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문제 정의
- 본 연구에서는 다빈도 한약 처방 50종의 아세틸콜린 분해 효소 활성 및 아밀로이드 베타 단백질 응집 억제 효능에 관하여 평가하였다. 50종의 한약 처방 중에서 황련해독탕, 천왕보심단, 맥문동탕, 가미소요산은 아세틸콜린분해 효소 활성 저해 효능을 보였고, 소시호탕, 삼소음, 청심연자음, 분심기음은 아밀로이드 베타 단백질 응집 억제 효능을 나타내었다.
- 본 연구에서는 우리나라에서 사용빈도가 높은 다빈도 한약 처방 중 우선 순위 50종의 치매 효능을 탐색하였다. 다빈도 한약처방의 선정은 보험급여대상 복합제제화 권장 처방연구,13) 한약처방의 종류 및 조제 방법에 관한 규정에 의한 처방 100종,14) 한방 의료기관 다빈도 처방자료15)를 종합하여 선정하였다.
제안 방법
- 36) 따라서 본 연구에 사용된 한약 처방들의 ABTS 라디칼 소거능을 측정하여 항산화 효능을 평가하였다. 표 1에서와 같이 생맥산(KE-40)을 제외한 모든 한약 처방은 ABTS 라디칼 소거 활성이 20% 이상인 것으로 확인되었다.
- Aβ1-42 응집억제 정도를 측정하기 위하여 96 well plate(blackmicroplate)에 thioflavin T 10 μL와 Aβ1-42 85 μL를 넣은 후 일정 농도로 만든 시료 5 μL와 혼합하여 형광 분광 분석기로 측정하였다.
- ABTS 자유 라디칼 소거능 측정 − 3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) 라디칼을 이용한 항산화능 측정은 ABTS+· cation decol orization assay 방법을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다.
- 96 well plate에 ABTS+· 용액과 시료를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, Epoch Microplate Spectophotometer를 사용하여 743 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 라디칼 소거활성은 용매인 PBS를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타냈다. 활성 비교를 위하여 양성대조군으로 vitamin C를 사용하였다.
- 본 연구에서는 한의계에서 가장 많이 사용되는 다빈도 한약처방 50종을 대상으로, 치매 병리기전 중 주요 생리지표인 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase) 활성 및 아밀로이드 베타(amyloid-β) 단백질 응집에 대한 효능과 자유 라디칼 소거능 측정을 통한 항산화 효능을 in vitro에서 검색하였다.
- 아세틸콜린 분해효소 활성 저해 효능 탐색 −아세틸콜린 분해효소 저해 활성은 Ellman법7)을 변형하여 분광 광도법으로 측정하였다.
- 5%의 억제 효능을 확인하였다. 이들 처방 또한 다양한 농도에서 아밀로이드 베타 응집에 대한 효능을 측정한 다음 억제율에 대한 IC50 값을 계산하였다. 그 결과 소시호탕, 삼소음, 청심연자음, 분심기음은 각각 84.
- 이때 사용한 형광 분광 분석기의 파장값은 440 nm/484 nm(excitation/emission)이며, 37°C에서 20분 간격으로 총 2시간 측정하였다.
- 각각의 처방에 따라 약재를 배합한 후 이의 10배에 해당하는 양의 증류수와 함께 100℃에서 2시간 동안 무압 환류 추출법(추출기: 경서메디텍 COSMOS-660)을 이용하여 추출하였다. 추출액은 sieve를 사용하여 거른 후 동결건조기(일신 동결건조기 PVTFD100R)를 사용하여 처방 추출물 분말을 얻었다.
- 다빈도 한약처방의 선정은 보험급여대상 복합제제화 권장 처방연구,13) 한약처방의 종류 및 조제 방법에 관한 규정에 의한 처방 100종,14) 한방 의료기관 다빈도 처방자료15)를 종합하여 선정하였다. 치매 효능 평가를 위해서는 치매 병리 기전에서 중요한 생리지표인 아세틸콜린 분해 효소 활성 및 아밀로이드 베타 응집에 대한 억제 효능을 측정하였다. 각각 양성 대조 약물인 berberine과 morin의 억제율을 근거로 하여, 한약 처방 추출물의 저해 효능이 50% 이상인 것을 효능이 있다고 판단하였다.
- 이때 사용한 형광 분광 분석기의 파장값은 440 nm/484 nm(excitation/emission)이며, 37°C에서 20분 간격으로 총 2시간 측정하였다. 활성 비교를 위하여 양성대조군으로 morin 을 사용하였고, 응집 저해능 50%에 해당하는 시료농도(IC50)를 계산하였다.
- 각 시료의 라디칼 소거활성은 용매인 PBS를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타냈다. 활성 비교를 위하여 양성대조군으로 vitamin C를 사용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 우리나라에서 사용빈도가 높은 다빈도 한약 처방 중 우선 순위 50종의 치매 효능을 탐색하였다. 다빈도 한약처방의 선정은 보험급여대상 복합제제화 권장 처방연구,13) 한약처방의 종류 및 조제 방법에 관한 규정에 의한 처방 100종,14) 한방 의료기관 다빈도 처방자료15)를 종합하여 선정하였다. 치매 효능 평가를 위해서는 치매 병리 기전에서 중요한 생리지표인 아세틸콜린 분해 효소 활성 및 아밀로이드 베타 응집에 대한 억제 효능을 측정하였다.
- , Winooski, VT)를 이용하여 412 nm에서 측정하였다. 대조약물로는 아세틸콜린 분해효소 저해 약물로 잘 알려진 berberine8)을 사용하였고, 결과는 control군에 대한 %로 표시하였으며, 계산식은 아래와 같다.
- 실험재료 −본 연구의 한약 처방은 한국한의학연구원 Kherb 연구단으로부터 추출물을 제공받아 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과에 대한 통계학적 유의성 검정은 ANOVA검정을 적용하였으며, Dunnet’s multiple comparison test를 이용하여 pvalue가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 한약 처방 추출 방법은 다음과 같다. 각각의 처방에 따라 약재를 배합한 후 이의 10배에 해당하는 양의 증류수와 함께 100℃에서 2시간 동안 무압 환류 추출법(추출기: 경서메디텍 COSMOS-660)을 이용하여 추출하였다. 추출액은 sieve를 사용하여 거른 후 동결건조기(일신 동결건조기 PVTFD100R)를 사용하여 처방 추출물 분말을 얻었다.
- 아밀로이드 베타(Aβ1-42) 응집 저해 효능 탐색 −아밀로이드 베타의 응집 저해 측정은 형광 분석법9)을 이용한 SensoLyte® Thioflavin T β-Amyloid(1-42) Aggregation Kit(AnaSpec, Inc., Fremont, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- p>우리나라를 포함한 전 세계 대부분의 국가들은 초 고령화 사회로의 진입이 빨라지면서 노인성 질환에 대응하는 기술개발이 요구되고 있다.1) 여러 가지 노인성 질환 중 치매 환자의 수의 증가 폭이 가장 높으며, 이와 함께 치매로 인한 의료비 지출 규모도 점차 증가되고 있는 추세이다.2,3) 국내 치매 환자 중 알츠하이머성 치매의 비중이 가장 높으며, 이는 알츠하이머성 치매는 신경세포 손상 및 senile plaque와 neurofibrillary tangle(NFT) 농축으로 인한 인지기능 장애로 정의된다.
- 1) 여러 가지 노인성 질환 중 치매 환자의 수의 증가 폭이 가장 높으며, 이와 함께 치매로 인한 의료비 지출 규모도 점차 증가되고 있는 추세이다.2,3) 국내 치매 환자 중 알츠하이머성 치매의 비중이 가장 높으며, 이는 알츠하이머성 치매는 신경세포 손상 및 senile plaque와 neurofibrillary tangle(NFT) 농축으로 인한 인지기능 장애로 정의된다. 알츠하이머성 치매의 발병 기전에 대하여 정확히 알려진 바는 없으나, 현재까지는 신경전달물질인 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase) 활성화와 아밀로이드 베타(amyloid-β) 응집이 주요 원인으로 알려져 있으며, Tau 과산화, 산화적 스트레스 등도 관여하는 것으로 보고되었다.
- 50종 처방 농도 100 μg/mL에서 효소 활성 억제 효능은 황련해독탕, 천왕보심단, 맥문동탕, 가미소요산이 각각 90.14±0.40%, 94.43±0.11%, 76.73±0.44%, 63.51±2.00% 저해하여 다른 처방에 비하여 높은 효능을 나타내었다.
- 본 연구에서는 다빈도 한약 처방 50종의 아세틸콜린 분해 효소 활성 및 아밀로이드 베타 단백질 응집 억제 효능에 관하여 평가하였다. 50종의 한약 처방 중에서 황련해독탕, 천왕보심단, 맥문동탕, 가미소요산은 아세틸콜린분해 효소 활성 저해 효능을 보였고, 소시호탕, 삼소음, 청심연자음, 분심기음은 아밀로이드 베타 단백질 응집 억제 효능을 나타내었다. 또한, 이 8종의 한약 처방은 높은 항산화 효능이 있음을 확인하였다.
- 치매 효능 평가를 위해서는 치매 병리 기전에서 중요한 생리지표인 아세틸콜린 분해 효소 활성 및 아밀로이드 베타 응집에 대한 억제 효능을 측정하였다. 각각 양성 대조 약물인 berberine과 morin의 억제율을 근거로 하여, 한약 처방 추출물의 저해 효능이 50% 이상인 것을 효능이 있다고 판단하였다.
- 그 결과 소시호탕, 삼소음, 청심연자음, 분심기음은 각각 84.2 μg/mL, 97.7 μg/mL, 84.8 μg/mL, 96.2 μg/mL의 농도임이 확인되었다.
- 50종의 한약 처방 중에서 황련해독탕, 천왕보심단, 맥문동탕, 가미소요산은 아세틸콜린분해 효소 활성 저해 효능을 보였고, 소시호탕, 삼소음, 청심연자음, 분심기음은 아밀로이드 베타 단백질 응집 억제 효능을 나타내었다. 또한, 이 8종의 한약 처방은 높은 항산화 효능이 있음을 확인하였다. 본 연구의 결과는 주요 지표 자체에 대한영향을 평가한 연구이며, 향후 신경세포 및 치매 동물 모델을 활용한 추가 실험을 통하여 한약 처방의 치매에 대한 예방 또는 치료제로서의 효능에 대한 과학적 근거의 확보가 요구된다.
- 사용한 50개 처방 중 아밀로이드 베타 응집 억제 효능이 높은 것들은 소시호탕, 삼소음, 청심연자음, 분심기음이 각각 57.9±3.5%, 55.5±4.2%, 56.3±23.9%, 57.6±5.5%의 억제 효능을 확인하였다.
- 표 1에서와 같이 생맥산(KE-40)을 제외한 모든 한약 처방은 ABTS 라디칼 소거 활성이 20% 이상인 것으로 확인되었다. 아세틸콜린 분해 효소 활성과 아밀로이드 베타 응집에 대한 억제 효능이 높은 처방들(황련해독탕, 천왕보심단, 맥문동탕, 가미소요산, 소시호탕, 삼소음, 청심연자음, 분심기음) 모두 ABTS 라디컬 소거 활성이 높았다. 이들 처방은 높은 항산화 효능과 함께 치매의 주요 생리지표 조절을 통한 항치매 효능의 잠재성이 있을 것으로 사료된다.
- 아세틸콜린 분해 효소 활성은 대조 약물 berberine(500 nM)의 경우 60.63±0.56% 저해 효능을 보였다.
- 36) 따라서 본 연구에 사용된 한약 처방들의 ABTS 라디칼 소거능을 측정하여 항산화 효능을 평가하였다. 표 1에서와 같이 생맥산(KE-40)을 제외한 모든 한약 처방은 ABTS 라디칼 소거 활성이 20% 이상인 것으로 확인되었다. 아세틸콜린 분해 효소 활성과 아밀로이드 베타 응집에 대한 억제 효능이 높은 처방들(황련해독탕, 천왕보심단, 맥문동탕, 가미소요산, 소시호탕, 삼소음, 청심연자음, 분심기음) 모두 ABTS 라디컬 소거 활성이 높았다.
후속연구
- 본 연구의 결과는 주요 지표 자체에 대한영향을 평가한 연구이며, 향후 신경세포 및 치매 동물 모델을 활용한 추가 실험을 통하여 한약 처방의 치매에 대한 예방 또는 치료제로서의 효능에 대한 과학적 근거의 확보가 요구된다. 또한 맥문동탕, 가미소요산, 삼소음과 같은 처방들은 치매 또는 신경세포 보호와 관련된 보고가 없어 이에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요할 것이다.
- 또한, 이 8종의 한약 처방은 높은 항산화 효능이 있음을 확인하였다. 본 연구의 결과는 주요 지표 자체에 대한영향을 평가한 연구이며, 향후 신경세포 및 치매 동물 모델을 활용한 추가 실험을 통하여 한약 처방의 치매에 대한 예방 또는 치료제로서의 효능에 대한 과학적 근거의 확보가 요구된다. 또한 맥문동탕, 가미소요산, 삼소음과 같은 처방들은 치매 또는 신경세포 보호와 관련된 보고가 없어 이에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요할 것이다.
- 아밀로이드 베타 응집 억제 효능 한약처방의 경우는 아밀로이드 베타의 강한 신경독성 완화를 통한 치료의 가능성이 있을 것으로 사료된다. 향후, 각각 단계에 대한 유효 한약 처방 및 처방의 구성 약재들의 특성에 대한 분석이 필요할 것이다.
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