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문제 정의
- coli 세포 파쇄물의 insoluble fraction에서 발견된다는 사실도 이미 본 연구팀에 의하여 밝혀졌다[16-18]. 본연구에서는 선행연구에서 HD-gal 합성을 확인하였기 때문에[11, 12], HD-gal 합성 후, 보다 효과적인 HD-gal을 정제하는 방법에 대하여 연구하였다. 이러한 정제연구는 transgalactosylation 반응에 의하여 합성된 HD-gal 분자의 항균력 실험과 세포독성 실험에 많은 양의 HD-gal이 요구되기 때문에 반드시 필요한 연구로 판단되었다.
가설 설정
- 4 mM 까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이 때, HD가 오직 HD-gal로만 conversion 된다고 가정하고, HD-gal과 percent conversion을 같이 graph에 그려보았다. Fig.
제안 방법
- Fig. 1A에서와 같이 고농도의 lactose (300 g/l) 존재 하에서 β-gal을 함유한 E. coli 세포를 이용하여, 48 시간 동안 75 mM의 HD로 부터 HD-gal 합성을 실시하여 TLC 분석으로 확인하였다.
- 0 μl이며, silica gel chromatography를 이용한 정제 후, 분획물을 분석할 때는 20 μl의 시료를 사용하였다. HD와 HD-gal의 정량이 필요할 경우에는 TLC plate 스캔하여 이미지를 얻은 후, AlphaEase FC software (Alpha Innotech, San Leonardo, CA, USA)를 이용하여 정량 분석하였다[11].
- 0 cm 남았을 때, HD-gal이 함유된 반응액 이나 용매 추출물 8 ml를 loading 한다. 그 후 이동상을 중력에 의하여 연속적으로 흘리면서 35 ml씩 분획물을 받고, 그 분획물을 TLC로 분석하였다[11, 12].
- 다른 연구팀의 연구에서도 이러한 galactosylation이 nucleoside의 water solubility를 증가시킨다는 연구 결과를 보고하고 있다[19]. 그래서 HD-gal을 silica gel chromatography를 이용하여 분리 정제하기 전에 물에 녹지 않는 용매를 이용하여 반응액을 분획 처리하여, 물에 보다더 잘 녹는 HD-gal과 상대적으로 용매에 잘 녹는 HD를 분획 분리하기로 하였다. 물에 녹지 않는 용매로는 methylene chloride (density = 1.
- 그러나, fraction number 7, 8에서는 단당류로 추정되는 물질이 관찰되었다. 그래서, fraction number 7, 8의 HD-gal 이외의 단당류 추정 물질이 무엇인지를 확인하기 위하여 이 fraction에 대한 TLC를 실시한 후, 단당류를 염색하는 시약으로 처리하여 확인해 보았다(Fig. 6). 그 결과 transgalactosylation 반응 후, 남아있는 glucose로 추정할 수 있었다(② in Fig.
- 그리고 1st antibody와 2nd antibody를 각각 1 : 5,000와 1 : 10,000 비율로 희석하여 사용하여 처리한 후, ECL substrate와 반응시키고, X-ray film에 노출시켜 β-gal 밴드를 확인하였다.
- 그리고 staining solution #1 (1.25 g KMnO4, 10 g K2CO3, 1.25 ml 10 % NaOH in 200 ml water) (in Fig. 1, 3, 4, 5, and 7) 혹은 staining solution #2 (0.5% α-naphtol, 5% H2SO4 in ethanol)(in Fig. 6)를 TLC plate에 뿌린 후, 80℃ oven 에서 15 분간 말려서 밴드를 확인 하였다.
- 그리고, 시간 별로 sampling 한 반응액에서 E. coli 세포를 분리하고, soluble과 insoluble fraction을 분획한 후, Western blotting으로 β-gal의 존재를 확인하였다(Fig. 1B).
- 대장균의 araBAD 프로모터 시스템에 의하여 발현이 조절되는 pBAD/Myc-His/lacZ vector(7.2 kb) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 E. coil MC1061를 발현 숙주로 하여 β-gal을 발현하였다.
- 또한, Fig. 1의 48 시간 동안의 HD-gal 합성반응 결과에서 HD 변화량을 TLC image 분석을 통하여 정량적으로 계산하여 보았다. Fig.
- 그래서 HD-gal을 silica gel chromatography를 이용하여 분리 정제하기 전에 물에 녹지 않는 용매를 이용하여 반응액을 분획 처리하여, 물에 보다더 잘 녹는 HD-gal과 상대적으로 용매에 잘 녹는 HD를 분획 분리하기로 하였다. 물에 녹지 않는 용매로는 methylene chloride (density = 1.33g/ml)와 ethyl acetate (density = 0.90 g/ml)를 선정하여 비교 실험하였다. 반응액에 용매를 섞은 후, 1차 분획하여 물 층을 얻고, 이 물 층을 용매로 2차 분획하여 다시 물 층을 얻는 방법으로 총 4회 분획 분리를 실시하였다(Fig.
- 90 g/ml)를 선정하여 비교 실험하였다. 반응액에 용매를 섞은 후, 1차 분획하여 물 층을 얻고, 이 물 층을 용매로 2차 분획하여 다시 물 층을 얻는 방법으로 총 4회 분획 분리를 실시하였다(Fig. 4). Methylene chloride의 경우에 물 층으로 HD-gal이 이동하는 것이 확인 되었으나, 잔여 HD도 계속해서 물층에 남아 있는 것이 확인되었다(Fig.
- 본 연구에서는 75 mM의 HD를 이용하여 transgalactosylation 반응액을 수행하여 약 94%의 수율로 HD-gal을 합성할 수 있었고, 이어서 ethyl acetate를 이용한 잔여 HD 추출제거, 그리고 silica gel chromatography를 수행하여 정제된 순수한 HD-gal을 얻었다. 반응에 첨가된 75mM의 HD를 기준으로 생산 수율을 계산하여 보았는데, 최종 정제된 HD-gal의 수율은 mole 기준으로는 약 8.
- 본 연구에서도 선행연구에서와 같이 HD-gal을 재조합 β-galactosidase (β-gal)가 발현된 Escherichia coli (E. coli) 세포를 이용하여 HD-gal을 합성하였다[1-4].
- 이 결과를 바탕으로 silica gel chromatography 실시 전에 ethyl acetate로 분획 처리하여 반응액에 남아 있는 잔여 HD를 선택적으로 제거하기로 하였다. Fig.
- Fraction number 4, 5, 6에서 없는 비교적 순수한 HD-gal을 얻을 수 있었으며, 어느 분획물에서도 HD는 확인 할 수 없었다. 이 때, fraction number 4, 5, 6을 모아서 농축하여 정제된 HD-gal 용액을 제조하였다. 그러나, fraction number 7, 8에서는 단당류로 추정되는 물질이 관찰되었다.
- 이와 같이 용매 층에는 HD가 물 층에 HD-gal이 더 잘 녹는 성질을 이용하여 HD와 HD-gal을 분획한다. 이 분획 방법을 총 4회의 실시하였으며, 선행연구에서 실시한 추출방법을 응용하여 사용하였다[2].
- 이러한 연구 결과를 종합하여 순수 분리된 HD-gal을 얻기 위하여, ethyl acetate 분획 분리를 이용하여, 10 ml의 transgalactosylation 반응액으로 부터 잔여 HD을 제거하고, 그 분획물을 silica gel chromatography에 loading 하여 순수한 HD-gal 정제를 실시하였다. 이 때, silica gel chromatography에서 약 70 ml의 순수한 HD-gal이 포함된 분획을 모을 수 있었고, 약 112 ml의 transgalactosylation 반응액을 이용하여 14~15회의 EA 분획 분리 및 silica gel chromatography 과정을 통하여 약 1 liter의 순수한 HD-gal이 포함된 분획물을 모을 수 있었다.
- 이렇게 합성된 HD-gal을 반응액으로 부터 정제하기 위하여 먼저 선행연구에서 사용한 silica gel chromatography를 실시하였다[1, 2, 4]. Fig.
대상 데이터
- 그리고 ECL (enhanced chemiluminescent) substrate과 X-ray film은 Thermo Fischer Scientific Co.(Waltham, MA, USA)와 GE Healthcare Life Sciences (Chicago, IL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 이때, marker로서 β-gal은 SigmaAldrich (St.
- 1, 2-Hexanediol은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였고, TLC (thin-layer chromatography) plate는 Macherey–Nagel(Düren, Germany)의 DC-Fertigplatten SILG-25 UV254를 사용하였다.
- HD-gal 정제를 위한 Silica gel은 Zeochem(Uetikon am See, Switzerland)의 ZEOprep 60(60-200 μm)을 사용하였고, 기타 본 연구에 사용한 시약들은 reagent-grade를 사용하였다.
- SDS-PAGE (sodium dodesyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)는 SE250(mini-vertical gel electrophoresis unit, GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 실시하였다. SDS-PAGE 실시 후, TE22 mini tank transfer unit (GE Healthcare Life Sciences)에서 nitrocellulose membrane (Hybond-C Extra, GE Healthcare Life Sciences)을 이용하여 단백질을 transfer 하였다.
- Western blotting을 위한 1st antibody인 anti-β-gal (rabbit IgG fraction)은 Molecular probes (Eugene, Oregon, USA)에서, 2nd antibody인 goat anti-rabbit IgG-HRP (horseradish preoxidase conjugate)는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다.
성능/효과
- Fig. 2의 결과에서와 같이 48 시간 동안 약 94% 정도의 HD가 HD-gal로 conversion되는 것을 확인하였고, 이는 본 연구 팀의 β-gal을 이용한CPN-gal [1, 3]과 PE-gal [2, 4]을 합성하는 연구에서의 약 64-67%, 그리고 약 50%의 conversion yield 보다 높은 값이며, 다른 두 외국 연구 팀의 CPN-gal 합성 연구의 결과인 15%와 12.5% 보다 더 높은 수치이다[5, 6].
- 7). Fig. 7의 TLC 결과에서 정제된 HD-gal 용액의 농도는 1.0 M 이며, HD와 glucose, galactose, lactose가 완전히 제거 되었음을 확인 할 수 있었다.
- 결론적으로, 이상 총 3회 실시한 75 mM의 HD로부터 HD-gal을 얻는 평균 수율은 mole 기준으로 약 8.9±0.6% (n=3), weight 기준으로 약 21.1±%(n=3) 였다.
- 0 M 농도로 HD-gal 정제 용액 약 700 μl을 얻을 수 있었다. 그리고, 정제된 HD-gal의 순도는 TLC 분석을 통하여 확인할 수 있었다(Fig. 7). Fig.
- 반응에 첨가된 75mM의 HD를 기준으로 생산 수율을 계산하여 보았는데, 최종 정제된 HD-gal의 수율은 mole 기준으로는 약 8.9±0.6% (n=3), weight 기준으로 약 21.1±1.4% (n=3) 정도였다.
- 위의 HD-gal 정제를 2회 더 실시 하여, 순수한 1 M의 HD-gal을 750 그리고 800 μl 얻을 수 있었다.
- 이 분획물을 모아서 rotary vacuum evaporator로 이동상을 제거하고, HD-gal의 무게를 측정한 후, 1.0 M 농도로 HD-gal 정제 용액 약 700 μl을 얻을 수 있었다.
- 이러한 결과는 선행연구에서 chlorphenesin (CPN)과 phenoxyethanol (PE)의 galactoside 유도체인 CPN-gal과 PE-gal을 합성할 때와 같은 결과이며[1, 2], 본 연구에 사용한 β-gal을 함유한 재조합 E. coli이 β-gal을 insoluble 형태로 발현되고, 효소로서 기능을 하고 있다는 것을 보여주는 결과라고 할 수 있다.
후속연구
- 이 glucose는 아마도 transgalactosylation 반응 시, lactose가 분해되며 galactose는 HD와 결합하고, 남은 glucose라고 추론할 수 있다. 보다 높은 수율의 HD-gal을 얻기 위해서는 앞으로 잔여 glucose를 분리 제거하는 정제방법에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 4% (n=3) 정도였다. 본 연구를 통하여, HD-gal을 순수 정제하는 방법을 확립하였으며, 앞으로 이러한 정제 방법을 이용하여 얻은 HD-gal로 항균력의 변화를 HD와 비교하여 수행할 예정이고, 피부세포에 대한 독성 변화를 역시 HD와 비교하여 분석할 예정이다. 선행연구의 CPN galactoside [1]와 PE galactoside [2]의 경우와 같이 항균력은 유사하게 유지하면서, 피부세포에 대한 독성이 감소된 새로운 화장품용 방부제 확인을 기대하고 있다.
- 이 때, HD-gal 합성반응이 종료된 후, 반응액에잔존하는 HD를 효과적으로 용매를 이용하여 제거하는 방법을 사용하여, silica gel chromatography를 이용한 HD-gal 정제 작업의 효율성을 증대 시켰다. 이러한 정제 방법으로 보다 순수한 HD-gal을 정제하여, HD-gal의 항균력과 피부세포에 대한 독성실험 수행을 보다 원활히 할 수 있을 것으로 기대하고 있다.
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