서 일어난 L118F 아미노산치환 돌연변이가 PheAWT 단백질이 정상적으로 되먹임제어를 받는 세포내 페닐알라닌 농도(0.6–1 mM)에서도 50% 이상 저해를 받지 않는 효과를 가져왔다고 판단된다
2: lane 6). 이 결과는 구축된 과발현 시스템으로 용해성 목적 단백질이 발현되었고, 효소동력학 연구에 적합한 농도와 순도로 순수분리 되었다는 것을 의미한다.
3). 이 단백질 활성의 조절자인 페닐알라닌이 1 mM 존재시, 야생주단백질(PheA^WT)은 95%의 활성을 잃었지만 선별된 PheA^FBR 단백질은 같은 페닐알라닌 농도에서 50%의 활성을 유지하고 있었다(Fig. 3). 그 이상의 페닐알라닌의 농도(5–10 mM)에서는 PheA^FBR은 거의 30–40%의 활성을 유지하는 반면, 야생주의 활성은 거의 보이지 않았다.
이 유전자의 산물인 PheAFBR은 118번째류신이 페닐알라닌으로 치환되었고, 기질인 prephenate에 대한친화도가 야생주단백질과 비교하여 약 3.5배 정도 높았다.
이는 gene dosage 효과에 의한 되먹임제어 저항성인 것으로 사료된다. 이와 비교하여, 8종류의 유사체 저항 가능성을 가진 돌연변이 중에서 한 종류의 클론만이 페닐알라닌에 대해 유의한 정도의 활성 저항성을 나타내었다. 이 유전자를 pheA^FBR이라 명명하고, 이를 포함하는 플라스미드를 pLC151 (pBR322:pheA^FBR)이라 명명하였다(Table 1).
효소 활성은 발현주의 세포조효소액과 고순도로 분리정제된 단백질 모두 비슷한 활성을 보였다. 흥미롭게도, 야생주 단백질과 그 활성을 비교해 볼 때, 3배 이상의 활성 증가를 보였다(Table 4). 방향족 아미노산들인 타이로신 또는 트립토판에 의한 조절을 받지 않는 돌연변이 단백질은 보고 된 바있으나(Choi and Tribe, 1982; Hwang et al.

후속연구

더 나아가, 본 연구에서 선별된 돌연변이 유전자는 생물전환법을 이용한 필수아미노산 생산에 산업적으로 응용 가능성이 있다.
, 1985), 페닐알라닌에 의한 저해 저항성 돌연변이는 보고 된 바 없었다. 따라서, 본 연구에서 무작위적 돌연변이 방법에 의해 선별된 pheA^FBR유전자는 방향족 아미노산 생합성 경로의 조절기작을 더 세밀하게 이해하는데 유용하게 이용 될 것으로 사료된다. 효소동력학 연구의 결과, 이 돌연변이는 야생주단백질의 페닐알라닌 의존성 기질 전환을 협동적(cooperative)인 기질과의 결합에서 단독적인 결합 방법으로 변환 시키는 것으로 판단된다.
coli 내에서 PheA 단백질의 다량체로의 존재가 페닐알라닌의 축척에 따른 조절효소를 효율적으로 제어할 수 있도록 고안되었다는 것을 보여준다. 이런 동력학적 연구의 결과와 단백질 자체의 기능 사이에 상관관계를 설명하기 위하여,이 단백질의 삼차원적 구조 연구가 필수적이라 하겠다. 그러나, 현재까지 보고된 E.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	E.coli의 PheA 단백질이란 무엇인가?	E. coli의 PheA 단백질은 chorismate mutase and prephenate dehydratase (CMPD) 활성을 가지며 마지막 산물인 페닐알라닌에 의하여 되먹임제어가 되는 생합성 경로의 주요 조절 효소 중의 하나이다. 그러므로, 이 PheA 단백질은 필수 아미노산 중의 하나인 페닐알라닌의 대량 생산에 이용하기 위한 단백질 공학의 타겟이 될 수 있다.
	병원성 미생물 치료제의 표적이 될 수 있는 방향족 아미노산의 생합성 경로의 특징은 무엇인가?	, 2016). 특이하게도 방향족 아미노산의 생합성 경로는 미생물에만 특정되고 인간 간세포에는 발생경로에서 제외되어 있어서, 의학적으로 Mycobacterium tuberculosis 등의 병원성 미생물 치료제의 타겟이 될 수 있다(Parish and Stoker, 2002). 위와 같은 다양한 생물학적 유용성 때문에 방향족 아미노산인 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판은 오래전부터 화학적으로 합성되어 왔으나, 현재는 포도당 또는 미생물 생합성 경로의 중간 물질 탄소원으로부터 직접 발효 및 미생물의 특정 효소를 이용하는 미생물전환(microbial conversion)법을 이용하여 생산하고 있다(Hwang, 1985; Parish and Stoker, 2002).
	pheA 유전자에 의해 암호화되는 PheA 이중기능효소의 2가지 기능은 무엇인가?	이 생합성 경로에서 페닐알라닌은 pheA 유전자에 의해 암호화되는 chorismate mutase/prephenate dehydratase (CMPD 또는 PheA)라는 이중기능효소(bifunctional enzyme)에 의하여 chrismate로 부터 합성이 시작된다. 이 효소는 shikimate pathway에 의하여 생성된 chrismate를 prephenate로 전환하는 chorismate mutase 기능과, 다음 반응인 prephenate를 phenylpyruvate로 전환 시키는 prephenate dehydratase 기능을 한 효소에서 동시에 가지고 있다(Fig. 1).

참고문헌 (21)

Aida, K., Chibata, I., Nakayama, K., Takinami, K., Yamada, H. 1986. Biotechnology of amino acid production, pp. 188. Progress in Industrial Microbiology. 24. Tokyo: Kodansha; Ltd, Amsterdam: Elservier Science Publ.
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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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