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문제 정의
- 7세포에서 항산화 및 항염증 효능을 가진다고 보고하였다. 따라서, 본 연구에서는 자란초(Ajuga spectabilis)에서 분리된 지표성분 luteolin 5-glucoside의 신경세포의 산화적 손상에 대한 보호능을 평가하기 위하여 H2O2에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포의 사멸에 대한 보호 효과를 측정하였다.
- 함량분석 − 자란초에서 분리한 luteolin 5-glucoside을 지표성분으로 하여 HPLC 분석법을 확립하고자 하였다.
제안 방법
- 7(C-8)의 데이터를 비교하여 5번 위치에 결합된 것을 확인하였다.9) 이상의 결과를 바탕으로 기존의 문헌과 비교하여 luteolin 5-glucoside로 구조 결정하였다.6)
- HPLC 분석 조건 − 지표성분으로 분리된 luteolin 5-glucoside을 Table II와 같이 조건 설정 후 함량분석을 실시하였다.
- 검량선 및 직선성(Linearity) − 지표물질 luteolin 5-glucoside의 농도에 따른 직선적인 측정값을 확인하기 위해 직선성을 검토하였다.
- 그 중 main compound가 함유된 ASW4-9(5 g)을 메탄올에 녹인 다음 Sephadex LH-20(Sigma, Sweden) 200 g이 충진된 glass column(2.5 cm×70 cm)에 로딩시키고 MeOH로 전개하여 50 ml씩 20개를 받은 후 TLC data를 바탕으로 3개의 소분획으로 나누었다(ASW4-9-3).
- Column chromatography의 충진제는 YMC gel ODS-A(50 μm)를 사용하였다. 단일 화합물의 구조를 규명하기 위해 이용한 NMR(Nuclear magnetic resonance)spectrum은 Varian 600 spectrometer(1H: 600 MHz, 13C:150 MHz)를 사용하여 측정하였고, NMR 용매는 Sigma. Inc(USA)의 DMSO-d6를 사용하였다.
- 세포 내 ROS 측정 − 세포 내 ROS 측정은 2',7'-dichlorofluoroescein diacetate(DCFH-DA)가 세포 내로 투과된 후 아세틸기가 유리된 2',7'-dichlorofluoroescin(DCFH)의 형태에서 ROS와 반응하여 형광물질을 생성하는 성질을 이용하였다.
- 세포 독성 − 96 well plate에 5×104 cells/well의 SH-SY5Y 세포를 분주하고 3시간 동안 배양한 후 시료를 첨가하고 24시간 동안 배양한 다음 10 μL의 MTT solution을 첨가한 후 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 3시간 더 배양시킨 후, 즉시 490 nm서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
- 신경세포보호효과 − 세포를 96-well plates에 5×104 cells/well 농도로 100 μL 씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 다음 시료를 처리하고 24시간 후 H2O2(최종농도 100 μM)를 첨가하고 30분간 더 배양한 후 MTT assay로 세포의 생존율을 측정하였다.
- 이 중 ASW4(15 g)을 소량의 증류수를 넣어 현탁시키고 ODS gel(20 μm, YMC, Japan) 250 g을 glass column(5 cm×70 cm)에 충진시키고 water(in 0.02% formic acid)-ACN의 혼합용매(90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 0:100)로 15 mL/min의 속도로 서서히 유출시켜 500 ml씩 받아 TLC 패턴을 확인하여 9개의 소분획으로 나누었다(ASW4-1-9).
- 이를 걷어낸 후 10 μM DCFH-DA로 다시 40분간 처리한 후 flow cytometer(Beckman Coulter, Inc., Brea,CA, USA)로 측정하였다.
- 자란초의 전초로부터 지표성분인 luteolin 5-glucoside (1) 를 컬럼크로마토그래피법을 이용하여 분리하였고, 1H, 13CNMR과 TOF-ESI MS를 이용하여 구조동정 하였다. 분리된 지표성분을 이용하여 자란초의 분석법을 확립하여 MeOH환류 30분 2회 반복 추출 시 0.
- 지표물질 분리 − H2O 분획물을 ODS gel(50 μm, YMC, Japan) 500 g이 충진된 glass column(16 cm×80 cm)에 충진시킨 후 water(in 0.02% formic acid)-ACN 혼합용매(90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 0:100)를 전개용매로 하여 open column chromatography를 진행하였으며, 1 L씩 받아 TLC로 스크리닝하여 5개의 소분획물을 얻었다(ASW1-5).
- 지표성분 구조 분석 − 지표물질은 노란색 가루로 재결정되었으며, TLC분석에서 Aninalehyde 발색 시약 분무 후 가열시 노란반점을 나타내어 flavonoid로 추정하였다.
- 추가적으로 당의 anomeric protonδH 4.70(1H, d, J=7.0 Hz, H-1'')을 관찰하였다.
- 0 g을 정확히 칭량하고, 용매별(MeOH, 50% MeOH, EtOH)로 각각 10 mL씩 첨가하여 30 분간 초음파 추출, 여과 후 사용하였다. 추출조건(초음파 30분, 30분 2회, 60분과 환류 30분, 30분 2회, 60분 추출)에 따른 함량 분석은 동일한 방법으로 칭량 후 MeOH 10 mL를 첨가, 여과 후 검액으로 사용하였다.
- 표준용액 조제 − 자란초로부터 정제한 지표물질 luteolin 5-glucoside를 2.07 mg를 정확히 취해 MeOH를 10 mL가하여 stock solution을 조제하였고, 단계별(207, 103.5, 51.75,25.88, 12.94 ppm)로 희석하여 사용하였다.
- 표준용액을 MeOH로 단계적(207,103.5, 51.75, 25.88, 12.94 μg/mL)으로 희석하여 HPLC로 실험하였다.
대상 데이터
- Column chromatography의 충진제는 YMC gel ODS-A(50 μm)를 사용하였다.
- 세포 배양 − Human Neuroblastoma cell line인 SH-SY5Y는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였으며, Minimum Essential medium(EMEM, ATCC, USA)에 10% Fetal bovine serum(FBS), 100 U/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 Incubator에 배양하였다.
- 세포 배양액인 Minimum Essential medium(MEM)과 FBS, Streptomycin의 세포 배양 시약들은 Gibco(USA)에서 구입하여 사용하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS, CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)는 promega(USA)에서,H2O2, 2'7'-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)는 Sigma(USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용한 자란초는 2013년 11월에 충북 충주에서 채취하였으며, 목포대학교 한약자원학과 김휘 교수에게 의뢰하여 동정하여 사용하였다.
이론/모형
- 세포생존률 − Luteolin 5-glucoside의 세포독성을 나타내는농도를 알아보기 위해 MTS 분석법을 이용하여 세포생존율을 측정하였다.
성능/효과
- 2) 산화적 손상이 지속적으로 진행되며 퇴행성 뇌 질환을 일으키는 주요한 원인으로 밝혀짐에 따라 폴리페놀, 플라보노이드와 같이 항산화력이 강한 천연물질을 이용한 알츠하이머병과 같은 질병을 예방하기 위한 연구가 진행되고 있다.3) 최근 연구에서 quercetin이 알츠하이머 동물모델에서 GSH를 증가시키고 염증인자들은 감소시킴에 따라 알츠하이머의 치료제로서 가능성을 나타냈으며,4) 고들빼기에서 분리된 flavonoid 유도체인 apigenin, luteolin, luteolin 7-glucoside,luteolin 7-glucuronide의 신경보호 효과를 규명하였다. 그 중 luteolin은 H2O2에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포에서의 생존률을 높이고 ROS 생성을 낮춤으로써 분리된 물질 중 가장 높은 신경세포보호 효과를 나타내었다.
- 6) 1H-NMR spectrum에서 δH 7.38(1H, dd,J=8.5, 2.0 Hz, H-6'), 7.36(1H, brs, H-2'), 6.88(1H, d,J=8.0 Hz, H-5')에서 flavonoid B-ring의 1,3,4-치환된 3개의 proton peak을 확인하였고, δH 6.79(1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.69(1H, d, J=2.0 Hz, H-6)에서 A-ring의 meta coupling하는 2개의 doublet peak, δH 6.55(1H, s, H-3)에서 C-ring의 single peak을 확인하였다.
- 8) Luteolin 7번 위치에 glucose가 결합되었을 때 1H-NMRspectrum에서 δH 6.88(1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 6.77(1H, d,J=1.8 Hz, H-6) 그리고 13C-NMR spectrum에서 δC 99.5(C6), 94.7(C-8)의 데이터를 비교하여 5번 위치에 결합된 것을 확인하였다.
- 6은 luteolin 5-glucoside를 먼저 처리한 후 유세포 분석을 통하여 세포내 ROS 함량을 측정한 결과를 나타내었다. luteolin 5-glucoside를 처리한 모든 군에서 H2O2만 처리한 군에 비해 농도의존적으로 ROS함량이 유의적으로 감소하였다. 정6) 등은 Raw 264.
- CNMR과 TOF-ESI MS를 이용하여 구조동정 하였다. 분리된 지표성분을 이용하여 자란초의 분석법을 확립하여 MeOH환류 30분 2회 반복 추출 시 0.048%으로 가장 많은 양을 함유하는 것으로 검출되었다. 지표성분의 luteolin 5-glucoside가 H2O2에 의해 유도되는 산화적 스트레스 상태에서 ROS 생성을 억제시키고, 세포생존률을 증가시킴에 따라 신경세포 손상을 억제하거나 보호효과가 있는 것으로 사료된다.
- 5에 나타내었다. 아무것도 처리하지 않은 control군에 비해 H2O2만을 처리한 군에서는 72%의 생존율을 나타내었고, luteolin 5-glucoside 처리시 농도의존적으로 세포 생존율이 증가하는 것으로 나타났다. 이들 결과로부터 luteolin 5-glucoside 신경모세포종의 산화적 손상에 대한 세포 보호 효과를 갖고 있는 것으로 확인되었다.
- 2). 위의 분석법을 바탕으로 추출용매에 따른 지표성분 함량 비교 시 MeOH 추출에서 가장 높은 효율을 보였고(Table III), MeOH을 이용한 추출조건별 결과 환류 추출 30분 2회 반복에서 가장 높은 효율을 확인하였다(Table IV). 지표물질의 표준용액을 1~200 μg/mL의 범위에서 검량선 상관계수(R2)은 1.
- 아무것도 처리하지 않은 control군에 비해 H2O2만을 처리한 군에서는 72%의 생존율을 나타내었고, luteolin 5-glucoside 처리시 농도의존적으로 세포 생존율이 증가하는 것으로 나타났다. 이들 결과로부터 luteolin 5-glucoside 신경모세포종의 산화적 손상에 대한 세포 보호 효과를 갖고 있는 것으로 확인되었다.
- 3). 이와 같은 방법으로 지표성분의 함량을 구하였고, 그 결과 자란초 MeOH 추출물에 0.048%의 luteolin 5-glucoside을 함유하였다(Table I).
- 048%으로 가장 많은 양을 함유하는 것으로 검출되었다. 지표성분의 luteolin 5-glucoside가 H2O2에 의해 유도되는 산화적 스트레스 상태에서 ROS 생성을 억제시키고, 세포생존률을 증가시킴에 따라 신경세포 손상을 억제하거나 보호효과가 있는 것으로 사료된다.
후속연구
- 또한, luteolin은 Nrf2의 활성을 조절하여 ROS 생성을 억제하여 항산화활성을 증가시켜 세포보호 효과가 있다고 보고 된 바 있다.12) 본 연구에서도 luteolin의 배당체인 luteolin 5-glucoside가 세포사멸을 억제하고 세포 내 ROS 생성을 감소시킴에 따라 ROS에 의해 발생하는 뇌세포 사멸에 대해 보호작용의 역할을 할 것으로 사료되며, 향후 luteolin 5-glucoside의 구체적인 기전연구가 진행되어야 할 것이다.
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