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문제 정의
- 따라서 고환 간질세포의 구조와 기능에 관하여 명확하게 밝혀지지 않은 한우를 대상으로 출생 후 14 주령부터 104 주령까지 일반조직학적인 방법 및 형태계측학적 방법으로 간질세포의 용적치밀도, 절대용적, 평균세포 용적 및 고환 내 총 숫자의 변화를 구명하기 위하여 이 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 초박절편기(Ultramicrotome, Leica ultracuts, Austria)를 사용하여 1 μm 두께의 후박절편(seminthin section)을 제작한 후 1% methylene blue-azure II로 염색하여, 광학현미경(Leica, DMRBE. Germany)을 사용하여 관찰하였고, 곱슬정세관의 직경 및 각 세포핵의 크기는 영상분석기(image analyzer system, Leica Q500MC, Germany)를 사용하여 측정하였다.
- 28 μm2), D는 평균 핵의 직경, T는 평균절편 두께, ST(total shrinkage=histologic correction factor)는 총 고환조직의 고정 전, 고정 후, 표본제작 후의 총 수축량, h는 가장 작다고 생각되는 핵의 높이이며 이는 보통 평균 핵 직경의 10% 정도이다(Wing과 Christensen, 1982). 단위면적당 각 세포의 총 숫자와 핵의 크기는 조직 표본에서 5부위를 중복되지 않도록 선택하여 영상분석기(image analyzer system, Leica Q500MC, Germany)를 이용하여 측정하였다. 고환 당 간질세포의 총 숫자는 다음과 같은 공식에 의하여 구하였다(Kim 등, 2000; Mendis-Handagama 등, 1987; Mendis-Handagma와 Ewing, 1990).
- 한우에서 출생 후 성장단계별 고환간질세포의 형태학적인 변화를 알아보기 위하여 출생 후 14, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 104 주령(n=7 마리/주령)의 수컷 한우 56두에서 고환을 채취하여 실험에 이용하였다. 소 고환은 2.5% glutaraldehyde를 이용하여 관류고정하고 조직처리 과정을 거쳐서 Epon-araldite에 포매하고 초박절편기를 사용하여 1 μm로 절편한 다음 methylene blue-azure II로 염색하여 일반적인 조직의 변화상과 형태계측을 하였다. 곱슬정세관의 평균직경은 14주령에 75.
대상 데이터
- 농촌진흥청 국립축산과학원에서 한우 고급육 생산 기술을 목적으로 진행된 연구에 공여된 한우를 14, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 104주령으로 군을 나누어, 전북대학교 실험동물센터 윤리규정위원회 관리 규정에 따라서 각 군당 7마리씩 거세 후 고환을 수집하여 실험에 이용하였다.
- 한우에서 출생 후 성장단계별 고환간질세포의 형태학적인 변화를 알아보기 위하여 출생 후 14, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 104 주령(n=7 마리/주령)의 수컷 한우 56두에서 고환을 채취하여 실험에 이용하였다. 소 고환은 2.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 자료는 SAS package의 General Linear Model (GLM) Procedure (SAS Ver. 6.12, SAS Institute, 1998)를 ANOVA로 통계처리 후 Duncan's multiple range test에 의하여 검정하였으며 P＜0.05 이하의 유의성을 통계학적 차이로 인정하였다.
이론/모형
- 고환 간질조직 구성물의 용적 치밀도: Point counting methods (Kim 등, 2002; Mendis-Handagma와 Ewing, 1990)법을 적용, 121 point ocular grid를 장착한 광학현미경 하에서 point와 만나는 각 구조물(간질세포, 혈관, 중간엽세포, 근모양세포, 혈관내피세포, 및 림프주위공간)의 네 모서리와 가운데 즉 5군데 부위를 측정 하였으며, 각 개체 당 최소 50부위에서 최대 100부위를 중복되지 않게 측정 하였다. 이것을 전체 point (121×5)로 나누어 고환 간질세포의 용적 치밀도(v:v %)는 아래와 같은 공식을 이용하여 구하였다.
- 고환 간질세포의 절대용적: 이미 구해진 용적치밀도(volume density, v;v%)와 고환용적(fresh testis volume, g)을 이용하여 절대용적(absolute volume, mm3)을 다음과 같은 공식에 의하여 구하였다(Kim 등, 2002; Mendis-Handagma 등, 1987; Mendis-Handagma와 Ewing, 1990).
- 고환 단위 용적 당 세포 수: Floderus (1944) 방정식 Nv=Na/(T+D-2h)×(1-ST)를 적용하여 단위용적 당 세포 수(numerical density)를 계산 하였다. 이 공식에서 Na는 단위면적당 각 세포핵의 숫자(단위 면적 40006.
- 고환의 용적을 측정하기 위하여 chemical balance로 무게를 측정하고 sucrose를 사용하여 부양법(float method)으로 비중(specific gravity)을 측정한 후 고환의 용적을 산출하였다(고환용적=고환무게/고환비중) (Christensen, 1980; Kim 등, 2002; Mendis-Handagma 등, 1987; Mendis-Handagma와 Ewing, 1990). 0.
성능/효과
- 생후 14주령의 한우에서 채취한 고환에서 곱슬정세관은 고환의 약 54.2%를 차지하였고, 직경이 약 75.56 μm이었고, 기저막 부위에는 원형의 큰 핵을 가진 정조세포(spermatogonia)들이 위치하고 그 사이에서는 부정형의 핵을 가진 소수의 지지세포(Sertoli cell)들이 관찰되었다. 반면 45.
- 78%로 관찰되었다. 간질세포의 용적 치밀도는 생후 14 주령에서 20.7±2.49%로 계측되었는데 30주령부터 유의성 있게 감소하기 시작하여(P＜0.05), 생후 104주령에서는 5.3±0.99%까지 감소하였다.
- 고환을 이루고 있는 곱슬정세관과 간질조직에 관한 형태계측학적인 연구는 흰쥐(Ariyaratne와 Mendis-Handagma, 2000; Kim 등, 2001), 햄스터(Sinha-Hikim, 1989), 기니픽(Mendis-Handagma 등, 1998), 말(Johnson과 Neaves, 1981), 돼지(Allrich와 Christensen, 1983), 토끼(Castro 등, 2002), 낙타(Zayed 등, 1995), 당나귀(Neves 등, 2002) 등 각종 동물에서 폭 넓게 연구 되었으나 중요한 산업동물인 소에 대한 연구는 주로 곱슬정세관내 정자 발생에 대해 이루어져 왔고(Goyal과 Dhingra, 1973; Moura와 Erickson, 2001; Pant 등, 2003; Rana와 Bilaspuri, 2004; Wrobel, 2000), 소 고환 간질조직에 대한 형태계측학적 연구는 Murrah Buffalo에서만 보고 되어(Rana와 Bilaspuri, 2004), 소 고환 간질 조직을 이루고 있는 각종 세포의 형태 및 기능에 관하여 명확하게 밝혀져 있지 않았으며, 특히 수컷 번식계통에서 중요한 역할을 담당하고 있는 간질세포가 매우 중요함에도 불구하고 간질세포에 관한 형태계측학적인 연구결과는 찾아볼 수 없다. 본 연구에서 얻어진 한우 고환간질세포의 용적치밀도, 절대용적, 평균용적 및 총 숫자에 관한 결과는 처음 보고 이며, 이러한 결과는 출생 후 빠른 시기에 정자발생이 이루어지는 흰쥐, 생쥐와는 여러 가지 차이를 나타내었으며, 특히 간질세포의 형태계측학적 결과는 다른 동물과 많은 차이가 있음을 알 수 있었고 이러한 결과는 비교해부학적인 측면에서 매우 가치 있는 결과로 생각된다.
- 고환 내에서 정자 생성을 담당하는 부분인 곱슬정세관과 간질조직의 용적치밀도를 비교해 보면 한우 14 주령에서 곱슬정세관 용적치밀도는 점진적으로 증가하는 양상을 보이는데 14 주령에 54.48%를 보이다가 30 주령부터 급격히 증가하기 시작하여, 정자가 보이는 40주령에 65.85%, 104 주령에는 76.86% 까지 증가 하였고, 곱슬정세관과는 반대로 간질조직 용적치밀도는 45.52%의 비율이 25 주령 까지 유지 되다가 생후 30주령 이후부터 감소하여 40 주령에는 36.81%, 104 주령에는 23.14%로 나타났다. 독일 재래 소 고환에서 간질조직의 용적치밀도는 4 주령에서 51.
- 2% 까지 감소하였다(Wrobel, 2000). 이러한 결과를 비교해 보면, 독일 재래 소는 한우에 비하여 고환에서 간질조직이 차지하고 있는 비율이 훨씬 낮으며, 나이가 들어감에 따라서 간질조직이 차지하고 있는 비율이 한우보다 8∼15% 정도 낮은 수치였고 감소율이 훨씬 높다는 것을 알 수 있었다. 그러나 한우와 독일 재래소를 비교하여 볼 때 이 연구에서는 40주령부터 104주령까지의 중간에 실험군이 없어 정확한 비교를 할 수 없기 때문에 상세한 변화를 비교하기 위해서는 성숙한 실험군을 대상으로 한우 실험군을 좀 더 세분하여 연구를 진행할 필요가 있을 것으로 생각한다.
- 한우 생후 14 주령에서 채취한 고환 간질조직에서 태자간질세포, 미분화된 성숙간질세포와 성숙간질세포를 관찰 할 수 있었다. 태자간질세포와 미분화 간질세포는 적게 관찰되었고, 성숙간질세포가 대부분을 차지하였다.
- 49 cm3으로 나타났다. 고환 조직당 간질세표의 총 숫자는 연령이 증가함에 따라서 거의 연속적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 간질세포 평균용적은 14 주령에 1120 μm3이었고, 17 주령에서 1561 cm3으로 크게 증가하였다가 20 주령에 감소하고, 이후 40 주령부터 점진적으로 증가하여 104 주령에는 2553 cm3로 나타났다.
- 간질세포 평균용적은 14 주령에 1120 μm3이었고, 17 주령에서 1561 cm3으로 크게 증가하였다가 20 주령에 감소하고, 이후 40 주령부터 점진적으로 증가하여 104 주령에는 2553 cm3로 나타났다. 이상의 결과는 한우에서 간질세포의 형태는 태자 및 미성숙 간질세포(14∼35주령)시기와 성숙간질세포(40∼104주령) 시기로 나눌 수 있다.
후속연구
- 이러한 결과를 비교해 보면, 독일 재래 소는 한우에 비하여 고환에서 간질조직이 차지하고 있는 비율이 훨씬 낮으며, 나이가 들어감에 따라서 간질조직이 차지하고 있는 비율이 한우보다 8∼15% 정도 낮은 수치였고 감소율이 훨씬 높다는 것을 알 수 있었다. 그러나 한우와 독일 재래소를 비교하여 볼 때 이 연구에서는 40주령부터 104주령까지의 중간에 실험군이 없어 정확한 비교를 할 수 없기 때문에 상세한 변화를 비교하기 위해서는 성숙한 실험군을 대상으로 한우 실험군을 좀 더 세분하여 연구를 진행할 필요가 있을 것으로 생각한다.
- 출생 후부터 성 성숙 시기까지 사람(Nistal 등, 1986)과 원숭이(Rey 등, 1996)에서 관찰되는 간질세포의 유형은 태자간질세포(fetal-type Leydig cells), 미숙한 간질세포(infantile-type Leydig cells), 부분적으로 분화된 간질세포(partially differentiated Leydig cells) 및 완전히 발달한 성숙간질세포(mature adult Leydig cells)의 4가지 유형이 있다. 그러나 흰쥐(Ariyaratne와 Mendis-Handagama, 2000; Mendis-Handagama 등, 1987), 고양이(Sanchez 등, 1993), 그리고 소(Rana와 Bilaspuri 2000; Wrobel, 2000)에서는 태자간질세포, 미성숙 간질세포 그리고 성숙간질세포로 3 종류의 간질세포만이 관찰되었는데 한우에서도 출생 후 14주령부터 104주령까지 에서는 동일한 결과를 나타내어 영장류와 차이가 있음을 알 수 있었고, 이러한 차이의 원인은 영장류에서는 출생 후부터 성 성숙이 이루어지기까지 오랜 시간이 소요되기 때문에 간질세포의 분화과정 중에 또 다른 유형의 세포가 하나 더 존재하는 것으로 생각되며, 한우 태자 간질세포의 변화를 명확하게 구명하기 위해서는 출생 후 초기 실험군을 좀 더 세분하여 연구를 진행할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 고환 간질조직의 단위부피당 세포의 총 숫자는 감소한다고(Kerr와 Knell, 1988; Mendis-Handagana 등, 1987) 보고되어 있는데 이는 본 실험의 결과와도 일치하고, 본 실험에서 14 주령 이전의 한우 고환을 채취 할 수 없었지만, 완전히 성숙한 간질세포의 출현을 알 수 있다면, 이 간질세포 출현 전에 곱슬정세관내에서 정조세포의 첫 번째 체세포분열(mitosis) 전구세포가 만들어 졌음을 알 수 있고, 새로 분화된 간질세포에서 웅성호르몬을 생산해 내어 정자발생이 이루어지고 있음을 확인 할 수가 있었으며(Gondos와 Renston, 1976; Rana와 Bilaspuri, 2000), 간질조직을 구성하는 대식세포는 Kim과 Yang(1999)이 흰쥐의 고환에서 나타났다고 보고 하였지만, 본 실험에는 간질조직내에서 대식세포를 관찰할 수가 없었는데, 이에 관한 내용은 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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