Cysteine 첨가로 배양된 소 수정란의 발달과 동결성 효과 Developmental and survivability according to cryopreservation of in vitro produced bovine embryos cultured by addition of Antioxident cysteine원문보기
The aim of the present study was to assess the embryo development and survivability of post-thawed bovine embryos produced in vitro by addition of cysteine. The rates of metaphase II formation were not differed significantly among three groups(TCM199 73.8%, TCM199 with 0.3% cysteine 76.9%, TCM199 wi...
The aim of the present study was to assess the embryo development and survivability of post-thawed bovine embryos produced in vitro by addition of cysteine. The rates of metaphase II formation were not differed significantly among three groups(TCM199 73.8%, TCM199 with 0.3% cysteine 76.9%, TCM199 with 0.5% cysteine 83.8%, respectively). No difference of cleavage rate(70.6~74.6%) was seen among three culture medium(TCM199 70.6%, CR1aa 71.3%, SOF 74.6%) with 0.5M cysteine. however, Significantly(P<0.05) higher development rate into blastocyst stage by 0.5M cysteine addition was obtained in SOF medium(35.6%) than in TCM199(27.6%) or CR1aa(26.6%), however no significant differences in the cleavage rates were among three culture medium. After frozen the blastocysts cultured with 0.5M cysteine, The re-expansion rates were 61.3%~86.4% among groups, and hatching rates were 26.3%~46.9% among groups, the rates of re-expansion and hatching were significantly(P<0.05) higher in SOF medium(86.4% and 46.9%) than those in TCM199(61.3% and 26.3%) and CR1aa medium(87.1 and 44.4%). After thawing, the blastocyst re-expansion rate was significantly(P<0.05) higher in in vivo (87.1%) and in vitro (70.3%) embryos. In conclusion, our results demonstrate that supplementation of IVM and IVC medium with 0.5M cysteine improved the quality of in vitro production embryo and post- thawed embryo. Future studies comparing these media systems in well-designed trials should be performed.
The aim of the present study was to assess the embryo development and survivability of post-thawed bovine embryos produced in vitro by addition of cysteine. The rates of metaphase II formation were not differed significantly among three groups(TCM199 73.8%, TCM199 with 0.3% cysteine 76.9%, TCM199 with 0.5% cysteine 83.8%, respectively). No difference of cleavage rate(70.6~74.6%) was seen among three culture medium(TCM199 70.6%, CR1aa 71.3%, SOF 74.6%) with 0.5M cysteine. however, Significantly(P<0.05) higher development rate into blastocyst stage by 0.5M cysteine addition was obtained in SOF medium(35.6%) than in TCM199(27.6%) or CR1aa(26.6%), however no significant differences in the cleavage rates were among three culture medium. After frozen the blastocysts cultured with 0.5M cysteine, The re-expansion rates were 61.3%~86.4% among groups, and hatching rates were 26.3%~46.9% among groups, the rates of re-expansion and hatching were significantly(P<0.05) higher in SOF medium(86.4% and 46.9%) than those in TCM199(61.3% and 26.3%) and CR1aa medium(87.1 and 44.4%). After thawing, the blastocyst re-expansion rate was significantly(P<0.05) higher in in vivo (87.1%) and in vitro (70.3%) embryos. In conclusion, our results demonstrate that supplementation of IVM and IVC medium with 0.5M cysteine improved the quality of in vitro production embryo and post- thawed embryo. Future studies comparing these media systems in well-designed trials should be performed.
Table 1에서는 체외성숙율 조사를 위해서 체외성숙 기본 배양액으로 사용된 TCM 199 배양액에 LH, FSH, E2, EGF를 첨가한 대조구와 동일한 배양액내에 항산화제인 0.3mM0.5mM cysteine을 각각 첨가한 그룹으로 나누어 체외성숙율을 조사한 결과이다. 항산화제를 첨가하지 않은 체외성숙용 TCM 배양액에서 22시간 동안 체외성숙이 유도된 후 체외성숙율 조사에서 Germinal vesicle(GV)에서 Geminal Vesical Breakdown(GVBD) 단계는 비율은 9.
Table 2에서는 체외성숙된 난포란을 체외배양 한 후 48시간째 분할율과 168시간째 배반포 수정란의 발달율을 조사하였다. 우선 3가지 종류의 배양액에는 0.
체외수정란 생산 실험을 위해서 도축장 유래 난소를 회수하여 실험실로 운반하였다. 난소의 수송은 보온병에 0.9% 생리식염수에 항생제를 첨가하였으며, 온도는 25˚C로 맞추어 실험실로 2시간 이내로 운반하였다. 난포란 회수는 난소에서 직경이 2～6mm의 가시난포에서 19 gauge 주사침이 부착된 10ml 주사기를 이용하여 난포란을 채취하였다.
A)를 첨가하여 5% CO2 인큐베이터 내에서 22시간 동안 배양을 실시하였다. 도축 난포란의 체외성숙 배양 후 핵의 성숙율을 조사를 위해 22시간 성숙된 난포란을 이용하였다. 체외성숙된 난포란을 3% Na-citrate 가 첨가된 Eppendorf 1.
(Belgium)를 25 mg, 6회째에 15 mg을 근육 주사하였고 CIDR를 제거하였다. 발정발현 징후가 확인된 공란우는 12시간 간격으로 2회 인공수정을 실시하였다, 인공수정 후 7일째 비외과적인 방법으로 체내수정란을 회수하였다.
수정란 배양은 6-well plate dish(IFP, JAPAN)에서 well 당 50µl 배양액에 20개의 수정된 난자를 넣어서 배양을 실시하였다. 분할율은 체외수정 후 48시간에 확인하였으며, 배반포 수정란 평가는 수정 후 7일과 8일째 생산된 배반포 수정란으로 하였다.
25 ml 수정란이식용 플라스틱 스트로우내에 수정란을 장착하였다. 수정란의 동결은 수정란 자동 동결기(CL 863, U.S.A)를 사용하여 실시하였다. 스트로우를 동결기의 chamber에 넣고 3분간 정치(-7°C, 10분)한 후 seeding을 실시하고, 최종 동결 온도인 -35°C까지 도달하기 위해서 0.
수정란의 완만동결을 위한 동결 보호제로서는 1.8 M ethylene glycol(EG), 그리고 평형 배양액은 TL-HEPES 배양액에 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco, U.S.A)을 첨가하여 사용하였다. 수정란 장착은 1.
완만동결 수정란 융해 후 생존율 확인을 위한 수정란 융해는 스트로우를 보관고에서 꺼내어 공기 중에 약 10초간 노출 시킨 후 37°C로 가온된 온수에서 약 20초간 융해 하여 TL-HEPES 배양액에서 3회 세척한 후 체외배양액으로 옮겨 1회 세척한 다음 융해 직후, 48시간과 72시간 동안 배양을 실시하여 수정란의 재확장 및 부화 여부로 생존성을 판단하였다.
체외 성숙을 위해서 TCM199(Sigma, U.S.A)를 기본배양액으로 5% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco, U.S.A), 10μg/ml LH (Sigma, U.S.A) 및 35μg/ml FSH (Sigma, U.S.A)과 항산화제인 0.5mM cysteine(Sigma, U.S.A)를 첨가하여 5% CO2 인큐베이터 내에서 22시간 동안 배양을 실시하였다.
체외배양에 사용된 수정란은 체외수정 후 체외배양은 synthetic oviductal fluid(SOF)에는 0.5µM sucrose를 첨가하였고 CR1aa 배양액에는 5% FBS를 첨가된 배양액을 사용하였다.
도축 난포란의 체외성숙 배양 후 핵의 성숙율을 조사를 위해 22시간 성숙된 난포란을 이용하였다. 체외성숙된 난포란을 3% Na-citrate 가 첨가된 Eppendorf 1.5ml 튜브에 넣고 약 2분간 vortexing을 실시하여 난구세포를 완전히 제거하고 Acetic acid 와 Methanol이 3:1의 비율로 희석된 고정액에 난구세포가 제거된 난포란을 넣어 24시간 동안 고정을 실시한 후 Aceto-orcein로 염색을 실시하여 난포란의 핵형을 400x 현미경하에서 GV-GVBD, MI-T1, MII의 3단계로 구분하여 핵성숙율을 조사하였다.
체외성숙된 난포란의 난구세포 일부를 제거하기 위해서 0.1% PVA (Polyvinyl Alcohol)가 첨가된 D-PBS 배양액에서 약 10초간 vortexing 후 50μl 미소적에 약 12~15개의 체외성숙된 난포란과 정자를 공동 배양하여 수정을 유도하였다.
Table 4에서는 채내수정란과 체외수정란의 생존율 결과를 비교하였다. 체외수정란은 SOF 배양액에 0.5mM cysteine을 첨가하여 7일째 생산된 수정란과 체내수정란은 과배란처리 방법으로 인공수정 후 7일째 회수된 수정란을 1.5M ethylene glycol 배양액에서 동결 후 융해하였을 때 수정란의 생존성을 조사하였다. 체내수정란에 있어서 동결 융해 후 48시간까지 배양하였을 때 수정란이 재형성을 보인 비율은 87.
체외수정에 사용된 정액은 한우동결정액을(KPN) 이용하였으며, 정자분리는 BO medium을 이용하여 1,800rpm에서 5분 동안 2회 원심분리 수정 배양액인 IVF 100 (IFP, Japan) 에서 1회 원심 분리하여 체외수정을 실시하였다. 사용된 정액의 최종농도는 2×106/ml 이었다.
대상 데이터
수정란의 생산 효율을 높이기 위해서 체외배양액에 혈청을 첨가하고 난구 세포와 공동배양을 실시하는 배양체계에서는 혈청의 첨가가 수정란에 이중적인 효과를 나타내기도 한다. 그것은 초기 분할 단계의 억제를 시킴과 동시에 상실배와 배반포기배의 발달을 촉진한다고 보고하였으며(Pinyopummintr and Bavister, 1991), 또한 본 연구에서 수정란 동결을 위해서 사용된 동결보제 종류는 1.5M Ethylene glycol 을 사용하였다. Takagi 등(1993)등은 1.
9% 생리식염수에 항생제를 첨가하였으며, 온도는 25˚C로 맞추어 실험실로 2시간 이내로 운반하였다. 난포란 회수는 난소에서 직경이 2～6mm의 가시난포에서 19 gauge 주사침이 부착된 10ml 주사기를 이용하여 난포란을 채취하였다. 체외성숙을 위해서 난포란은 1, 2등급 (IETS 기준)만을 사용하였다.
난포란 회수는 난소에서 직경이 2～6mm의 가시난포에서 19 gauge 주사침이 부착된 10ml 주사기를 이용하여 난포란을 채취하였다. 체외성숙을 위해서 난포란은 1, 2등급 (IETS 기준)만을 사용하였다. 체외 성숙을 위해서 TCM199(Sigma, U.
데이터처리
실험결과의 통계적 분석은 SAS package 방법을 이용하여 실시하였으며, GLM(General Linear Model) 과정 적용으로 각 요인간의 Least squre means를 구하여 유의성 검정(P<0.05)을 실시하였다.
성능/효과
3%의 결과를 보였다. Cysteine이 첨가된 두 그룹간의 유의적인 차이는 없었으나, 수정적기 단계인 제2감수분열중기(MII) 비율은 항산화제 cysteine이 0.3mM 첨가된 그룹보다 0.5mM cysteine을 첨가 하였을 때 다소 높은 높은 결과를 보였다. 일반적으로 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 세포내에서의 미토콘드리아의 호흡과정과 수정란 발달과정 그리고 난구세포의 성숙과정에서 일어나는 정상적인 현상이지만 소 수정란의 체외발생 동안에 ROS 수준이 증가하는 것은 수정란 발달의 저해와 같은 장애를 일으킨다(Martín-Romero 등, 2008).
TCM199 배양액에서 생산된 수정란이 CR1aa와 SOF 배양액에서 생산된 수정란 보다 유의적으로(P<0.05) 낮은 결과를 보였다.
05) 낮은 결과를 보였다. 그러나 CR1aa과 SOF 배양액에서 생산된 배반포 수정란의 재확장율은 CR1aa 배양액에서 다소 높은 경향을 보였다. 이러한 결과는 수정란의 부화율에서도 비슷한 결과를 보였다.
5mM cysteine을 첨가하여 수정후 7일째 생산된 배반포 수정란을 동결 후 융해하여 수정란을 평가한 결과이다. 대조구로서 5% 혈청이 첨가된 TCM 199에서 생산된 배반포 수정란의 동결 융해 후 재확장 비율은 61.3%를 보였다. 그리고 CR1aa과 SOF 배양액에서는 87.
5µM sucrose를 수정 후 48시간째와 136시간째 신선배양액으로 교환하여 배양하였다. 대조구로서 TCM199 배양액에 체외수정 후 분할율은 70.6%, CR1aa 배양액에서는 71.3% 그리고 SOF 배양액에서는 74.6%의 결과를 보였으나 배양액간 분할율에서는 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 체외수정 후 7일째 생산된 배반포 수정란의 발달율은 각 배양액별 27.
이러한 결과는 수정란의 부화율에서도 비슷한 결과를 보였다. 동결 수정란의 융해후 부화율은 TCM199 배양조건에서 생산된 수정란의 부화율은 26.3%, CR1aa 과 SOF 배양조건에서는 44.4%와 46.9%의 결과를 각각 나타내었는데 부화율에서는 SOF 배양조건이 다소 높은 결과를 보였으나, 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 수정란의 생산 효율을 높이기 위해서 체외배양액에 혈청을 첨가하고 난구 세포와 공동배양을 실시하는 배양체계에서는 혈청의 첨가가 수정란에 이중적인 효과를 나타내기도 한다.
체내수정란에 있어서 동결 융해 후 48시간까지 배양하였을 때 수정란이 재형성을 보인 비율은 87.1%인 반면 체외수정란에 있어서는 70.3%를 보여 체외수정란 보다 유의적으로(P<0.05) 높게 나타났으나 재확장된 수정란에서 부화된 수정란의 비율은 체내수정란이 44.4% 그리고 체외수정란이 34.6%의 결과를 보였으나 두 그룹간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다.
6%의 결과를 보였으나 배양액간 분할율에서는 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 체외수정 후 7일째 생산된 배반포 수정란의 발달율은 각 배양액별 27.6%와 26.6% 그리고 35.6% 로서 C-SOF 배양액에서 유의적으로 높은 배반포 수정란을 생산하였다. 체외배양에서 중요한 것은 BSA 와 마찬가지고 단백질 물질과 아미노산들이 포함되어 있다.
5mM cysteine을 각각 첨가한 그룹으로 나누어 체외성숙율을 조사한 결과이다. 항산화제를 첨가하지 않은 체외성숙용 TCM 배양액에서 22시간 동안 체외성숙이 유도된 후 체외성숙율 조사에서 Germinal vesicle(GV)에서 Geminal Vesical Breakdown(GVBD) 단계는 비율은 9.5%, 제1감수분열 중기(Metaphase I) - 유사분열 말기(Telophase 1) 단계 비율은 16.7%, 그리고 체외성숙이 완료된 제2감수분열 중기(Metaphase II) 단계의 비율은 73.8%의 결과를 보였으며, TCM 199 기본 배양액에 항산화제 0.3mM cysteine 첨가된 배양액의 결과는 GV-GVBD 단계가 11.7%, MI-T1 단계는 11.4% 그리고 MII 단계의 비율은 76.9%의 결과를 보였며, 0.5mM cysteine 첨가된 배양액의 결과는 GV-GVBD 단계가 7.4%, MI-T1 단계는 8.7% 그리고 MII 단계의 비율은 83.3%의 결과를 보였다. Cysteine이 첨가된 두 그룹간의 유의적인 차이는 없었으나, 수정적기 단계인 제2감수분열중기(MII) 비율은 항산화제 cysteine이 0.
후속연구
이러한 결과는 체외수정란 배양시스템의 안정적인 구축이 이루어지고 있음을 보여주고 있다. 따라서 배양체계의 확립은 수정란 동결 후의 생존성 향상과 더불어 수정란이식을 통한 가축의 개량과 증식에도 많은 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
활성산소란?
그러나 혈청이 첨가된 배양액은 수정란이식 후 거대 송아지의 생산과 미확인된 바이러스와 프리온 같은 병원체를 운반하기도 하며(Young 등, 1988; Sinclair 등, 2000), 비정상적으로 세포질내에 많은 지방이 축적되어 내동성을 저하시키는 원인으로 보고하였다(Ferguson와 Lee 1999; Abe 등, 2002; Rizos 등 2003; Sudano 등 2011). 활성산소는 세포의 정상적인 발달과정에서 생성되는 물질로서 특히 소 수정란의 체외 성숙 발달과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있어 수정란의 체외발달율을 저하시키는 결과를 초래하게 된다. (Trounson 등, 2001).
소 태아 혈청이 첨가된 배양액은 어떤 문제점이 있는가?
소 태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS)은 수정란 배양을 위한 단백질 공급원으로서 정상적으로 사용되어 왔다. 그러나 혈청이 첨가된 배양액은 수정란이식 후 거대 송아지의 생산과 미확인된 바이러스와 프리온 같은 병원체를 운반하기도 하며(Young 등, 1988; Sinclair 등, 2000), 비정상적으로 세포질내에 많은 지방이 축적되어 내동성을 저하시키는 원인으로 보고하였다(Ferguson와 Lee 1999; Abe 등, 2002; Rizos 등 2003; Sudano 등 2011). 활성산소는 세포의 정상적인 발달과정에서 생성되는 물질로서 특히 소 수정란의 체외 성숙 발달과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있어 수정란의 체외발달율을 저하시키는 결과를 초래하게 된다.
활성산소가 소 수정란에 미치는 영향은?
그러나 혈청이 첨가된 배양액은 수정란이식 후 거대 송아지의 생산과 미확인된 바이러스와 프리온 같은 병원체를 운반하기도 하며(Young 등, 1988; Sinclair 등, 2000), 비정상적으로 세포질내에 많은 지방이 축적되어 내동성을 저하시키는 원인으로 보고하였다(Ferguson와 Lee 1999; Abe 등, 2002; Rizos 등 2003; Sudano 등 2011). 활성산소는 세포의 정상적인 발달과정에서 생성되는 물질로서 특히 소 수정란의 체외 성숙 발달과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있어 수정란의 체외발달율을 저하시키는 결과를 초래하게 된다. (Trounson 등, 2001).
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