피나무속 식물은 화경의 아래에 부착된 선형의 포를 특징적으로 가지고 있으며 이러한 형질은 아욱과의 다른 속과 구분된다. 본 연구는 피나무속의 종간 계통학적 유연관계를 규명하고자 하였다. 계통학적 분석은 한국과 일본의 피나무속 10종, outgroup으로 멕시코목화를 선정하여 수행하였다. nrDNA의 ITS와 cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL의 염기서열을 확보하여 분석하였다. ITS, trnL-F 와 rpl32-trnL의 data를 유합한 결과 계통수는 6개의 분계조로 구성되었다. 구주피나무는 outgroup과 가장 가깝게 나타났다. 피나무 , 뽕잎피나무 그리고 털피나무는 한 분계조를 형성하였다. 연밥피나무, 섬피나무, 일본피나무는 각각 독립적인 분계조를 형성하였다. 섬피나무는 일본피나무와 가장 가까운 관계를 보여주었다. 보리자나무, 찰피나무, 염주나무는 하나의 분계조를 형성하여 서로 근연관계에 있음을 보여주었다.
피나무속 식물은 화경의 아래에 부착된 선형의 포를 특징적으로 가지고 있으며 이러한 형질은 아욱과의 다른 속과 구분된다. 본 연구는 피나무속의 종간 계통학적 유연관계를 규명하고자 하였다. 계통학적 분석은 한국과 일본의 피나무속 10종, outgroup으로 멕시코목화를 선정하여 수행하였다. nrDNA의 ITS와 cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL의 염기서열을 확보하여 분석하였다. ITS, trnL-F 와 rpl32-trnL의 data를 유합한 결과 계통수는 6개의 분계조로 구성되었다. 구주피나무는 outgroup과 가장 가깝게 나타났다. 피나무 , 뽕잎피나무 그리고 털피나무는 한 분계조를 형성하였다. 연밥피나무, 섬피나무, 일본피나무는 각각 독립적인 분계조를 형성하였다. 섬피나무는 일본피나무와 가장 가까운 관계를 보여주었다. 보리자나무, 찰피나무, 염주나무는 하나의 분계조를 형성하여 서로 근연관계에 있음을 보여주었다.
The genus Tilia is characterized by linear form bracts of which the lower part is attached to the peduncle of a cyme. This character is distinguished from the others genus of Malvaceae. The purpose of this study is verifying the phylogenetic relationship of genus Tilia. Phylogenetic analyses were co...
The genus Tilia is characterized by linear form bracts of which the lower part is attached to the peduncle of a cyme. This character is distinguished from the others genus of Malvaceae. The purpose of this study is verifying the phylogenetic relationship of genus Tilia. Phylogenetic analyses were conducted to evaluate relationships of 10 taxa of Tilia in Korea and Japan including one outgroup (Gossypium hirsutum). The molecular phylogenetic analyses were conducted with sequences based on ITS, trnL-F and rpl32-trnL region. The combined data result of ITS, trnL-F and rpl32-trnL was formed by 6 clades. T. kiusiana situated as the most basal clade. T. amurensis, T. taquetii and T. rufa are composed a clade. T. koreana, T. insularis and T. japonica was formed independent clade. T. insularis has the closest relationship with T. japonica. T. miqueliana, T. mandshurica, and T. megaphylla are composed a clade and showed a sister relationship than other species.
The genus Tilia is characterized by linear form bracts of which the lower part is attached to the peduncle of a cyme. This character is distinguished from the others genus of Malvaceae. The purpose of this study is verifying the phylogenetic relationship of genus Tilia. Phylogenetic analyses were conducted to evaluate relationships of 10 taxa of Tilia in Korea and Japan including one outgroup (Gossypium hirsutum). The molecular phylogenetic analyses were conducted with sequences based on ITS, trnL-F and rpl32-trnL region. The combined data result of ITS, trnL-F and rpl32-trnL was formed by 6 clades. T. kiusiana situated as the most basal clade. T. amurensis, T. taquetii and T. rufa are composed a clade. T. koreana, T. insularis and T. japonica was formed independent clade. T. insularis has the closest relationship with T. japonica. T. miqueliana, T. mandshurica, and T. megaphylla are composed a clade and showed a sister relationship than other species.
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문제 정의
따라서 본 연구는 잎의 크기, 성모의 색상, 열매의 능각의 유무 등을 식별형질로 피나무와 구분하고 현재 분류학적 위치에 대하여 이견이 분분한 섬피나무, 털피나무, 뽕잎피나무, 연밥피나무간의 유연관계를 알아보고자 하였으며 함경도에 자생하는 웅기피나무와 개염주나무를 제외한 한국과 일본의 피나무속 10종을 대상으로 nrDNA-ITS, rpl32-trnL 및 trnL-F 염기서열에 근거하여 피나무속의 분류학적 특성과 분류군간 근연관계를 살펴보고자 하였다.
본 연구는 nrDNA의 ITS region과 cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL region 염기서열을 분석하여 한국산 피나무속(Tilia)식물의 계통학적 유연관계를 파악하고자 하였다. 섬피나무는 피나무와 다른 분계조를 형성하며, 일본피나무와 좀 더 가까운 유연관계에 있음을 확인할 수 있었다.
본 연구는 피나무속의 종간 계통학적 유연관계를 규명하고자 하였다. 계통학적 분석은 한국과 일본의 피나무속 10종, outgroup으로 멕시코목화를 선정하여 수행하였다.
제안 방법
06로 구하였다. ITS region 과 trnL-F, rpl32-trnL의 combined data로서의 적합성을 판단하기 위하여 ILD (Inconrruence Length Difference) test를 수행하였다.
계통학적 분석은 한국과 일본의 피나무속 10종, outgroup으로 멕시코목화를 선정하여 수행하였다. nrDNA의 ITS와 cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL의 염기서열을 확보하여 분석하였다. ITS, trnL-F 와 rpl32-trnL의 data를 유합한 결과 계통수는 6개의 분계조로 구성되었다.
amurensis subsp. taquetii의 이명으로 처리하였다. 하지만 실험결과 연밥피나무는 독립적인 분계조를 형성하였으며, 피나무보다 섬피나무, 일본피나무와 근연관계를 보여주었다.
, 2005) 이용하여 증폭하고 분석하였다(Table 1). 각 region의 증폭을 위한 PCR 반응용액의 조성은 주형 DNA 20−50 ng, 10× Diastar™Taq DNA Buffer 2.5 μL, 10 mM의 dNTPs 0.5 μL, 10 pmol의 primer를 각각 1 μL, 2.5 unit의 Diastar™Taq DNA Polymerase 0.13 μL (SolGent Co., Korea)를 첨가 후 마지막으로 전체 부피가 25 μl가 되도록 하였다(Table 2). DNA증폭을 위한 PCR반응은 다음과 같이 수행하였다.
본 연구는 피나무속의 종간 계통학적 유연관계를 규명하고자 하였다. 계통학적 분석은 한국과 일본의 피나무속 10종, outgroup으로 멕시코목화를 선정하여 수행하였다. nrDNA의 ITS와 cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL의 염기서열을 확보하여 분석하였다.
, 1991)를 이용하였다(Table 1). 또한 rpl32-trnL의 partial region을 primer 400F와 trnL-R (modified from Shaw et al., 2005) 이용하여 증폭하고 분석하였다(Table 1). 각 region의 증폭을 위한 PCR 반응용액의 조성은 주형 DNA 20−50 ng, 10× Diastar™Taq DNA Buffer 2.
MP분석은 heurestic search를 이용하였으며, option으로 1000회 random addition sequence와 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였다. 또한 각 분계도의 신뢰도를 구하기 위하여 무작위로 1000회 반복하여 bootstrap value (Felsenstain, 1985)를 구하였으며, Consistency Index (CI: Kluge and Farris, 1969)와 Retention Index (RI: Farris, 1989)는 MEGA 6.06로 구하였다. ITS region 과 trnL-F, rpl32-trnL의 combined data로서의 적합성을 판단하기 위하여 ILD (Inconrruence Length Difference) test를 수행하였다.
염기서열 및 분자계통학적 분석 증폭된 산물의 염기서열은 forward와 reverse방향으로 각각 해독하고 이들 단편들의 염기서열은 Genious pro ver. 6.1.8로 조합하였으며, ClustalW을 이용하여 정렬하였다. 정렬결과 발생한 gape 결여형질(missing character)로 처리 하여 모든 형질에 같은 가중치를 부여하였다.
8로 조합하였으며, ClustalW을 이용하여 정렬하였다. 정렬결과 발생한 gape 결여형질(missing character)로 처리 하여 모든 형질에 같은 가중치를 부여하였다. 염기서열 간의 유전적 거리(Kimura’s 2 parameter방법) 계산과 Maximum parsimony (MP), Maximum-likelihood (ML) 분석은 MEGA 6.
일본에 자생하는 구주피나무 개체는 96%의 bootstrap values로 독립된 분계조를 형성하여 한국에 식재되고 있는 개체와 차이를 보여주었다(data not shown). 찰피나무, 보리자나무, 염주나무가 한 분계조를 구성하였으며, 그 피나무, 뽕잎피나무, 털피나무가 75% bootstrap values로 섬피나무, 일본피나무, 연밥피나무는 82% bootstrap values로 각 분계조를 형성하였다(data not shown). cpDNA marker인 trnL-F의 MP tree 에서는 구주피나무와 연밥피나무 두 종만이 독립된 분계조를 형성하였으며, rpl32-trnL의 MP tree 에서는 구주피나무, 연밥피나무, 일본피나무가 단계통군을 형성하였다(data not shown).
방법으로 total DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 1.2% agarose gel 상에서 전기영동 후, EtBr 염색법으로 UV 조명 아래서 형광 밝기를 상대 비교하고 흡광도를 측정하여 농도를 확인하였다. ITS region의 증폭은 primer ITS4와 ITS5(White et al.
대상 데이터
) Simonk.)를 포함하여 피나무속 총 10종 26개체를 사용하였다. outgroup으로는 근연관계멕시코목화(Gossypium hirsutum L.
2% agarose gel 상에서 전기영동 후, EtBr 염색법으로 UV 조명 아래서 형광 밝기를 상대 비교하고 흡광도를 측정하여 농도를 확인하였다. ITS region의 증폭은 primer ITS4와 ITS5(White et al., 1990)를 이용하였으며, trnL-F region의 증폭은 primer C와 primer F (Taberlet et al., 1991)를 이용하였다(Table 1). 또한 rpl32-trnL의 partial region을 primer 400F와 trnL-R (modified from Shaw et al.
)를 포함하여 피나무속 총 10종 26개체를 사용하였다. outgroup으로는 근연관계멕시코목화(Gossypium hirsutum L.)의 GenBank 자료를 사용하였다(Table 1).
본 연구에 사용된 nrDNA의 ITS region, cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL, ITS와 rpl32-trnL 염기서열을 유합한 data (Combined Ⅰ), ITS, trnL-F와 rpl32-trnL을 유합한 data (Combined Ⅱ) 각각의 parsimony informative character를 Table 4에 정리하여 나타내었다. Total length는 Combined Ⅰ에서는 1510-1515 bp, Combined Ⅱ는 2466-2486 bp로 나타났다.
직접 채집한 식물체는 영남대학교 식물표본관에 확증표본으로 보관하였으며, 국립수목원(KH), 강원대학교 식물표본관(KWNH)의 건조표본을 포함해 한국산 피나무 9종을 사용하였다. 그리고 일본 홋카이도대학교 식물표본관(SAP)의 구주피나무, 일본피나무(T.
데이터처리
정렬결과 발생한 gape 결여형질(missing character)로 처리 하여 모든 형질에 같은 가중치를 부여하였다. 염기서열 간의 유전적 거리(Kimura’s 2 parameter방법) 계산과 Maximum parsimony (MP), Maximum-likelihood (ML) 분석은 MEGA 6.06을 이용하여 수행하였다. ML분석은 Modeltest ver 3.
이론/모형
06을 이용하여 수행하였다. ML분석은 Modeltest ver 3.7 (Posada and Crandall, 1998)을 이용하여 적정모델을 선정하였으며, hLRTs의 기준을 적용하였다. MP분석은 heurestic search를 이용하였으며, option으로 1000회 random addition sequence와 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였다.
7 (Posada and Crandall, 1998)을 이용하여 적정모델을 선정하였으며, hLRTs의 기준을 적용하였다. MP분석은 heurestic search를 이용하였으며, option으로 1000회 random addition sequence와 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였다. 또한 각 분계도의 신뢰도를 구하기 위하여 무작위로 1000회 반복하여 bootstrap value (Felsenstain, 1985)를 구하였으며, Consistency Index (CI: Kluge and Farris, 1969)와 Retention Index (RI: Farris, 1989)는 MEGA 6.
자생지에서 직접 채집한 생체 및 표본관에 수장 중인 건조표본에서 채취한 시료를 Precellys®24 Homogeniser (Bertin Technologies, France)를 이용하여 파쇄시킨 후, Dolye and Doyle (1987)의 CTAB 방법을 수정한 Loockerman and Jansen(1996)의 방법으로 total DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 1.
성능/효과
ITS와 rpl32-trnL을 유합한 data (Combined Ⅰ)의 CI 및 RI값은 각각 1로 나타났다. ITS와 trnL-F, 그리고 rpl32-trnL을 유합한 data (Combined Ⅱ)의 CI 및 RI값은 각각 0.80과 0.92로 나타났다(Table 4).
1%로 나타났다. nrDNA의 ITS region, cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL을 유합한 Combined data의 정렬된 염기서열에 관하여 Kimura’s 2 Parameter method (Kimura, 1980)를 이용한 종간 유전적 거리(Pairwise Distance)를 계산한 결과 구주피나무와 연밥피나무에서 0.011 로 가장 높게 나타났다(Table 3).
trnL-F region의 염기서열은 954-976 bp로 나타났으며, 구주피나무가 976 bp로 가장 길었다. trnL-F region의 G+C 함량은 28.4-29.0%로 나타났으며, G+C 함량이 가장 높은 분류군은 T. kiusiana 확인되었다. rpl32-trnL region의 염기서열은 823-825 bp로 나타났으며, G+C 함량은 24.
이러한 형질은 종을 구분하기에 다소 모호하여 Liou(1955)는 뽕잎피나무를 피나무의 잡종으로 주장하였으며, Pigott 2008)은 뽕잎피나무와 털피나무를 피나무의 아종으로 처리하는 등 세 종의 분류학적 한계가 불분명하다. 본 연구에서 피나무는 형태적으로 잎의 크기와 화서에 달리는 꽃의 수, 엽병의 단모의 유무에 있어서 연속적인 변이가 있었으며, 염기서열 분석결과 피나무는 뽕잎피나무와 털피나무와 유집되어 세 분류군의 유연관계는 가까운 것으로 판단된다(Fig. 1). 이러한 결과는 뽕잎피나무와 털피나무가 고도와 지리적 차이에 의한 피나무의 아종일 가능성이 크다는 Pigott (2012)주장을 지지 하였다.
분류군간 ITS region의 maximum-parsimony tree 에서 구주피나무는 단계통군을 형성하였으며, outgroup과 유연관계가 가장 가깝게 나타났다. 일본에 자생하는 구주피나무 개체는 96%의 bootstrap values로 독립된 분계조를 형성하여 한국에 식재되고 있는 개체와 차이를 보여주었다(data not shown).
섬피나무는 피나무와 다른 분계조를 형성하며, 일본피나무와 좀 더 가까운 유연관계에 있음을 확인할 수 있었다. 피나무와 비교하여 열매에 결각이 발달하고, 원형의 피목을 갖는 연밥피나무는 독립적인 분계조를 형성하여 피나무와 차이를 확인할 수 있었다.
식물체 전체에 높은 밀도의 성모의 특징을 가진 Astrophilyra절에 속하는 보리자나무, 찰피나무, 염주나무는 형태적으로 헛수술과 수술의 길이 차이, 열매능각으로 구분하지만 염기서열분석결과 비 단계통군으로 하나의 분계조를 구성하였다. 세 종이 독립된 종인지 판단할 수 없었으나 서로 가까운 근연관계에 있음을 확인하였다(Fig. 1). 본 계통학적 연구결과 섬피나무, 일본피나무, 연밥피나무, 피나무, 구주피나무가 단계통군을 형성하였으며 털피나무, 뽕잎피나무, 보리자나무, 찰피나무, 염주나무의 경우 독립된 분계조를 나타내지 않아 이들의 분류학적 실체에 대해서는 다른 marker를 이용한 추가적인 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.
엽신의 폭이 매우 좁은 난형의 형태를 가진 구주피나무을 제외한 나머지 6종은 외부형태학적으로 종을 구분하는 유용한 형질을 찾는데 어려움이 많다. 실험 결과 염기서열 및 염기조성은 속내에서 큰 차이점이 나타나지 않았다.
G+C 함량은 Table 3에서 나타내었다. 피나무속 ITS region의 염기서열은 687-691 bp로 나타났으며, 섬피나무, 연밥피나무, 일본피나무가 691 bp로 가장 길게 나타났으며 피나무, 뽕잎피나무, 털피나무, 구주피나무가 687 bp로 가장 짧았다. DNA 구조에 영향을 미치는 G+C 함량은 55.
섬피나무는 피나무와 다른 분계조를 형성하며, 일본피나무와 좀 더 가까운 유연관계에 있음을 확인할 수 있었다. 피나무와 비교하여 열매에 결각이 발달하고, 원형의 피목을 갖는 연밥피나무는 독립적인 분계조를 형성하여 피나무와 차이를 확인할 수 있었다.
taquetii의 이명으로 처리하였다. 하지만 실험결과 연밥피나무는 독립적인 분계조를 형성하였으며, 피나무보다 섬피나무, 일본피나무와 근연관계를 보여주었다. 또한 형태형질 중 열매모양 뿐만 아니라 원형의 피목을 갖는 특징으로 피나무와 차이가 있었다.
후속연구
1). 본 계통학적 연구결과 섬피나무, 일본피나무, 연밥피나무, 피나무, 구주피나무가 단계통군을 형성하였으며 털피나무, 뽕잎피나무, 보리자나무, 찰피나무, 염주나무의 경우 독립된 분계조를 나타내지 않아 이들의 분류학적 실체에 대해서는 다른 marker를 이용한 추가적인 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.
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