문제 정의

• 브라시노스테로이드는 식물의 생장과 발육 과정에 있어서 중요한 역할을 담당 할 뿐 아니라 생물학적/ 비 생물학적 스트레스에 대한 복합 저항성을 보인다고 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 브라시노스테로이드와 광범위스트레스 내성을 연결하는 중요한 생물학적 네트워크를 이해하기 위해, Agilent Arabidopsis 4 x 44K oligo chip을 이용하여 브라시 노스테로이드 신호가 강화된 bes1-D 계통의 전 전사체 비교분석을 수행하였다. 그 결과 bes1-D 계통에서 DEGs (Differentially Expressed Genes)를 1,091 (562 up-regulated, 529 down-regulated)개 선발하였다.
• 2015a). 따라서 본 연구에서는 애기장대에서 브라시노스테로이드 신호전달이 활성화 되어 있는 bes1-D 돌연변이체의 microarray 분석을 수행하여 전사체 레벨에서 유전자 발현 양상을 분석하였다. 발현 차이를 보인 1,091개 유전자들은 Gene Ontology와 단백질 네트워크 분석 등을 통해 브라시노스테로이드 신호전달에 의해 조절되는 네트워크 유전자들 및 광범위 스트레스 내성에 관여하는 주요 유전자들을 동정하여 고찰하였다.
• 또한 ADH2, AtHSC70, AtPPa6로 합쳐지는 주요 비생물학적 스트레스 저항성 네트워크가 존재함을 확인하였다. 이러한 네트워크 분석을 통해 브라시노스테로이드 신호전달에 의한 광범위 스트레스가 어떠한 경로를 통해 형성되는지를 예측할 수 있었다. Microarray 분석과 시스템 생물학적 접근을 통해 브라시노스테로이드 신호전달에 의해 형성되는 광범위 스트레스 내성에 대한 네트워크 분석하여 얻어진 허브유전자의 발현 조사하였다.

제안 방법

• 식물의 drought 내성 및 병 저항성 검증을 위해 브라시노스 테로이드 전사인자의 기능 획득 돌연변이 bzr1-1D, bes1-D 식물체를 이용하였다. Drought 내성에 대한 실험을 하기 위해 3주간 생장시킨 야생형과 bzr1-1D 돌연변이계통에 급수를 중단하고 12일 후 다시 급수하여 식물이 회복되는 정도를 확인하였다. 병 저항성을 실험하기 위해 4주간 온실에서 생장 시킨 식물체에 Psudomonas syringae pv.
• org) 에서 제공되는 데이터를 이용하였다. GO enrichment analysis 분석을 통해 분리된 스트레스 관련 유전자들로부터 주요역할을 수행하는 유전자를 추출하기 위해 단백질 상호작용 네트워크 분석을 수행하였다(Shannon et al. 2003). 단백질 네트워크의 기본 데이터는 AraNet v2 (Lee et al.
• 2000). Gene Ontology Consortium website (http://geneontology.org/ page/go-enrichment-analysis)에서 제공하는 프로그램을 이용 하여 biological process, molecular function 및 cellular component 에 해당하는 카테고리를 분리하였다(Supek et al. 2011). GO-Slim 카테고리는 TAIR database ( 이러한 네트워크 분석을 통해 브라시노스테로이드 신호전달에 의한 광범위 스트레스가 어떠한 경로를 통해 형성되는지를 예측할 수 있었다. Microarray 분석과 시스템 생물학적 접근을 통해 브라시노스테로이드 신호전달에 의해 형성되는 광범위 스트레스 내성에 대한 네트워크 분석하여 얻어진 허브유전자의 발현 조사하였다. 병원균 저항성 주요 네트워크 분석에서 NB-ARC와 FLS2의 경우 bes1-D 계통이 야생형 En-2 계통에 비해 약 6배 정도의 발현량이 증가되었다(Fig.
• Microarray 분석을 통해 얻어진 1,091개의 DEGs으로부터 주요 생물학적 기능을 분석하기 위해 GO enrichment analysis 분석과 단백질 간 상호작용 네트워크 분석을 수행하였다(Ashburner et al. 2000). Gene Ontology Consortium website ( Total RNA는 Microarray 분석에 이용하였다. Real-time quantitative PCR을 수행하기 위해 Oligo (dT) primer 를 사용한 cDNA를 합성하였다. cDNA 는 1st strand synthesis KIT (Enzynomics, Korea)를 이용하여 합성하였다.
• Threshold cycle (Ct) 값에 의한 발현량 분석은 2−ΔΔCt으로 계산하였으며, ΔΔCt은 처리식물체의(Ct target gene −Ct actin gene) − 대조식물체의(Cttarget gene − Ct actin gene)에 의해 계산하여 수치화 하였다(Livak and Schmittgen 2001).
• 또한 브라시노스테로이드 활성형 계통이 야생형 식물체 계통에 비해 가뭄 스트레스 및 병원균에 대해 저항력이 향상되었다. 따라서 microarray 분석을 통한 유전자 간 발현 네트워크와 유전체 정보를 결합하여 대단위 주요 기능 유전자들을 동정할 수 있는 방법을 고안하여 실험에 사용하였다. 이를 통해 기능 획득 돌연변이 bes1-D가 식물들이 다양한 스트레스 환경에 적응할 수 있는 반응을 조절한다는 사실을 보여주고 있다.
• 그 결과 bes1-D 계통에서 DEGs (Differentially Expressed Genes)를 1,091 (562 up-regulated, 529 down-regulated)개 선발하였다. 또한 선발된 유전자들의 GO 와 단백질 상호 작용 네트워크 분석을 통해 대사, 발달, 스트레스, 면역, 방어 반응에 관련된 주요 브라시노스테로이드 신호전달과 연결된 스트레스 관련 유전자군을 분리하였다. 선발된 유전 자중 NB-ARC와 FLS2는 bes1-D 계통이 야생형 En-2 계통에 비해 약 6배 정도의 발현량이 증가되었으며, TIR1, TSA1, OCP3 유전자등은 bes1-D 계통이 야생형 En-2 계통에 비해 발현이 감소되었다.
• 따라서 본 연구에서는 애기장대에서 브라시노스테로이드 신호전달이 활성화 되어 있는 bes1-D 돌연변이체의 microarray 분석을 수행하여 전사체 레벨에서 유전자 발현 양상을 분석하였다. 발현 차이를 보인 1,091개 유전자들은 Gene Ontology와 단백질 네트워크 분석 등을 통해 브라시노스테로이드 신호전달에 의해 조절되는 네트워크 유전자들 및 광범위 스트레스 내성에 관여하는 주요 유전자들을 동정하여 고찰하였다.
• Tomato strain DC3000 (Pst DC3000)을 5 X 10⁷/ml 농도로 침지 처리하였다. 병원균 접종 후 7일 후 잎의 발생단계별로 진열하여 병의 진행 유무를 확인하였다.
• 애기장대(Arabidopsis thaliana) 야생형 En-2, 브라시노스테로이드 활성 돌연변이 bes1-D에 대한 transcript의 발현 양상을 규명하기 위해 대조구인 야생형과 bes1-D 유식물에서 RNA 를 추출한 후, microarray 분석을 3반복으로 수행하여 발현 차이를 분석하였다. 타겟 probes와 hybridization은 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification kit (Agilent Technology, USA)을 사용하였으며, Microarray 분석을 위한 chip은 상용화 되고 있는 Agilent Arabidopsis 4 x 44K Oligo microarray을사용하여 hybridization 후, image quantification은 GenePix Pro 4.
• 2003)을 이용 하였다. 유전자의 이름은 TAIR database를 이용하여 결정하였다.

• 또한 현재까지 알려진 브라시노스테로이드에 의해 조절되는 것으로 알려진 대사와 발달 그리고 호르몬 신호전달과의 상호작용 이외에 생리학 적인 표현형 특징으로만 보고된 스트레스 저항성에 관련된 유전자들의 발현 양상도 발견할 수 있었다. GO enrichment 분석 및 상호작용 네트워크 분석을 통해 새롭게 동정된 스트레스 반응에 관련 유전자들은 발현 양상을 조사한 결과 up-regulation 98개 유전자(Table 3)와 down-regulation 105개 유전자(Table 4)를 선발하였다. 유전자의 발현이 높게 나타나는 유전자들은 AtTN10 (AT1G72930), C2 calcium/lipid-binding endonuclease (AT3G60950), PDF1.
• 2011). GO-Slim 카테고리는 TAIR database (https://www.arabidopsis.org) 에서 제공되는 데이터를 이용하였다. GO enrichment analysis 분석을 통해 분리된 스트레스 관련 유전자들로부터 주요역할을 수행하는 유전자를 추출하기 위해 단백질 상호작용 네트워크 분석을 수행하였다(Shannon et al.
• 2003). 단백질 네트워크의 기본 데이터는 AraNet v2 (Lee et al. 2015b) 에서 제공받아 사용하였고, 네트워크 작성은 Cytoscape network visualization tool (Shannon et al. 2003)을 이용 하였다. 유전자의 이름은 TAIR database를 이용하여 결정하였다.
• 본 실험에 사용한 애기장대(Arabidopsis thaliana)는 야생형 En-2 및 브라시노스테로이드 활성 돌연변이 bes1-D 계통을 포트에 파종하여 22°C, 16hr 명조건/ 8hr 암조건의 온실에서 생장시켰다.
• Korea)를 이용하여 제공된 실험 방법에 따라 분리하였다. 분리된 total RNA 는 MS 3000 Nano-drop (Bio-red, USA)으로 농도 및 QC를 진행하여 실험에 공시하였다. Total RNA는 Microarray 분석에 이용하였다.
• 브라시노스테로이드 신호전달 과정에 관여하는 유전자를 동정하기 위해 En-2 계통과 bes1-D 계통을 이용하여 microarray 분석한 결과 통계적으로 유의성이 나타나는 p-value가 0.01이하와 2배이상의 발현량 차이를 보이는 유전자(DEGs) 총 1,091개를 추출하였다(Fig. 1). 그 중 En-2 계통에 비해 bes1-D 계통에서 발현량이 증가를 보인 유전자는 총 562개 이었고, 발현량이 감소를 보인 유전자는 총 529개 이었다(Fig.
• 식물의 drought 내성 및 병 저항성 검증을 위해 브라시노스 테로이드 전사인자의 기능 획득 돌연변이 bzr1-1D, bes1-D 식물체를 이용하였다. Drought 내성에 대한 실험을 하기 위해 3주간 생장시킨 야생형과 bzr1-1D 돌연변이계통에 급수를 중단하고 12일 후 다시 급수하여 식물이 회복되는 정도를 확인하였다.

데이터처리

• 0을 사용하였고, LOWESS 프로그램을 이용하여 각 spot의 nomalization을 수행하였다. 분석 프로그램은 Agilent GeneSpringGX 7.3을 사용하였으며, Hybridization은 각각 3 반복으로 수행되었다.
• 타겟 probes와 hybridization은 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification kit (Agilent Technology, USA)을 사용하였으며, Microarray 분석을 위한 chip은 상용화 되고 있는 Agilent Arabidopsis 4 x 44K Oligo microarray을사용하여 hybridization 후, image quantification은 GenePix Pro 4.0을 사용하였고, LOWESS 프로그램을 이용하여 각 spot의 nomalization을 수행하였다.

이론/모형

• 본 실험에 사용한 애기장대(Arabidopsis thaliana)는 야생형 En-2 및 브라시노스테로이드 활성 돌연변이 bes1-D 계통을 포트에 파종하여 22°C, 16hr 명조건/ 8hr 암조건의 온실에서 생장시켰다. Total RNA 분리는 어린 잎으로부터 Total RNA extraction kit (Intron Biotech. Korea)를 이용하여 제공된 실험 방법에 따라 분리하였다. 분리된 total RNA 는 MS 3000 Nano-drop (Bio-red, USA)으로 농도 및 QC를 진행하여 실험에 공시하였다.
• Total RNA의 2 ㎍을 이용하였으며 합성 조건은 50°C에서 60분 동안 반응시킨 후 1분간 얼음에 냉각시켜 first strand cDNA 합성을 완성하였다. qRT-PCR 분석은 cDNA를 사용하여 SYBR Green Real-time PCR Master Mix (Applied Biosystem, USA)를 사용하여 Quant Studio 3 (Applied Biosystem, USA) 장비를 사용하여 권장하는 방법에 의해 수행하였다. 본 연구에 사용된 primer sequence 정보는 Table 5에 나열하였다.

성능/효과

• 2 (AT5G44430) 등과 같은 비생물학적 스트레스에 관련된 유전자들과 R gene으로 알려진 TIR-NBS-LRR class family 유전자들 (AT5G41740, AT5G18360, AT5G45000 등)과 CRK21과 같은 RECEPTOR-like protein kinase 유전자 (AT4G23290, AT2G05117 등) 등 이었다. Down-regulation 되는 유전자들의 발현 양상도 비슷한 패턴을 보였는데, 이들 유전자들의 단백질-단백질 간의 상호 작용을 확인할 수 있는 네트워크 분석을 수행한 결과 TIR-NBS-LRR들을 중심으로 만들어지는 중요한 병원균에 대한 방어 네트워크가 만들어 지는 것을 확인하였다(Fig. 4). 흥미롭게도 이들 TIR-NBS-LRR들은 유전자의 발현 양상이 up-regulation과 down-regulation 모두 발견되었다(Fig.
• 따라서 본 연구에서는 브라시노스테로이드와 광범위스트레스 내성을 연결하는 중요한 생물학적 네트워크를 이해하기 위해, Agilent Arabidopsis 4 x 44K oligo chip을 이용하여 브라시 노스테로이드 신호가 강화된 bes1-D 계통의 전 전사체 비교분석을 수행하였다. 그 결과 bes1-D 계통에서 DEGs (Differentially Expressed Genes)를 1,091 (562 up-regulated, 529 down-regulated)개 선발하였다. 또한 선발된 유전자들의 GO 와 단백질 상호 작용 네트워크 분석을 통해 대사, 발달, 스트레스, 면역, 방어 반응에 관련된 주요 브라시노스테로이드 신호전달과 연결된 스트레스 관련 유전자군을 분리하였다.
• 1). 그 중 En-2 계통에 비해 bes1-D 계통에서 발현량이 증가를 보인 유전자는 총 562개 이었고, 발현량이 감소를 보인 유전자는 총 529개 이었다(Fig. 1, Table 1, Table 2). 총 1,091개의 DEGs으로부터 주요 생물학적 기능을 분석하기 위해 GO enrichment analysis 분석을 수행한 결과 GO 분석을 통해 브라시노스테로이드 전사인자의 활성화는 3,185개의 cellular component, 2,217개의 molecular function 그리고 3,082개의 biological process로 구분되었다 (Fig.
• 이외에도 AtMES를 중심으로 이뤄지는 방어 호르몬 SA 합성에 주요한 네트워크가 발견이 되었다. 또한 ADH2, AtHSC70, AtPPa6로 합쳐지는 주요 비생물학적 스트레스 저항성 네트워크가 존재함을 확인하였다. 이러한 네트워크 분석을 통해 브라시노스테로이드 신호전달에 의한 광범위 스트레스가 어떠한 경로를 통해 형성되는지를 예측할 수 있었다.
• 3). 또한 cellular biosynthesis, 아미노산 대사, 핵산 대사, 2차 대사산물 합성 경로 등과 같은 대사에 관련된 유전자들의 그룹이 연관성을 보이는 것으로 나타났다(Fig. 3). 이전의 브라시노스테로이드의 연구에 있어서 외부로부터 자극원으로 처리가 되면, 식물의 생장과 발육과정상에 다양한 신호전달 및 호르몬과의 상호작용을 하여 스트레스 내성 및 표현형의 변화를 보인다고 하였다 (Choudhary et al.
• 몇몇 보고에서도 식물의 생장과 정상에서 브라시노스테로이드 처리가 광범위 스트레스 내성 증대에 밀접한 관계가 있다고 하였다(Divi and Krishna 2009; Gendron and Wang 2007). 또한 분리된 GO term을 좀 더 생물학적 기능과 연관시켜 GO 상호작용 네트워크를 분석한 결과 브라시노스테로이드 신호전달에 의해 활성화 될 때 알려진 embryo development, seed development, cell differentiation, reproductive, fruit development, gametophyte development 등 식물 발육 과정상에서 밀접하게 관련되는 것들이 분리 되었다(Fig. 3). 또한 cellular biosynthesis, 아미노산 대사, 핵산 대사, 2차 대사산물 합성 경로 등과 같은 대사에 관련된 유전자들의 그룹이 연관성을 보이는 것으로 나타났다(Fig.
• 선발된 유전 자중 NB-ARC와 FLS2는 bes1-D 계통이 야생형 En-2 계통에 비해 약 6배 정도의 발현량이 증가되었으며, TIR1, TSA1, OCP3 유전자등은 bes1-D 계통이 야생형 En-2 계통에 비해 발현이 감소되었다. 또한 브라시노스테로이드 활성형 계통이 야생형 식물체 계통에 비해 가뭄 스트레스 및 병원균에 대해 저항력이 향상되었다. 따라서 microarray 분석을 통한 유전자 간 발현 네트워크와 유전체 정보를 결합하여 대단위 주요 기능 유전자들을 동정할 수 있는 방법을 고안하여 실험에 사용하였다.
• 이러한 결과는 브라시노스테로이드 신호전달에 중요한 전사인자의 기능이 증대됨으로써, 발현에 변화가 일어나는 전사체 정보를 분석함으로써 더욱 세분화 되고 복잡한 생명현상을 설명할 수 있다. 또한 현재까지 알려진 브라시노스테로이드에 의해 조절되는 것으로 알려진 대사와 발달 그리고 호르몬 신호전달과의 상호작용 이외에 생리학 적인 표현형 특징으로만 보고된 스트레스 저항성에 관련된 유전자들의 발현 양상도 발견할 수 있었다. GO enrichment 분석 및 상호작용 네트워크 분석을 통해 새롭게 동정된 스트레스 반응에 관련 유전자들은 발현 양상을 조사한 결과 up-regulation 98개 유전자(Table 3)와 down-regulation 105개 유전자(Table 4)를 선발하였다.
• 그러나 야생형 En-2 식물체는 drought stress에 감수성을 보였다(16개체 샘플 중 0개체 생존). 또한병원균 저항성을 검정하기 위해 Pst DC3000을 접종한 결과 best1-D 계통이 En-2 계통에 비해 저항성을 보였다(Fig. 5C). 최근 들어 시스템 생물학을 이용한 빅데이터 처리를 통해 생명현상을 이해하려는 노력이 최근 다양한 방면에서 사용되고 있으며, Serin 등 (2016)은 전 전사체 분석을 통해 얻어진 많은 양의 데이터를 효율적으로 처리하고, 이를 통해 새로운 생명현상의 모듈을 발견할 수 있는 생명공학적 기법을 보고하였다.
• 본 연구는 비록  microarray분석, 시스템생물학 및 유전자의 발현양상 등의 국한적인 기법을 이용하여 브라시노스테로이드 신호전달에 의해 형성되는 다양한 스트레스 저항성 현상을 이해하는데 큰 일조를 하였다고 판단된다.
• 또한 선발된 유전자들의 GO 와 단백질 상호 작용 네트워크 분석을 통해 대사, 발달, 스트레스, 면역, 방어 반응에 관련된 주요 브라시노스테로이드 신호전달과 연결된 스트레스 관련 유전자군을 분리하였다. 선발된 유전 자중 NB-ARC와 FLS2는 bes1-D 계통이 야생형 En-2 계통에 비해 약 6배 정도의 발현량이 증가되었으며, TIR1, TSA1, OCP3 유전자등은 bes1-D 계통이 야생형 En-2 계통에 비해 발현이 감소되었다. 또한 브라시노스테로이드 활성형 계통이 야생형 식물체 계통에 비해 가뭄 스트레스 및 병원균에 대해 저항력이 향상되었다.
• 2012). 아울러 이와 비슷한 결과로서 브라시 노스테로이드의 처리에 따른 auxin, SA, JA, 스테로이드 신호전달과의 상호작용을 확인 할 수 있었다(Fig. 3). 특히 식물의 외부 병원균 및 곤충들에 대한 방어 신호에 매우 중요 하게 작용하는 SA와 JA 신호전달 및 대사의 네트워크가 존재함을 알 수 있었다.
• 5A). 이러한 결과를 바탕으로 브라시노스테로이드 신호 강도가 증가된 bzr1-1D 돌연변이를 이용하여 drought 스트레스 내성을 검정한 결과 브라시노스테로이드 증대 식물체에서 약 40%(16개체 샘플 중 6개체 생존)는 drought stress에 대한 저항성을 보였다(Fig. 5B). 그러나 야생형 En-2 식물체는 drought stress에 감수성을 보였다(16개체 샘플 중 0개체 생존).
• 따라서 microarray 분석을 통한 유전자 간 발현 네트워크와 유전체 정보를 결합하여 대단위 주요 기능 유전자들을 동정할 수 있는 방법을 고안하여 실험에 사용하였다. 이를 통해 기능 획득 돌연변이 bes1-D가 식물들이 다양한 스트레스 환경에 적응할 수 있는 반응을 조절한다는 사실을 보여주고 있다.
• 1, Table 1, Table 2). 총 1,091개의 DEGs으로부터 주요 생물학적 기능을 분석하기 위해 GO enrichment analysis 분석을 수행한 결과 GO 분석을 통해 브라시노스테로이드 전사인자의 활성화는 3,185개의 cellular component, 2,217개의 molecular function 그리고 3,082개의 biological process로 구분되었다 (Fig. 2). Biological process에 포함되는 유전자들은 다시 11개의 기능별로 구분이 되었으며, 현재까지 그 기능이 정확하게 구분되지 않는 term이 약 50% 정도를 차지하고 있었다.
• 3). 특히 식물의 외부 병원균 및 곤충들에 대한 방어 신호에 매우 중요 하게 작용하는 SA와 JA 신호전달 및 대사의 네트워크가 존재함을 알 수 있었다. 이외에 개별적인 네트워크로써 스트레스 반응성과 면역, 병원균에 대한 방어 등에 관련된 유전 자들의 그룹이 다수 존재하고 있음을 확인 할 수 있었다 (Fig.

후속연구

• 본 연구는 비록  microarray분석, 시스템생물학 및 유전자의 발현양상 등의 국한적인 기법을 이용하여 브라시노스테로이드 신호전달에 의해 형성되는 다양한 스트레스 저항성 현상을 이해하는데 큰 일조를 하였다고 판단된다. 향후 이러한 연구 기법을 통해 NGS를 통해 얻어지는 빅데이터를 분석하고 이를 통해 식물이 지니고 있는 복잡한 생명현상을 이해할 수 있으리라 사료된다.