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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 분자계통학적으로 nuclear ribosomal DNA와 chloroplast DNA의 염기서열에 근거하여 1) 산수국, 탐 라산수국, 꽃산수국과 소백산에서 발견된 산수국의 연속적인 변이개체들 사이의 계통학적 유연관계를 규명하고자 하였고 2) 산수국과 수국의 분류학적 위치의 모호함을 해결하고자 하였다. 3) 더 나아가 한국산 수국속의 종간 계통분류학적 유연관계 및 종의 한계를 파악하고자 함에 그 목적이 있다.
- 따라서, 본 연구는 분자계통학적으로 nuclear ribosomal DNA와 chloroplast DNA의 염기서열에 근거하여 1) 산수국, 탐 라산수국, 꽃산수국과 소백산에서 발견된 산수국의 연속적인 변이개체들 사이의 계통학적 유연관계를 규명하고자 하였고 2) 산수국과 수국의 분류학적 위치의 모호함을 해결하고자 하였다. 3) 더 나아가 한국산 수국속의 종간 계통분류학적 유연관계 및 종의 한계를 파악하고자 함에 그 목적이 있다.
- 본 논문에서는 한국산 수국속에 속하는 7 분류군과 일본의 2 분류군에 대해서 nrDNA ITS지역과 cpDNA의 non-coding region psbA-trnH, trnL-F와 coding region matK의 염기서 열을 이용한 분자계통학적 연구를 수행하여 종의 한계설정 및 유연관계를 확인하고자 하였다.
- 본 연구는 ITS region과 3개의 엽록체 DNA region을 활용하여 한국산 수국속 7 분류군에 대한 계통학적 유연관계를 규명하 고자 수행되었다. 계통학적 분석 결과 한국산 수국속의 7분류군 은 단계통군을 형성하였으며, Macrophyllae 아절은 산수국과 수국의 두 개의 분계조로 나뉘었다.
제안 방법
- , 2011)을 이용하였다. ITS, psbA-trnH, matK 지역의 PCR (Polymerase Chain reaction) 반응 용액의 조성은 주형 DNA 20~50 ng, 10X Diastar™Taq DNA buffer 2.5 ㎕, 10 mM의 dNTPs mix 0.5 ㎕, 10 pmol의 primer 각각 1 ㎕, 2.5 unit의 Diastar™ Taq DNA Polymerase 0.13 ㎕ (SolGent Co., Korea)를 첨가 후 total volume이 총 25 ㎕가 되도록 멸균된 증류수를 조절하여 첨가하였다. trnL-F 지역의 경우 앞서말한 조성의 2배를 사용하여 전체부피가 총 50 ㎕가 되도록 하였다.
- cpDNA의 경우 annealing 온도를 psbA-trnH 56℃, trnL-F 54℃, matK45℃에서 40초, 72℃에서 1분 extension으 로 구성된 반응을 35회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 10분간 extension 하였다. PCR 반응용액은 Gel & PCR purification system kit (Solgent Co., Korea)로 정제한 후 염기서열 분석은 automatic DNA analyzer system ABI PRISM 3730xl analyzer (Solgent co., Korea)를 이용하였다.
- , Korea)를 첨가 후 total volume이 총 25 ㎕가 되도록 멸균된 증류수를 조절하여 첨가하였다. trnL-F 지역의 경우 앞서말한 조성의 2배를 사용하여 전체부피가 총 50 ㎕가 되도록 하였다. 조제된 반응용액은 ITS 경우 94℃에서 5분 동안 최초 denaturation 이후, 95℃에서 40초 denaturation, 60℃에서 40초 annealing, 72℃에서 1분 extension으로 구성된 반응을 35회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 10분간 extension 하였다.
- 먼저 Macrophyllae 아절에 속하는 산수국은 중성화 형태에 따라 거치를 지니는 개체를 꽃산수국, 암술과 수술이 나타나는 종을 탐라산수국으로 구별하였으나 3 분류군 사이에서 연속적 인 변이가 발견되어, 본 실험에서는 이 두 가지 형질을 모두 지 니는 소백산의 개체를 포함하여 진행하였다. combined ML data의 분자적 분석결과, 3 분류군 모두가 85% bootstrap value 로 하나의 분계조를 이루고 있었다.
- , 2014). 본 실험에서는 중성화에 거치를 지니는 개체와 그렇지 않은 개체 들을 구분짓고 type을 선정하여 실험을 수행하였다. 일본개체 의 경우 모두 중성화에 거치를 지니고 있었다.
- 염기서열 4개의 지역에 대한 분류군간 combined maximum- likelihood tree를 얻었으며, bootstrap value의 경우 값이 50%이상인 분계조(clade)에 한하여 계통수에 표시하였다. ML 분석 결과 외군을 제외한 5개의 분계조를 이루었다(Fig.
- , 1994)로 정렬하였다. 최종 세부적인 정렬 은 수작업을 통하여 정렬하였으며, 정렬 결과 발생한 gape 결 여형질(missing character)로 처리하여 모든 형질에 동일한 가 중치를 부여하였다. 염기서열 간의 유전적 거리(Kimura’s 2 parameter 방법; Kimura, 1980)계산과 parsimony analysis, maximum-likelihood는 MEGA6 (Tamura et al.
- 표본관에 소장된 석엽표본 에서 절취한 재료 경우에는 PrecellysⓇ24 Homogeniser (Bertin Technologies, France)를 이용하여 분쇄시킨 후, Doyle and Doyle (1987)의 CTAB 방법을 수정한 Loockerman and Jansen (1996)의 방법으로 추출하였다. 추출된 DNA는 1.2% agarose gel 상에서 전기영동 후, EtBr 염색법으로 UV 조명 아래서 형광 밝기를 상대 비교하고 흡광도를 측정하여 농도를 확인하였다. ITS 지역의 증폭은 프라이머 ITS4, ITS5 (White et al.
대상 데이터
- 2% agarose gel 상에서 전기영동 후, EtBr 염색법으로 UV 조명 아래서 형광 밝기를 상대 비교하고 흡광도를 측정하여 농도를 확인하였다. ITS 지역의 증폭은 프라이머 ITS4, ITS5 (White et al., 1990)를 이용하였으며, psbA-trnH IGS 지역의 증폭은 프라이머 psbAF- trnHR (Sang et al., 1997), trnL-F 지역의 증폭은 프라이며 trn-c, trn-f (Taberlet et al., 1991), matK 지역의 증폭은 프라 이머 matK472F, matK1248R (Yu et al., 2011)을 이용하였다. ITS, psbA-trnH, matK 지역의 PCR (Polymerase Chain reaction) 반응 용액의 조성은 주형 DNA 20~50 ng, 10X Diastar™Taq DNA buffer 2.
- acuminata로 변경 하 였고, 산수국의 중성화인 꽃받침잎의 형질에 따라 H. serrata f. fertilis (탐라산수국)와 H. buergeri (꽃산수국)로 기재하였다. 또한, 등수국을 잎의 형질에 따라 구분지어 각각 H.
- 채집된 재료는 석엽표본으로 제작하여 영남대학교 식물표본관(YNUH)에 확증표본으로 보관하였다. 그 외에도 국립수목원 산림생물표본관(KH), 훗카이도대학교 (SPA)에 소장된 건조표본들을 연구재료로 이용하였으며, 기록 된 출처를 근거로 연구를 수행하였다. 본 연구에서 사용된 재료 는 총 7 분류군으로 outgroup으로는 수국과의 선행 연구에서 유 연관계가 가장 가깝다고 판단된 고광나무(Philadelphus schrenkii), 말발도리(Deutzia parviflora)를 선정하였다(Xiang et al.
- 그 외에도 국립수목원 산림생물표본관(KH), 훗카이도대학교 (SPA)에 소장된 건조표본들을 연구재료로 이용하였으며, 기록 된 출처를 근거로 연구를 수행하였다. 본 연구에서 사용된 재료 는 총 7 분류군으로 outgroup으로는 수국과의 선행 연구에서 유 연관계가 가장 가깝다고 판단된 고광나무(Philadelphus schrenkii), 말발도리(Deutzia parviflora)를 선정하였다(Xiang et al., 2011). 연구에 사용된 분류군 및 채집지 정보는 Table 2와 같다.
- 본 연구에서 사용된 재료는 2014년 6월부터 2015년 8월에 걸쳐 제주도의 한라산, 울릉도의 성인봉, 경상남도 지리산, 경상 북도 팔공산, 충청북도 소백산, 일본의 삿포르 등의 자생지에서 채집하여 사용하였다. 채집된 재료는 석엽표본으로 제작하여 영남대학교 식물표본관(YNUH)에 확증표본으로 보관하였다.
- 본 연구에서 사용된 재료는 2014년 6월부터 2015년 8월에 걸쳐 제주도의 한라산, 울릉도의 성인봉, 경상남도 지리산, 경상 북도 팔공산, 충청북도 소백산, 일본의 삿포르 등의 자생지에서 채집하여 사용하였다. 채집된 재료는 석엽표본으로 제작하여 영남대학교 식물표본관(YNUH)에 확증표본으로 보관하였다. 그 외에도 국립수목원 산림생물표본관(KH), 훗카이도대학교 (SPA)에 소장된 건조표본들을 연구재료로 이용하였으며, 기록 된 출처를 근거로 연구를 수행하였다.
데이터처리
- 또한 각 분계도의 신뢰도를 알아보기 위하여 bootstrap value (Felsenstain, 1985)를 이용하였으며, Consistency Index (CI; kluge and Farris, 1969), Retention Index (RI; Farris, 1989)는 MEGA에서 수행하였다. nrDNA (ITS region)와 cpDNA (psbA-trnH, trnL-F, matK region)의 ILD test는 PAUP ver. 4.0b (Swofford., 2003)을 사용하여 수행하였다.
-
염기서열 정렬 및 계통분석
계통학적 분석으로 얻어진 각 염기서열들은 Geneious pro ver. 6.1.8 (Drummond et al., 2011)로 조합하였으며, Clustal W (Thompson et al., 1994)로 정렬하였다. 최종 세부적인 정렬 은 수작업을 통하여 정렬하였으며, 정렬 결과 발생한 gape 결 여형질(missing character)로 처리하여 모든 형질에 동일한 가 중치를 부여하였다.
이론/모형
- 냉동 보관된 재료를 액체질소를 이용하여 분쇄시킨 후 Dolye and Doyle (1987)의 CTAB 방법을 수정한 Saghai-Maroof et al.(1984)의 방법에 따라 추출하였다. 표본관에 소장된 석엽표본 에서 절취한 재료 경우에는 PrecellysⓇ24 Homogeniser (Bertin Technologies, France)를 이용하여 분쇄시킨 후, Doyle and Doyle (1987)의 CTAB 방법을 수정한 Loockerman and Jansen (1996)의 방법으로 추출하였다.
- Parsimony analysis는 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였으며 maximum-likelihood는 GTR (General Time Reversible) model을 적용하였다. Bayesian 분석은 MrBayes v.3.2.1 (Ronquist et al., 2012)을 이용하여 실시하였다. 또한 각 분계도의 신뢰도를 알아보기 위하여 bootstrap value (Felsenstain, 1985)를 이용하였으며, Consistency Index (CI; kluge and Farris, 1969), Retention Index (RI; Farris, 1989)는 MEGA에서 수행하였다.
- , 2013)를 이용하여 분석하였다. Parsimony analysis는 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였으며 maximum-likelihood는 GTR (General Time Reversible) model을 적용하였다. Bayesian 분석은 MrBayes v.
- , 2012)을 이용하여 실시하였다. 또한 각 분계도의 신뢰도를 알아보기 위하여 bootstrap value (Felsenstain, 1985)를 이용하였으며, Consistency Index (CI; kluge and Farris, 1969), Retention Index (RI; Farris, 1989)는 MEGA에서 수행하였다. nrDNA (ITS region)와 cpDNA (psbA-trnH, trnL-F, matK region)의 ILD test는 PAUP ver.
- 최종 세부적인 정렬 은 수작업을 통하여 정렬하였으며, 정렬 결과 발생한 gape 결 여형질(missing character)로 처리하여 모든 형질에 동일한 가 중치를 부여하였다. 염기서열 간의 유전적 거리(Kimura’s 2 parameter 방법; Kimura, 1980)계산과 parsimony analysis, maximum-likelihood는 MEGA6 (Tamura et al., 2013)를 이용하여 분석하였다. Parsimony analysis는 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였으며 maximum-likelihood는 GTR (General Time Reversible) model을 적용하였다.
- (1984)의 방법에 따라 추출하였다. 표본관에 소장된 석엽표본 에서 절취한 재료 경우에는 PrecellysⓇ24 Homogeniser (Bertin Technologies, France)를 이용하여 분쇄시킨 후, Doyle and Doyle (1987)의 CTAB 방법을 수정한 Loockerman and Jansen (1996)의 방법으로 추출하였다. 추출된 DNA는 1.
성능/효과
- 9%로 가장 높은 염기변이를 보였다. 4개의 지역을 합하여 염기변이를 산출한 결과는 outgroup을 포함해서는 0-10%로 나타났고, outgroup을 제외한 속 내에서의 변이는 0-4.1%로 비교적 낮게 나타났다(Table 3). DNA의 구조 및 물리적 특성을 결 정하는 G+C 함량의 빈도는 4개의 유전자 지역을 합하여 산출한 결과 등수국이 38%로 가장 높았으며, 수국과 성널수국이 37.
- 1% 로 가장 낮게 나타났다. Combined된 전체적인 염기서열의 길이 변이는 크게 나타나지 않았으며 등수국이 2, 614 bp로 가장 길게 나타났으며 성널수국과 수국이 2, 608 bp로 가장 짧게 나타났다. nrDNA (ITS region)와 cpDNA (matK, trnL-F, psbA-trnH region)의 적합성을 알아보기 위한 ILD test의 P value 값은 0.
- 1%로 비교적 낮게 나타났다(Table 3). DNA의 구조 및 물리적 특성을 결 정하는 G+C 함량의 빈도는 4개의 유전자 지역을 합하여 산출한 결과 등수국이 38%로 가장 높았으며, 수국과 성널수국이 37.1% 로 가장 낮게 나타났다. Combined된 전체적인 염기서열의 길이 변이는 크게 나타나지 않았으며 등수국이 2, 614 bp로 가장 길게 나타났으며 성널수국과 수국이 2, 608 bp로 가장 짧게 나타났다.
- Petalanthe 아절에 속하는 성널수 국(HY14-16)은 99%의 BS로 높은 지지를 받으며 하나의 분계조 를 형성하였으며 수국, 산수국과 가까운 유연관계를 보였다. Heteromallae 아절에 속하는 나무수국(HY1-3, HYJ1-3)은 식 재되는 분류군으로써 일본개체들과 하나의 분류군으로 유집되어 독립적인 분계조를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. Calyptranthae 아절에 속하는 등수국(HY4-10, HYJ4-6)은 하나의 독립적인 분계조를 형성하였으나 2개의 소분계조를 이루 었다.
- 1). MP 분석결과 CI, RI 값은 각각 0.90, 0.96으로 나타났으며, Bayesian 분석과 함께 ML 분석과 유사한 패턴을 보였다(Fig. 2, 3). 계통수 제작에 가장 유용하다고 판단된 ITS 지역을 NCBI 자료와 함께 ML 분석을 시행한 결과 Macrophyllae, Petalanthe, Americanae, Heteromallae, Asperae, Calyptranthae 아절이 독립적인 분계조를 형성하였으며, 단계통군을 이루는 것을 확인할 수 있었다.
- combined ML data의 분자적 분석결과, 3 분류군 모두가 85% bootstrap value 로 하나의 분계조를 이루고 있었다. combined MP tree의 분자 적 분석결과, 한 개체의 산수국을 제외하고는 57% BS로 하나의 분계조로 유집되는 양상을 보였다. Bayesian 분석 또한 하나의 분계조를 이루었으며, 이는 산수국과 탐라산수국, 꽃산수국 3 분류군이 매우 가까운 유연관계를 이루고 있음을 시사하고 있다.
- 2, 3). 계통수 제작에 가장 유용하다고 판단된 ITS 지역을 NCBI 자료와 함께 ML 분석을 시행한 결과 Macrophyllae, Petalanthe, Americanae, Heteromallae, Asperae, Calyptranthae 아절이 독립적인 분계조를 형성하였으며, 단계통군을 이루는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 한국산 수국속 식물들은 combined data 분석과 유사한 패턴을 보였다(Fig.
- 본 연구는 ITS region과 3개의 엽록체 DNA region을 활용하여 한국산 수국속 7 분류군에 대한 계통학적 유연관계를 규명하 고자 수행되었다. 계통학적 분석 결과 한국산 수국속의 7분류군 은 단계통군을 형성하였으며, Macrophyllae 아절은 산수국과 수국의 두 개의 분계조로 나뉘었다. 산수국의 분계조는 꽃산수 국과 탐라산수국이 유집되어 하나의 단계통군을 형성하였으며, 염기서열상으로도 뚜렷한 차이가 나타나지 않았다.
- 지금까지는 이 3 분류군을 품종으로 각각 분리하고 있지만 꽃받침잎의 형태로는 종의 실체를 명확히 구분하기 힘들며, 분 자적 결과 역시 염기서열상으로도 큰 차이가 나타나지 않아 생 육환경의 차이로 일어나는 변이일 가능성이 크다. 따라서, 분자 계통학적인 결과로 보았을 때 이들은 하나의 분류군으로 보는 것이 타당하다고 판단된다.
- 등수국은 엽저의 형태에 따라 심장저인 개체와 원저인 개체를 구분하기도 하였 지만 현재는 하나의 분류군으로 처리하고 있으며(Chun, 1954; Krussman, 1978; Ohwi, 1978; Shin, 1989) 본 실험의 개체들 또한 한 개체 내에서 심장저와 원저인 형태를 모두 지니는 개체 들을 확인할 수 있었다. 또한 오동정을 확인하기 위하여 분류학 적 위치로 같은 아절에 속하는 H. anomala와 등수국을 비교하 였지만 수술 수와 잎의 거치 등에 차이를 보였으며, ITS ML tree 에서 각각 80%와 82%의 bootstrap value로 독립적인 분계조를 이루는 것을 확인 하였다. 따라서, 이러한 등수국의 소분계조에 대한 추가적인 연구는 지리학적 연구와 함께 다양한 개체수와 분자마커를 포함한 집단분석이 필요할 것으로 판단된다.
- 성널수국은 엽신의 길이와 폭, 엽병의 길이, 양성화의 꽃잎 등이 수국속 내 다른 분류군과 뚜렷 하게 구별되는 특징을 지닌다. 또한, 나무수국의 경우 다른 수 국속 식물들과 달리 원추화서를 지니며 엽서의 형태는 2~3개씩 윤생하는 특징을 지니고 있어 독립된 분류군으로써의 분류계급 을 지지하는 결과를 보였다.
- 또한, 산수국은 분류학적으로 수국의 아종으로 보는 견해 (Makino, 1929; Hara, 1955; McClintock, 1957)와 두 분류군을 가까운 유연관계를 가지는 독립된 분류군으로 보는 견해 (Wilson, 1923; Nakai, 1926; Krussman, 1978)로 분류학적 위 치의 모호함을 가지고 있다. 본 실험 결과, combined ML tree에 서는 Macrophyllae 아절에 속하는 수국과 산수국이 98%와 85%, ITS ML tree에서는 99%와 88%의 bootstrap value로 각각 하나의 독립된 분계조를 형성하였으며, Bayesian 분석에서도 수국과 산수국이 독립적인 분계조를 형성하여 Wilson (1923), Nakai (1926), Krussman (1978)의 견해를 지지하였다. 수국의 경우 잎이 거의 무모이며 비후화 되어있고, 엽두의 형태가 뭉툭 하거나 예두의 형태를 지니지만, 산수국의 경우 잎이 막질로 되어 있으며, 잎 가장자리와 상하면의 맥을 중심으로 털이 밀생하는 특징을 지닌다.
- ITS의 경우 619 bp 중 429 bp는 염기서열 변화가 없었고 나머지 190 bp는 변화가 있었으 며, 4개의 유전자 지역 중 가장 많은 염기(121 bp)가 계통수를 그리는데 유용하게 사용되었다. 분류군간의 염기변이를 Kimura’s two parameter distance로 계산하여 백분율로 환산한 결과 외 군을 포함한 자료에서는 ITS 지역의 등수국-말발도리가 22.4% 로 가장 높았으며 psbA-trnH 지역에서는 수국-말발도리가 18.1%, trnL-F, matK 지역에서는 산수국-말발도리가 각각 6.8%, 5.9%로 가장 높은 염기변이를 보였다. 4개의 지역을 합하여 염기변이를 산출한 결과는 outgroup을 포함해서는 0-10%로 나타났고, outgroup을 제외한 속 내에서의 변이는 0-4.
- Calyptranthae 아절에 속하는 등수국(HY4-10, HYJ4-6)은 하나의 독립적인 분계조를 형성하였으나 2개의 소분계조를 이루 었다. 소분계조는 제주도 한라산 집단의한 개체(HY08)를 제외한 제주도 집단과 일본, 울릉도 집단으로 나뉘는 것을 확인할 수있었다(Fig. 1). MP 분석결과 CI, RI 값은 각각 0.
- 엽두의 형태도 수국과 달리 점첨두의 형태를 지닌다. 이와 같은 외부형태학적 형질과 Zonneveld (2004)가 주장한 수국과 산수국의 DNA 함량의 차이, 본 논문의 분자적 분석결과를 통해 두 분류군은 각각 독립된 분류군으로 처리하는 것이 타당하다고 판단된다.
- Combined data 의 분자적 결과 등수국은 독립된 분계조를 형성하였지만 중성 화 거치의 유무와는 관계없이 두 개의 소분계조를 이루었다. 지 역적으로는 제주도의 한라산 개체를 제외한 제주도 집단과 울 릉도, 일본 집단으로 나뉘는 것을 확인하였다. 등수국은 엽저의 형태에 따라 심장저인 개체와 원저인 개체를 구분하기도 하였 지만 현재는 하나의 분류군으로 처리하고 있으며(Chun, 1954; Krussman, 1978; Ohwi, 1978; Shin, 1989) 본 실험의 개체들 또한 한 개체 내에서 심장저와 원저인 형태를 모두 지니는 개체 들을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 수국속 분계조 내의 Petalanthe, Heteromallae, Calyptranthae 아절은 단계통군을 형성하였지만, Calyptranthae 아절에 속하는 등수국은 한라산 개체를 제외한 제주도 집단과 울릉도, 일본 집단으로 두 개의 소분계조를 이루었다. 등수국의 두 개의 소분계조에 대한 추가적인 연구는 더 많은 양의 채집과 지리학적인 연구가 추가 되어야 할 것으로 판단된다.
- anomala와 등수국을 비교하 였지만 수술 수와 잎의 거치 등에 차이를 보였으며, ITS ML tree 에서 각각 80%와 82%의 bootstrap value로 독립적인 분계조를 이루는 것을 확인 하였다. 따라서, 이러한 등수국의 소분계조에 대한 추가적인 연구는 지리학적 연구와 함께 다양한 개체수와 분자마커를 포함한 집단분석이 필요할 것으로 판단된다.
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