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문제 정의
- 분리된 화합물들은 spectral data를 바탕으로 각각 2, 3, 6, 8-tetrahydroxy- 1- methylxanthone(1), 2, 3, 4, 6, 8- pentahydroxy- 1- methylxanthone(2), 3, 4, 6, 8-tetrahydroxy- 1- methylxanthone(3), 3, 6, 8-trihydroxy- 1- methylxanthone(4), 2, 4,2′,4′,6′-pentahydroxy- 6- methylbenzophenone(5) 및 7- hydroxy- 5-methoxy- 3- methyl isobenzofuranone(6)로 동정하였다. 내생균 Arthrinium phaeospermum이 생산하는 이차대사산물에 관해서는 본 연구에서 처음으로 이루어졌다. 분리된 화합물들이 알려진 물질들이라 하더라도, 몇 가지는 강한 항균작용이 보고되거나, 암세포 증식억제 작용이 보고된 바 있는 바, 내생균이 생산하는 이차대사산물 역시 잠재력 있는 천연자원이 될 수 있음을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 식물 내생균이 생산하는 생리활성물질 연구의 일환으로, 전남 순천의 늪지 지역에서 생존하는 수생식물의 내생균이 기주식물에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 그 내생균을 분리하고, 이들이 생산하는 이차대사산물을 규명하고자 본 연구를 실시하게 되었다. 본 연구에서는 갈대의 뿌리에서 분리된 내생균 Arthrinium phaeospermum을 배양하여, 그 배양물로부터 6종의 polyketide계 물질을 분리하여 이를 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 식물 내생균이 생산하는 생리활성물질 연구의 일환으로, 전남 순천의 늪지 지역에서 생존하는 수생식물의 내생균이 기주식물에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 그 내생균을 분리하고, 이들이 생산하는 이차대사산물을 규명하고자 본 연구를 실시하게 되었다. 본 연구에서는 갈대의 뿌리에서 분리된 내생균 Arthrinium phaeospermum을 배양하여, 그 배양물로부터 6종의 polyketide계 물질을 분리하여 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- δH 13.42에서 xanthone의 carbonyl group과 수소 결합하는 OH기를 확인할 수 있었고, δH 6.30 및 6.16에서 meta coupling (J=1.8 Hz)하는 두 개의 proton signal을 확인하였다.
- 5에 대하여 Sephadex LH-20을 충진한 칼럼에 CH2Cl2와 MeOH로의 1:1 혼합용매로 용리시켜 20개의 소분획을 얻었고, 이 중 소분획 19에 대하여, Luna 5μ C18(2) 100A column(250×10.00 mm, Phenomenex)을 이용한 HPLC(Agilent 1260)로 정제하여 화합물 3(2.5 mg)과 4(3.5 mg)를 분리하였다.
- Arthrinium phaeospermum의 EtOAc 추출물을 실리카겔칼럼 크로마토그라피로 분획한 후 재결정 및 분취용 HPLC를 실시하여 총 6종의 대사체들을 분리하였다(Fig. 1). 화합물 1의 1H-NMR spectrum에서 δH 13.
- 기기 − TLC(Thin layer chromatography)의 결과 확인은 UV detector(Vilber lourmat, France)을 이용한 254 nm와 365 nm 파장에서 관찰하였고 발색을 병행하여 확인하였다.
- 00 mm, Phenomenex)이다. 단일 화합물의 구조를 규명하기 위해 이용한 NMR(Nuclear magnetic resonance) spectrum은 Varian VNS 600 spectrometer(1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz)와 Varian VNS 300 spectrometer(1H: 300 MHz, 13C: 75 MHz) 그리고 Bruker DPX 300 spectrometer(1H: 300 MHz, 13C: 75 MHz)를 사용하여 측정하였고, NMR chemical shift value는 part per million(ppm)단위로 나타내었다. Mass spectrometer로 Jeol JMS600을 사용하였다.
- 기기 − TLC(Thin layer chromatography)의 결과 확인은 UV detector(Vilber lourmat, France)을 이용한 254 nm와 365 nm 파장에서 관찰하였고 발색을 병행하여 확인하였다. 병원균 배지를 제조하기 위해 고압증기멸균기(JW Medical Corporation. CHS-AC 80)를 사용하여 고온, 고압에서 모든 생균과 포자를 멸균하였고 병원균의 배양을 위해 incubator를 사용하였다. 화합물의 분리, 정제 및 spectrum 양상 비교를 위해 사용한 HPLC(High performance liquid chromatography)는 Perkin Elmer series 200 liquid chromatography와 Agilent series 1200 HPLC system이다.
- 분리 및 정제 − 대량배양으로 얻어진 추출물에 대하여 실리카 겔을 충진한 칼럼에 헥산(n-Hexane) 및 EtOAc 혼합용매로 비극성 용매부터 시작하여 극성을 높여 가며 기울기 용리시켜 열린 칼럼 크로마토그라피를 실시하여 총 6개의 분획을 얻었다(Fr. 1~Fr. 6).
- 분리된 화합물들은 spectral data를 바탕으로 각각 2, 3, 6, 8-tetrahydroxy- 1- methylxanthone(1), 2, 3, 4, 6, 8- pentahydroxy- 1- methylxanthone(2), 3, 4, 6, 8-tetrahydroxy- 1- methylxanthone(3), 3, 6, 8-trihydroxy- 1- methylxanthone(4), 2, 4,2′,4′,6′-pentahydroxy- 6- methylbenzophenone(5) 및 7- hydroxy- 5-methoxy- 3- methyl isobenzofuranone(6)로 동정하였다.
- 이와 같은 data를 바탕으로 문헌과 비교하여 이 화합물을 lichen에서 분리보고된 바 있는 2, 4,2′,4′,6′-pentahydroxy- 6- methylbenzophenone으로 동정하였다.
- 3 software를 사용하였다. 후자는 vacuum degasser, quaternary pump, diode array detector(DAD), manual injector, auto-sampler, thermo-statted column compartment로 갖추고 있으며 Agilent chemstation software를 사용하여 실험을 진행 하였다. 분리, 정제 및 spectrum 양상 비교를 위해 HPLC에 사용된 column은 Luna 5μ C18(2) 100A column(250×10.
대상 데이터
- 5715)을 사용하였고 결과 확인을 위해 발색시약으로 20% aqH2SO4를 사용하였다. Column chromatography용 고정상은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, Merck Art. 7734)와 Sephadex LH-20(GE Healthcare, Sweden)를 사용하였다. Column chromatography용 유기용매는 시약용 1(OCI company Ltd.
- 7734)와 Sephadex LH-20(GE Healthcare, Sweden)를 사용하였다. Column chromatography용 유기용매는 시약용 1(OCI company Ltd., DC chemical CO. Ltd.)을 사용하였고, HPLC의 이동상으로는 HPLC grade의 water, methanol(Fisher Scientific Korea Ltd.)을 사용하였다. NMR 측정을 위하여 acetone-d6, DMSO-d6 및 CD3OD(Cambridge Isotope Laboratories, Inc.
- 단일 화합물의 구조를 규명하기 위해 이용한 NMR(Nuclear magnetic resonance) spectrum은 Varian VNS 600 spectrometer(1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz)와 Varian VNS 300 spectrometer(1H: 300 MHz, 13C: 75 MHz) 그리고 Bruker DPX 300 spectrometer(1H: 300 MHz, 13C: 75 MHz)를 사용하여 측정하였고, NMR chemical shift value는 part per million(ppm)단위로 나타내었다. Mass spectrometer로 Jeol JMS600을 사용하였다.
- )을 사용하였다. NMR 측정을 위하여 acetone-d6, DMSO-d6 및 CD3OD(Cambridge Isotope Laboratories, Inc.)를 사용하였다.
- 순천만 늪지 지역에서 자생하는 갈대의 뿌리에서 내생균 A. phaeospermum를 분리하여 쌀배지에 대량으로 배양한 후, 배양물을 EtOAc로 추출, 그 추출물에서 6종의 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물들은 spectral data를 바탕으로 각각 2, 3, 6, 8-tetrahydroxy- 1- methylxanthone(1), 2, 3, 4, 6, 8- pentahydroxy- 1- methylxanthone(2), 3, 4, 6, 8-tetrahydroxy- 1- methylxanthone(3), 3, 6, 8-trihydroxy- 1- methylxanthone(4), 2, 4,2′,4′,6′-pentahydroxy- 6- methylbenzophenone(5) 및 7- hydroxy- 5-methoxy- 3- methyl isobenzofuranone(6)로 동정하였다.
- 시약 − TLC plate는 Kiesel gel 60 F254(precoated, Merck Art. 5715)을 사용하였고 결과 확인을 위해 발색시약으로 20% aqH2SO4를 사용하였다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용된 균주 Arthrinium phaeospermum은 국립생물자원관에서 분양받아(부여번호 JS0567) 사용하였으며, 표본은 덕성여자대학교 약학대학 생약학 실험실에 보관 중이다.
- 이 화합물의 13C-NMR spectrum에서 δC 183.2의 ketone기를 포함하여 총 14개의 탄소를 확인할 수 있었다.
성능/효과
- δH 5.91에서 broad하게 나타나는 두 개의 aromatic proton signal을, δH 6.28에서 역시 두 개의 aromatic proton signal을 확인하여, 이 화합물이 화합물 1-4와 같이 xanthone골격이 되기에는 sp2 carbon에 결합한 치환기가 xanthone에 비해 두 개가 더 존재함을 확인할 수 있었다.
- δH 6.25 및 6.14에서 각각 doublet(J=2.2 Hz)으로 나타나는 signal을 확인하여 benzene ring에 meta coupling하고 있는 두 개의 proton을 확인하였고, δH 2.75에서 singlet으로 나타나는 하나의 sp2 carbon에 결합한 methyl기의 존재를 확인할 수 있었다.
- p>내생균(endophyte)이란 식물의 조직내에 살고 있으면서, 기주 식물(host plant)에 위해를 가하지 않는 미생물이라고 정의된다.1) 내생균 (endophyte)이 식물 내에서 하는 역할 등 식물-내생균 상호관계(plant-endophyte interaction)에 관해서는 연구된 바가 많지 않고 현재도 연구 중이지만, 지금까지의 보고에 의하면, 내생균이 기 기주식물의 성장을 도와주고, 어떤 경우에는 기주 식물을 외부의 병충해로부터 보호해 준다는 연구 결과가 있다.2) 실제로 내생균 또는 내생균이 생성하는 이 이차대사산물들이 강한 항균 작용을 나타내는 경우가 많이 보고되었다.
- 6) 한편 호주에서 오랜시간 동안 상처치유의 목적으로 사용되어 온 “snakevine”이라 불리는 약용식물 “Kennedia nigricans”에서 분리된 내생균 Streptomyces NRRL30562 이 강한 항균물질 munumbicin을 생산함이 밝혀졌다.
- 7) 무엇보다도 생리활성 물질의 보고로써 내생균이 천연물 및 생물학자들의 큰 관심을 큰 획기적인 연구결과는, 1995년 Strobel group에서는 주목나무 수피에서 분리된 내생균 Taxomyces andreanae이 기주식물인 주목나무가 생산하는 항암물질 Taxol®을 생산함을 발견한 것이다.
- 8) 주목나무 내생균이 Taxol®을 생산하는 것은 관련 유전자가 식물에서 미생물로 이동했거나, 내생균의 유전자가 기주식물로 이동해서 두 생물종 모두 이 화합물을 생산한다고 추정하고 있다.
- 균주의 분리 및 배양 − 내생균주 JS0567은 전남 순천만 지역의 갈대의 뿌리에서 분리되었으며, ITS sequencing을 통하여 Arthrinium phaeospermum로 규명되었다.
- 주목나무 내생균의 Taxol® 생산 이후, 다른 약용 식물들의 내생균이 생산하는 대사체에 대한 연구가 진행되어 왔다. 그 결과, 항암제 etoposide, teniposide 등의 lead compound인 podophyllotoxin이 분리된 식물 Podophyllum peptatum의 내생균 Phialocephala fortinii이 그 기주식물과 똑같이 podophyllotoxin을 생산함이 규명되었다.9) 또한 항암제 campthothecin을 생산하는 중국 식물 희수 Campthotheca acuminata의 내생균 Fusarium solani가 그 기주식물과 똑같이 campthothecin을 생산함이,10) 항우울제 hypericin이 분리된 식물 Hypericum perforatum의 내생균 Thielavia subthermophila 역시 hypericin을 생산함이,11) 그리고 간장약 silymarin이 분리된 마리아엉겅퀴 Sylibum marianum의 내생균 Aspergillus iizukae 역시 silymarin을 생산함이 보고되었다.
- 63에서 singlet으로 나타나는 aromatic methine proton 의 존재를 확인하여 이 화합물은 화합물 1과 같이 xanthone 골격에 4개의 hydroxyl기가 치환된 xanthone 계열 화합물임을 확인할 수 있었다. 그러나, proton 및 carbon signal의 chemical shift가 1의 그것들과는 차이가 있었기에 치환된 hydroxyl 기의 위치가 다른 화합물임을 예상할 수 있었다. 이상의 data를 문헌과 비교하여 이 화합물을 진균류 Penicillium raistrickii 및 Wardomyces anomalus에서 분리 보고된 바 있는 3, 4, 6, 8-tetrahydroxy- 1- methylxanthone임을 확인할 수 있었다.
- 이는 ESIMS spectrum으로 확인할 수 있었다. 이 화합물의 (+)ESI-MS spectrum에서 m/z 277에서 [M+H]+에 해당하는 pseudomolecular ion peak을 확인하여, 같은 치환기의 xanthone 골격인 화합물 4에 비하여 분자량 18이 더 크게 나타나, 이 화합물이 benzophenone 골격을 지님을 확인할 수 있었다. 이와 같은 data를 바탕으로 문헌과 비교하여 이 화합물을 lichen에서 분리보고된 바 있는 2, 4,2′,4′,6′-pentahydroxy- 6- methylbenzophenone으로 동정하였다.
- 이 화합물의 13C-NMR spectrum에서 δC 183.0에서 xanthone의 ketone 기를 확인하였고, δC 98.5 및 93.5에서 meta coupling하고 있는 두 개의 aromatic methine carbon을 확인할 수 있었다.
- 이 화합물의 1H-NMR spectrum에서 δH 6.32 및 6.13에서 meta coupling하는 aromatic proton signal 두 개 이외에 δH 6.63에서 singlet으로 나타나는 aromatic methine proton 의 존재를 확인하여 이 화합물은 화합물 1과 같이 xanthone 골격에 4개의 hydroxyl기가 치환된 xanthone 계열 화합물임을 확인할 수 있었다.
- 2의 ketone기를 포함하여 총 14개의 탄소를 확인할 수 있었다. 이로써 이 화합물이 진균류에서 많이 분리, 보고되는 xanthone 골격을 지니고 있음을 추정할 수 있었다. 특히 δC 165.
- 그러나, proton 및 carbon signal의 chemical shift가 1의 그것들과는 차이가 있었기에 치환된 hydroxyl 기의 위치가 다른 화합물임을 예상할 수 있었다. 이상의 data를 문헌과 비교하여 이 화합물을 진균류 Penicillium raistrickii 및 Wardomyces anomalus에서 분리 보고된 바 있는 3, 4, 6, 8-tetrahydroxy- 1- methylxanthone임을 확인할 수 있었다.13,16)
- 32에서 quartet으로 나타나는 methine proton을 확인할 수 있었다. 이상의 data를 문헌과 비교하여 이 화합물이 mycophenolic acid의 생합성 중간체로 보고된 바 있는 5,7-dihydroxy-3-methylphthalide임을 확인할 수 있었다.21)
- 5에서 meta coupling하고 있는 두 개의 aromatic methine carbon을 확인할 수 있었다. 이상의 data를 종합하고, 문헌과 비교하여 이 화합물을 해양 곰팡이 Wardomyces anomalus에서 분리 보고된 바 있는 2, 3, 4, 6, 8-pentahydroxy- 1- methylxanthone(=anomalin B)으로 동정하였다.13,14)
- 3에서 oxygenated된 sp2 탄소가 나타나, 이 화합물이 xanthone 골격에 hydroxyl 기가 4개 치환되어 있음을 추정할 수 있었고, 이는 1H-NMR spectrum에 나타난 exchangeable proton의 개수와 잘 일치하였다. 이상의 data를 종합하고, 문헌과 비교하여 이 화합물을 해양곰팡이 Wardomyces anomalus에서 분리 보고된 바 있는 2, 3, 6, 8-tetrahydroxy- 1- methylxanthone(=anomalin A)로 동정하였다.13-15)
- 66에서 broad한 singlet으로 나타나는 두 개의 aromatic proton signal을 확인하여 methyl 기가 결합한 ring에는, methyl 기 이외에 하나의 OH만 존재하며, 두 개의 proton은 서로 거의 coupling 하지 않았으므로, 서로 meta 위치에 존재함을 추정할 수 있었다. 이상의 데이터를 문헌과 비교하여 화합물 4를 진균류 Lecanora reuteri 및 Penicillium patulum에서 분리보고 된 바 있는 3, 6, 8-trihydroxy- 1- methylxanthone(=norlichexanthone)으로 동정하였다.17-18)
- 특히 δC 165.1, 164.6, 158.0, 153.2, 152.7 및 141.3에서 oxygenated된 sp2 탄소가 나타나, 이 화합물이 xanthone 골격에 hydroxyl 기가 4개 치환되어 있음을 추정할 수 있었고, 이는 1H-NMR spectrum에 나타난 exchangeable proton의 개수와 잘 일치하였다.
- 화합물 1-3에서와는 달리 δH 6.67 및 6.66에서 broad한 singlet으로 나타나는 두 개의 aromatic proton signal을 확인하여 methyl 기가 결합한 ring에는, methyl 기 이외에 하나의 OH만 존재하며, 두 개의 proton은 서로 거의 coupling 하지 않았으므로, 서로 meta 위치에 존재함을 추정할 수 있었다.
- 화합물 1의 1H-NMR spectrum에서 δH 13.32 및 8.97에서 broad singlet으로 나타나는 4개의 exchangeable proton의 존재를 확인할 수 있었다.
- 화합물 3의 1H 및 13C NMR spectra역시 화합물 1과 2의 그것들과 유사하여, xanthone계열의 물질임을 추정할 수 있었다. 이 화합물의 1H-NMR spectrum에서 δH 6.
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