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문제 정의
- 또한 최근 연구에 따르면 OPU유래 난자의 배반포 생산의 효율 도 증진 시키는 것으로 보고되었으며 내동성과 임신율에 영향 을 주지 않는 것으로 알려졌다(Merton 등, 2013). 그러므로 본 연구에서는 희소한우의 수정란을 대량생산함과 동시에 생축 가축유전자원을 확보하고 동결유전자원으로 활용하기 위하여 cysteamine이 희소한우(흑우, 칡소)의 OPU유래 수정란 생산에 미치는 영향을 조사하였다.
- 본 연구는 우리나라의 가축유전자원을 수집하고 보존하는 방법을 개발하기 위하여 종축의 증식 효율이 가장 높일 수 있는 방법으로 판단되는 난자생검법(OPU)을 실시하였다. 회수 된 난자는 체외에서 성숙·수정한 후, 체외 발생시키는 방법으로 백우와 흑우의 암컷에서 배반포를 생산하였다
- 본 연구에서는 희소한우 중 가장 개체수가 적게 보유하고 있는 백우와 흑우를 중심으로 후대의 생산과 동시에 동결 유전자원을 확보하는 방법을 강구하기 위하여 cysteamine을 OPU유래 난자의 성숙과정에 이용하는 방법을 검토하였다. cysteamine의 첨가효과는 0.
제안 방법
- OPU대상축으로 황우 2, 백우 1, 및 흑우 3마리를 선정하여 실험을 공시하였고 4~8세 범위의 개체를 사용하였다. OPU를 실시하는 1달 전, 국립축산과학원이 정한 표준사양법에 따라 사육하였으며 건초로 사육을 실시하였다
- Table 2에서는 도축장 유래 난소에서 채취한 난자와 백우, 황우, 흑우에서 OPU를 실시하여 채취한 난자를 0.1mM cysteamine을 첨가한 배양액에서 22시간 성숙시키고 체외수정을 실시하였다. mSOFaa 배양액에서 8일 동안 체외 발생을 유도하였을 때, 2세포기, 상실기 및 배반포기의 발생율을 조 사하면, 2세포기의 발생율은 백우, 흑우, 황우가 각각 79.
- 9mM이 함유된 성숙배양액에서 체외 성숙을 실시하였다. 각 처리군 당 A, B 급 난자를 무작위로 배치하고 22시간동안 성숙된 난자을 체외수정에 이용되었으며 mSOFaa 배양액에서 8일 동안 체외 발생을 실시하였다. Table 1에서는 0.
- 성숙배양이 끝난 난자는 황우는 한우 후보씨 수소(KPN 999)를 이용하여 수정을 실시하였으며 유전자원으로 선발된 백우와 흑우의 정액을 triladyl-egg yolk 희석액으로 동결한 스트로를 이용하여 수정하였다. 기본 배양액으로 BO배지를 활용하였으며(Brackett과 Oliphant, 1975), 37도에서 45초간 융 해된 동결정액을 calcium과 magnesium이 없는 PBS 6ml로 800g에서 7분간 원심 분리하여 세정하였다. 정자의 활성도를 높이기 위하여 thiophillin 0.
- 난구세포가 제거된 난자는 mSOFai 발생용 배양액으로 옮겼으며 1% BME amino acid, 2% MEM non-essential amino acid, 3mg/ml FAF-BSA, 10㎍/ml insulin 및 2mM taurine이 첨가된 소적에서 2일 동안 5% CO2, 5% O2 와 90% N2로 조정 된 배양기에서 초기 발생을 유도하였으며(Holm 등, 1999; Takahashi와 First 1992), 배양 3일째에 FBS 10%를 첨가하였다. 배양 3일과 8일에 수정란의 발생단계를 2세포기, 상실기 및 배반포 형성율을 관찰하여 조사 하였다
- 그림 1에서 보는 바와 같이 시험에 공시된 난자는 세포질이 균일하고 난구세 포가 온전한 난자(grade A and B)와 난구세포가 일부 떨어졌으나 세포질이 균일한 난자(grade C)를 선별하였다. 난자를 흡입하는 압력은 40~80mmHg 음압을 이용하였으며 난포액은 50ml 플라스틱 튜브에 회수하였고, 100㎛ 수정란 회수용 미 세망으로 혈액과 세포 부유물은 제거하고 난자를 선별하였다. 25mM Hepes를 함유한 TCM199 5~10ml로 흡입하였고, 5% FBS 및 10IU/ml heparin이 포함되도록 조제하였다.
- 도축장 유래 난소에서 6시간이내 실험실로 이송한 난소에 서 난자를 채취하고 cysteamine 0, 0.1, 0.3, 0.9mM이 함유된 성숙배양액에서 체외 성숙을 실시하였다. 각 처리군 당 A, B 급 난자를 무작위로 배치하고 22시간동안 성숙된 난자을 체외수정에 이용되었으며 mSOFaa 배양액에서 8일 동안 체외 발생을 실시하였다.
- 85% 생리식염수에 세척하였으며 100U/ml penicillin과 100㎍/ml streptomycin이 첨가된 동일한 용액에서 23~28℃에서 보존하여 실험실로 이송하였 다. 도축후 6시간 안에 난소를 처리하였으며 난포에서 난자난구세포 복합체(COCs)를 18G 주사침으로 흡입하여 회수하였다. 희소한우(백우, 흑우)와 황우의 개체에서 OPU방법은 COCs를 주간 2회 초음파도구(MyLab 3D, Esate corp.
- 초음파 장비를 활용하여 난자를 흡입하는 방법은 체외 수 정기법과 함께 배반포 생산 효율을 최적화하기 위하여 가장 우수한 난자를 얻을 수 있다. 또한, 소 난자의 체외 성숙과정 에서 중요한 기능을 담당하고 있다고 알려진 cysteamine 첨가 하여 수정란 생산방법을 검토하였다. cysteamine의 이용성은 소의 난자에서 처음 기능이 알려지기 시작하여 돼지의 난자 성숙에도 중요한 인자라고 알려져 있으며(Merton 등, 2013), 염소 난자의 체외수정 연구에도 우수한 결과가 보고되었다 (Urdaneta 등 2004).
- 로 조정 된 배양기에서 초기 발생을 유도하였으며(Holm 등, 1999; Takahashi와 First 1992), 배양 3일째에 FBS 10%를 첨가하였다. 배양 3일과 8일에 수정란의 발생단계를 2세포기, 상실기 및 배반포 형성율을 관찰하여 조사 하였다
- 희소한우의 체외 수정란을 체외에서 대량생산하여 유전자원을 확보하는 방법은 OPU기법이 가장 우수하다고 판단되는 데이는 단기간에 지속적으로 배반포를 생산하는 방법이기 때 문이다. 본 연구에서는 백우(한우 알비노 변이종)의 경우 1달 동안 총 8회의 OPU시술로 체외수정에 사용가능한 우수한 난 자를 62개 회수하였으며 총 26개의 이식 가능한 수정란을 생산하였다. 41.
- 성숙 배양액은 TCM199을 100ml 당 Hepes 0.298g, NaHCO3 0.22g을 정량하여 기본배양액으로 준비하고 항생제 는 penicillin 50U/ml과 streptomycin 50㎍/ml, FBS(Gibco, Korea) 5%, FSH 0.1U/ml 및 cysteamine 100μM을 첨가하여 5% CO2로 조정된 배양기에서 22~23시간 성숙시켰다.
- 성숙배양이 끝난 난자는 황우는 한우 후보씨 수소(KPN 999)를 이용하여 수정을 실시하였으며 유전자원으로 선발된 백우와 흑우의 정액을 triladyl-egg yolk 희석액으로 동결한 스트로를 이용하여 수정하였다. 기본 배양액으로 BO배지를 활용하였으며(Brackett과 Oliphant, 1975), 37도에서 45초간 융 해된 동결정액을 calcium과 magnesium이 없는 PBS 6ml로 800g에서 7분간 원심 분리하여 세정하였다.
- 체외 성숙된 난자 당 5~10×103개가 함유되도록 정자 부유액을 최종 부피가 25~50 ㎕ 소적이 되도록 첨가하였다.
- 체외 성숙된 난자 당 5~10×103개가 함유되도록 정자 부유액을 최종 부피가 25~50 ㎕ 소적이 되도록 첨가하였다. 체외 수정시간은 8시간으로 조 정하였으며 수정된 난자를 체외 배양하기 위하여 COCs를 난 자와 동일한 크기의 미세 유리관으로 흡입 및 배출을 반복하여 난구세포를 제거하였다.
- 도축후 6시간 안에 난소를 처리하였으며 난포에서 난자난구세포 복합체(COCs)를 18G 주사침으로 흡입하여 회수하였다. 희소한우(백우, 흑우)와 황우의 개체에서 OPU방법은 COCs를 주간 2회 초음파도구(MyLab 3D, Esate corp. Spain) 를 이용하여 COCs를 흡입하였으며, 이 때 7.5MHz의 질검용 프루브를 장착한 OPU가이드를 이용하여 난소를 관찰하였다. OPU시술 전 2% lidocaine용액(DAIHAN Pharm.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 한우는 국립축산과학원의 실험동물윤리 위원회의 승인을 얻어 실시하였다(승인번호 NIAS-2015159). OPU대상축으로 황우 2, 백우 1, 및 흑우 3마리를 선정하여 실험을 공시하였고 4~8세 범위의 개체를 사용하였다. OPU를 실시하는 1달 전, 국립축산과학원이 정한 표준사양법에 따라 사육하였으며 건초로 사육을 실시하였다
- 5MHz의 질검용 프루브를 장착한 OPU가이드를 이용하여 난소를 관찰하였다. OPU시술 전 2% lidocaine용액(DAIHAN Pharm. Co. Ltd, Korea)을 이용하여 경막마취를 실시하였다. 그림 1에서 보는 바와 같이 시험에 공시된 난자는 세포질이 균일하고 난구세 포가 온전한 난자(grade A and B)와 난구세포가 일부 떨어졌으나 세포질이 균일한 난자(grade C)를 선별하였다.
- 도축장에서 난소를 채취하고 0.85% 생리식염수에 세척하였으며 100U/ml penicillin과 100㎍/ml streptomycin이 첨가된 동일한 용액에서 23~28℃에서 보존하여 실험실로 이송하였 다. 도축후 6시간 안에 난소를 처리하였으며 난포에서 난자난구세포 복합체(COCs)를 18G 주사침으로 흡입하여 회수하였다.
- 본 연구에 사용된 cysteamine, TCM 199, sodium pyruvate, glutamine, fatty acid free bovine serum albumin(FAF-BSA), antibiotics antimicotics, MEM-nonessential aminoacids, BMEessential amino-acid, thiophilline 와 FSH는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)제품을 사용하여 실험을 실시하였다
데이터처리
- 난자의 난할율 및 발생율은 student’s t-test로 분석을 실시하였다.
성능/효과
- 0.1mM 처리군의 배반포 발생율은 실험 군과 0.9mM 처리군에 비하여 유의적으로 높은 수치가 관찰 되었으나 (19.6%, 30.5% 및 11.9%), 0.3mM 처리군의 발생율 (30.5% 대 29.8%)과 차이가 존재하지 않았다(P > 0.05).
- 본 연구에서는 백우(한우 알비노 변이종)의 경우 1달 동안 총 8회의 OPU시술로 체외수정에 사용가능한 우수한 난 자를 62개 회수하였으며 총 26개의 이식 가능한 수정란을 생산하였다. 41.9%의 배반포 생산율은 도축유래 난자의 배반포 생산율(30.5%)보다 높은 수치로 관찰되었으며 이는 OPU 유래 난자의 질적 균일성이 도축장 난소유래 난자보다 더 우수하기 때문인 것으로 추정된다. 그러나 본 연구에 사용된 희소 한우 의 수가 백우 1두, 흑우 3두로 충분하지 않기 때문에 추후 연구를 통하여 자료 확보가 더 필요한 것으로 판단된다.
- 생체의 난소를 다루는 방법은 많은 어려움이 존재하기 때문에 혈액이 오염될 가능성이 많으며 (Ginther 등, 1997), 시술자의 숙련도 에 따라 난포 내 난자의 회수율이 차이가 심하다고 알려져 있으나 회수된 난자의 질는 도축장 유래 난소보다 더 우수한 것으로 관찰되었고 이는 다른 연구자의 결과와도 동일하다고 판단된다. OPU과정 중에서 난자의 회수율과 배반포 발생 효율 은 독립적이라는 것을 관찰할 수 있었는데 이는 Tamassia 등 (2003)에 의하여 발표된 결과와도 동일하며 아마도 어미 소의 영향력이 더 큰 것으로 사료되었다. 그러므로 이러한 효과를 관찰하기 위하여 더 많은 유전자원축이 OPU 유래 난자의 성숙, 체외 수정 후 배발생 연구에 필요하며 이는 동결유전자원 확보에 중요한 기술로 판단된다
- 1mM cysteamine을 첨가한 배양액에서 22시간 성숙시키고 체외수정을 실시하였다. mSOFaa 배양액에서 8일 동안 체외 발생을 유도하였을 때, 2세포기, 상실기 및 배반포기의 발생율을 조 사하면, 2세포기의 발생율은 백우, 흑우, 황우가 각각 79.0%, 73.8%, 81.8%로 관찰되었으며 백우의 2세포기 발생율은 도축 난소 유래 난자의 난할율보다 유의적으로 높게 관찰되었다. 상실기와 배반포의 출현율은 백우의 OPU유래 수정란는 51.
- 05). 그러나, 상실기로 발생하는 수정란은 0.9mM 처리군에서 유의적으로 낮게 나타났고(13.6%), 0.1mM 처리군의 상실기 발생율이 대조군에 비하여 유의적으로 높게 관찰되었다 (26.8% 대 42.4%). 0.
- 1mM이 최적으로 보고되었으며 이 농도를 희소한우의 OPU유래 난자의 성숙에 사용되어도 높은 성적의 배반포 발생율이 관찰되었다. 그러므로 0.1mM cysteamine을 이용하여 난자를 성숙하는 방법은 난자의 성숙 에 도움이 되며 체외 성숙에서 발생능력을 잃어버릴 수 있는 난자를 회복시키는데 도움이 됨을 배반포 형성율을 관찰함으로서 증명하였다.
- 그러나 본 연구에 사용된 희소 한우 의 수가 백우 1두, 흑우 3두로 충분하지 않기 때문에 추후 연구를 통하여 자료 확보가 더 필요한 것으로 판단된다. 또한 시험 에 공시된 3마리의 흑우 중 2마리는 난포 낭종을 가진 개체로 난소에서 회수가 가능하다고 판단되는 난포의 개수가 평균 3.3 개로 백우나 황우보다 매우 낮았다(미발표 자료). 흑우의 경우, 평균 36.
- 8%로 관찰되었으며 백우의 2세포기 발생율은 도축 난소 유래 난자의 난할율보다 유의적으로 높게 관찰되었다. 상실기와 배반포의 출현율은 백우의 OPU유래 수정란는 51.6%와 41.9%로 관찰되었으며 황우는 40.5%와 26.2%, 흑우에서는 45.5% 및 36.4%로 관찰되었다. 그림 2에서 보는 바와 같이 백우와 흑우의 OPU유래 난자는 부화 배반포로 발생하였으며 도축장 유래 난자보다 백우 OPU유래 난자 발생율이 유의적으로 높은 것으로 관찰되었다(P < 0.
- 즉, 흑우 3마리에서 1달에 걸쳐 총 18회 OPU 시술 중에서 9회는 난자를 회수하지 못한 경우가 발견되었으며 이러한 수치는 OPU성적도 개체의 건강상태에 따라 변이가 매우 크게 나타난다는 것을 의미하고 있다. 흥미로운 점은 난 포낭종을 가진 개체에서는 회수한 난자도 cysteamine이 함유 된 배양액에서 성숙이 되어 배반포를 생산할 수 있음을 알 수 있었으며 이는 난포 낭종을 가진 도태 대상 유전자원에서도 OPU기법을 적용할 때 후대를 생산하거나 수정란의 동결을 통 하여 유전자원을 생산할 수 있다는 것을 증명하였다. 생체의 난소를 다루는 방법은 많은 어려움이 존재하기 때문에 혈액이 오염될 가능성이 많으며 (Ginther 등, 1997), 시술자의 숙련도 에 따라 난포 내 난자의 회수율이 차이가 심하다고 알려져 있으나 회수된 난자의 질는 도축장 유래 난소보다 더 우수한 것으로 관찰되었고 이는 다른 연구자의 결과와도 동일하다고 판단된다.
후속연구
- 5%)보다 높은 수치로 관찰되었으며 이는 OPU 유래 난자의 질적 균일성이 도축장 난소유래 난자보다 더 우수하기 때문인 것으로 추정된다. 그러나 본 연구에 사용된 희소 한우 의 수가 백우 1두, 흑우 3두로 충분하지 않기 때문에 추후 연구를 통하여 자료 확보가 더 필요한 것으로 판단된다. 또한 시험 에 공시된 3마리의 흑우 중 2마리는 난포 낭종을 가진 개체로 난소에서 회수가 가능하다고 판단되는 난포의 개수가 평균 3.
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