[논문]고비로부터 Cinnamtannin B-1의 분리 및 함량 분석

김민석; 우경완; 이기호; 이현주; 이선유; 강병만; 전병훈; 조정희; 조현우

고비로부터 Cinnamtannin B-1의 분리 및 함량 분석
Isolation and Quantitative Analysis of Cinnamtannin B-1 from Osmunda japonica Thunb 원문보기

생약학회지, v.47 no.3, 2016년, pp.232 - 236

김민석 (한약진흥재단 한약자원본부) , 우경완 (한약진흥재단 한약자원본부) , 이기호 (한약진흥재단 한약자원본부) , 이현주 (한약진흥재단 한약자원본부) , 이선유 (한약진흥재단 한약자원본부) , 강병만 (한약진흥재단 한약자원본부) , 전병훈 (원광대학교 한의학과 병리학교실) , 조정희 (한약진흥재단 한약자원본부) , 조현우 (한약진흥재단 한약자원본부)

Abstract ▼ AI-Helper

In traditional Korean medicine, Osmunda japonica Thunb has been used as hemostasis and antipyretic treatment. The main compound "cinnamtannin B-1" was obtained by column chromatographic separation, and its structure was determined by spectroscopic methods, including $^1H$, $^{13}C$ NMR, and IT-TOF-ESI MS. Ash, moisture and extract content and acidinsoluble ash were monitored as identification test to establish the analytical methods. The optimum reflux extraction condition was 100% methanol extracted 30 min for 2 times. A quantitative analysis using HPLC method exhibited that the main compound at 24.7 min and its content was 0.96% in methanol extraction.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

Ethyl acetate · Acetic acid · Formic acid · Water(100:11:11:27)을 전개용매로 하여 약 10 cm 전개한 후 분무용 황산시액을 고르게 뿌리고 105oC에서 10분간 가열한 뒤 백색광에서 관찰하였다.
HPLC 분석 조건− Cinnamtannin B-1의 분석 조건을 Table I과 같이 설정한 다음, 이 조건에 따라 함량분석을 실시하였다.
검량선 및 직선성(Linearity)− 고비로부터 순수 분리된 cinnamtannin B-1의 표준용액을 MeOH로 희석하여 230,115, 57.5, 28.75, 14.38 μg/mL의 농도가 되도록 만들어 실험하였다.
검액 및 표준용액 5 μL를 박층크로마토그래프용실리카겔(형광제 첨가)을 써서 만든 박층판에 점적하였다.
검액 조제− 시료를 가루로 하여 약 1.0 g을 칭량하여 용매에 따른 추출효율 분석과 추출조건에 따른 함량 분석을 실시하였다.
그리고 이 중 GBW 2(13 g)를 ODS gel(20 μm, 0.4 kg, YMC, Japan)을 사용하여 H2O-ACN의 혼합용매(9:1, 8:2)를 사용해 column chromatography 진행하여 15개의 소분획물(GBW 2-1~15)을 얻었다.
Column chromatography의 충진제는 YMC gel ODS-A(50 μm)를 사용하였다. 단일 화합물의 구조를 규명하기 위해 이용한 NMR(Nuclear magnetic resonance) spectrum은 Varian 600 spectrometer(¹H: 600 MHz, ¹³C:150 MHz)를 사용하여 측정하였고, NMR 용매는 Sigma. Inc(USA)의 CD₃OD를 사용하였다.
본 연구는 고비의 지표성분 분석법이 제대로 되어 있지 않는 실정으로 품질관리 기준을 설정하기 위해 고비로부터 각종 column chromatography법을 이용하여 대량 분리된 지표성분을 spectroscopic data를 통해 cinnamtannin B-1으로 구조 동정하였다. 또한 고비의 확인시험 뿐만 아니라 지표 성분 cinnamtannin B-1의 함량 방법을 HPLC 방법으로 확립하였다.
분석법 확립을 위해 고비를 100% MeOH로 추출하여 얻은 추출물로부터 각종 column chromatography법을 이용하여 지표성분을 분리, 분광학적 방법을 통해 cinnamtannin B1으로 구조 동정하였다. 고비의 함량분석을 위해 HPLC 조건을 확립하였고, 메탄올 용매에 환류 추출 30분 2회 반복에서 가장 높은 효율을 나타냈으며, 지표성분 함량은 0.
30 mg를 MeOH 10 mL에 용해하여 stock solution으로 하였다. 이 stock solution을 희석하여 230, 115, 57.5, 28.75, 14.38 ppm 농도의 표준용액을 조제하였다.
5(C-2)을 확인하였다. 이를 기존 문헌과 비교하여 cinnamtannin B-1으로 구조 동정하였다.¹³⁾
지표물질 분리 − H2O 분획물(80 g)을 glass column(16 cm×60 cm)에 ODS gel(50 μm, 0.8 kg, YMC, Japan)을 충진하여 H2O-MeOH 혼합용매(100:1, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 0:100)를 사용하여 open column chromatography를 실시하여, LC-MS 및 TLC를 이용해 스크리닝 후 6개의 소분획물을 얻었다(GBW 1-6).
추출 및 분획 − 고비 뿌리줄기(2 kg)를 환류냉각장치를 이용하여 1 kg 씩 MeOH 20 L에 담가 3시간, 총 3회 온침 추출을 진행 후 감압 농축하여 메탄올 추출물(137 g)을 얻었다.
용매별(MeOH, 50% MeOH, EtOH)로 각각 10 mL씩 첨가하여 30 분간 초음파 추출 후 검액으로 사용하였다. 추출효율이 가장 좋았던 MeOH을 첨가하여 조건(초음파 30분, 30분 2회, 60분과 환류 30분, 30분 2회, 60분 추출)에 따라 추출, 여과 후 정확하게 50 mL가 되게 하여검액으로 사용하였다.
함량 분석은 X-bridge C18 column(5 μm, 250 mm×4.6 mm, Waters, USA)을 사용하여 Shimadzu HPLC system(20-AD, Shimadzu, Japan)으로 측정하였다.
함량분석(Content) − 고비의 지표성분cinnamtannin B-1의 분석법 확립을 위해 Table I의 HPLC 조건으로 진행하여 peak의 retention time은 24.7 min에 관찰하였다(Fig. 3).
확인시험 − 분리한 cinnamtannin B-1을 이용하여 박층크로마토그래프법을 설정하였으며 시료를 가루로 하여 약 1.0 g을 취하여 메탄올, 에탄올, 물 10 mL를 각각 첨가하여 30분 초음파 추출한 다음 여과한 여액을 검액으로 사용하였다.

대상 데이터

Column chromatography의 충진제는 YMC gel ODS-A(50 μm)를 사용하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용된 고비는 2015년 6월 24일 전남 완도 에서 채취하였으며, 목포대학교 한약자원학과 김휘 교수에게 의뢰하여 동정하여 사용하였다.
0 g을 칭량하여 용매에 따른 추출효율 분석과 추출조건에 따른 함량 분석을 실시하였다. 용매별(MeOH, 50% MeOH, EtOH)로 각각 10 mL씩 첨가하여 30 분간 초음파 추출 후 검액으로 사용하였다. 추출효율이 가장 좋았던 MeOH을 첨가하여 조건(초음파 30분, 30분 2회, 60분과 환류 30분, 30분 2회, 60분 추출)에 따라 추출, 여과 후 정확하게 50 mL가 되게 하여검액으로 사용하였다.
일반성분 분석을 위한 건조기(VS-1202D3, Jeiotech, Korea), 회화로(MF-21G, Daehan, Korea), 초음파추출기(UC-20, Branson, USA)이며, 확인시험에는 반자동박층크로마토그래프(ATS4&ADC2, Camag, Swiss)를 사용하였다.

이론/모형

본 연구는 고비의 지표성분 분석법이 제대로 되어 있지 않는 실정으로 품질관리 기준을 설정하기 위해 고비로부터 각종 column chromatography법을 이용하여 대량 분리된 지표성분을 spectroscopic data를 통해 cinnamtannin B-1으로 구조 동정하였다. 또한 고비의 확인시험 뿐만 아니라 지표 성분 cinnamtannin B-1의 함량 방법을 HPLC 방법으로 확립하였다.
일반성분 − 대한민국약전(참고문헌처리, 제2014-194호) 일반시험법 중 생약시험법에 준하여 각각의 건조감량, 엑스함량(묽은에탄올엑스), 회분, 산불용성회분 시험법에 따라 실시하였다.

성능/효과

1) 주로 숲속이나 물가의 습하고 그늘진 곳에 자라고, 뿌리에서 여러 대가 올라와 높이는 60~100 cm 정도이며, 잎은 2회 우상복엽이고 어린 잎은 얇고 흰털로 덮여있으나, 성숙하면 털이 없고 주맥과 측맥이 50°각도로 교차한다.
3). 50% MeOH, 100% MeOH, EtOH의 추출용매에 따른 지표 성분 함량 비교는 Table II와 같이 100% MeOH 추출에서 가장 높은 효율을 확인하였고, MeOH을 추출용매로 하여 추출조건별 실험 결과 Table III과 같이 환류 추출 30분 2반복에서 가장 높은 효율을 확인하였다. 지표물질의 검량선 결과 Fig.
분석법 확립을 위해 고비를 100% MeOH로 추출하여 얻은 추출물로부터 각종 column chromatography법을 이용하여 지표성분을 분리, 분광학적 방법을 통해 cinnamtannin B1으로 구조 동정하였다. 고비의 함량분석을 위해 HPLC 조건을 확립하였고, 메탄올 용매에 환류 추출 30분 2회 반복에서 가장 높은 효율을 나타냈으며, 지표성분 함량은 0.96%로 확인하였다. 또한 고비의 품질규격은 설정되어 있지 않아 우리의 실험 결과로 볼 때 건조감량은 11.
일반성분 − 고비는 대한약전에 수재되어 있지 않는 민간생약으로 설정된 기준규격이 없으며, 실험결과 건조감량은 11.3%, 회분은 4.1%, 산불용성회분은 1.0%, 묽은에탄올엑스함량은 14.7%의 결과로 나타났다.
50% MeOH, 100% MeOH, EtOH의 추출용매에 따른 지표 성분 함량 비교는 Table II와 같이 100% MeOH 추출에서 가장 높은 효율을 확인하였고, MeOH을 추출용매로 하여 추출조건별 실험 결과 Table III과 같이 환류 추출 30분 2반복에서 가장 높은 효율을 확인하였다. 지표물질의 검량선 결과 Fig. 4과 같고, 상관계수(R²)은 0.9998로 높은 직선성을 보였으며, 고비의 지표성분 cinnamtannin B-1의 MeOH추출물에서의 함량은 0.96%으로 확인되었다(Table IV).¹⁵⁾
화합물의 구조 − 갈색 가루로 분리되었으며, LC ESI-ITTOF MS 분석에서 m/z 863.1305 [M-H]−으로 확인하였고, formular predictor(Shimadzu, Japan)를 이용한 결과 C45H36O18의 분자식을 얻었다.

후속연구

96%로 확인하였다. 또한 고비의 품질규격은 설정되어 있지 않아 우리의 실험 결과로 볼 때 건조감량은 11.3%, 회분은 4.1%, 산불용성회분은 1.0%, 묽은에탄올엑스함량은 14.7%으로 설정하였으며, 향후 고비의 식물화학적 성분 및 생리활성 실험을 진행할 예정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	고비란 무엇인가?	고비(Osmunda japonica)는 고비과(Osmundaceae)의 속하는 여러해살이풀로 우리나라에는 고비, 꿩고비(Osmunda cinnamomea), 가는고비(Osmunda japonica var. sublancea), 음양고비(Osmunda claytoniana) 4종이 자생한다.
	고비의 생육특성은 무엇인가?	sublancea), 음양고비(Osmunda claytoniana) 4종이 자생한다.1) 주로 숲속이나 물가의 습하고 그늘진 곳에 자라고, 뿌리에서 여러 대가 올라와 높이는 60~100 cm 정도이며, 잎은 2회 우상복엽이고 어린 잎은 얇고 흰털로 덮여있으나, 성숙하면 털이 없고 주맥과 측맥이 50°각도로 교차한다.2,3) 어린잎은 나물로 식용하며, 한방에서는 고비의 뿌리줄기를 자기(紫箕)라 하여 해열(解熱), 지혈(止血), 구충(驅蟲)작용으로 사용하였다.
	고비를 전통적으로 사용하는 방법은 무엇이 있는가?	1) 주로 숲속이나 물가의 습하고 그늘진 곳에 자라고, 뿌리에서 여러 대가 올라와 높이는 60~100 cm 정도이며, 잎은 2회 우상복엽이고 어린 잎은 얇고 흰털로 덮여있으나, 성숙하면 털이 없고 주맥과 측맥이 50°각도로 교차한다.2,3) 어린잎은 나물로 식용하며, 한방에서는 고비의 뿌리줄기를 자기(紫箕)라 하여 해열(解熱), 지혈(止血), 구충(驅蟲)작용으로 사용하였다.4) 고비의 약리작용 연구로 지상부는 tyrosinase inhibitory 활성이,5) 뿌리는 anti-oxidant,6) anti-bacterial 및 antifungal 활성이 보고되었다.

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용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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