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문제 정의
- 이들 중 Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea eucalypti, Pantoea crpri-pedii등 일부 종들은 높은 인산분해 활성을 가지고 있는 것으로 보고되고 있고 아울러 식물생장 촉진 및 식물병 저항성 증진 등의 유익한 기능을 보이는 것으로 연구되고 있다 [4-6, 8, 31]. 따라서 본 연구에서 분리된 서로 다른 네 종류의 Pantoea 미생물들의 식물생장 촉진 활성에 대한 특성을 비교 분석하고자 하였다.
- 따라서, 본 연구는 농업적으로 유익한 다양한 식물생 장 촉진 미생물을 분리하고자, 토양으로부터 서로 다른 네 종류의 Pantoea 종들을 분리하여 그들의 식물생장 촉진 특성을 규명하였다. 분리된 모든 미생물들은 높은 무기인산 가용화, 인돌아세트산 및 지베렐린 생성 활성을 나타내었고, 어린 상추 (lettuce)의 생장을 촉진시키는 활성을 보였다.
- 이들 분리된 미생물들을 16S rDNA 염기서열 분석 방법으로 확인한 결과, Pseudomonas, Burkholderia, Bacillus, Pantoea속 미생물들로 확인되었다. 이들 중 서로 다른 네 종류의 Pantoea species를 각각 Pa1, Pc1, Pd1, Pv1으로 명명한 다음 무기인산염 분해 활성 등 식물생장 촉진능력을 규명하고자 하였다. 16S rDNA 염기서열을 이용하여 BLAST search 와 phylogenic tree 분석 방법에 의하여 미생물을 분석한 결과, Pa1는 Pantoea ananatis LMG2665와 99% 유사성, Pc1는 Pantoea citrea LMG22049와 99% 유사성, Pd1는 Pantoea dispersa LMG2603와 99% 유사성, Pv1는 Pantoea vagans LMG241999와 95% 유사성을 각각 보였다 (Fig.
제안 방법
- 75 M 염화수소(HCl) 8 ml을 첨가하여 10 ml 되게 한 후 10초간 혼합하여 실온에서 5분 정도 둔 다음 흡광 광도계로 254nm 흡광도를 측정하여 정량적으로 분석하였다 [11]. 모든 실험은 3회 반복 수행하였으며 정량적인 분석을 위하여 인돌아세트산(IAA)과 지베렐린(GA3) 표준용액을 이용하여 표준 곡선을 활용하여 정량적인 분석을 수행하였다.
- 미생물들의 인산분해 활성을 정량적으로 측정하고자 0.5% Ca3(PO4)2가 함유되어 있는 Pikovskaya 용액 배지에 균을 접종한 다음, 30℃ 배양기에서 1일, 2일, 3일 및 5일간 배양한 후 원심 분리한 다음 미생물 배양상 등액을 확보하여 molybde-num-blue 방법[21]을 이용하여 인산분해 활성을 조사하였고, 또한 pH 변화를 pH 미터기를 이용하여 정량적으로 분석하였다.
- 분리 확보된 네 종류의 Pantoea species (Pa1, Pc1, Pd1, Pv1) 의 무기인산분해능력을 확인하고자 각각 미생물을 LB 용액 배지에서 overnight 배양한 후 108 pfu/ml 농도의 균주를 각각 50 μl와 500 μl를 Ca3(PO4)2가 함유되어 있는 Pikovskaya agar 와 liquid 용액(10 ml)에 접종한 후 투명 환 생성 활성과 흡광도를 통한 정량적인 분석을 수행하였다 (Fig. 2). 고체 배지에서 모든 균주들은 매우 높은 무기인산 분해능력을 보이는 활성을 보였다 (Fig.
- 분리된 네 종류의 Pantoea 균주들이 인산분해 활성, 식물호르몬 인돌아세트산과 지베렐린 생성능력을 가지고 있으므로, 다른 식물 생장 촉진미생물들처럼 식물생장 촉진 활성을 검정하고자 어린 상추식물을 대상으로 균주 접종 후 식물의 생장 특성을 조사하였다 (Fig. 4). 처리된 네 종류의 미생물 모두 식물의 생장을 촉진시키는 활성으로 보였으며 생체량(fresh weight)의 분석 결과에 의하면 대조구의 경우 0.
- 5% 인산칼슘[Ca3(PO4)2]를 포함하는 Pikovskaya agar배지에 도 말하여 인산분해 활성을 보이는 균주를 분리하였다 [22]. 분리된 미생물로부터 genomic DNA 를 분리하여 16S rDNA 영역을 27F primer (5’-AGAGTTTGA TCCCTGGCTCAG-3’) 과 1492R primer (5’-GGTTACCTTGT TACGACTT-3’)을 이용하여 연쇄 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 확보하였다. 확보된 16S rDNA 연쇄 증폭 반응 산물을 Solgent 회사(Daejeon, Korea)에 염기서열분석을 의뢰하여 염기서열을 확보한 다음, BLAST analysis 와 NCBI database(http://www.
- 생육비 교 실험을 수행하였다. 분리된 미생물을 LB 배지에 30℃, 200 rpm 조건의 배양기에서 overnight 배양한 후, 6일간 생육시킨 상추가 존재하는 pot 당 균주 수를 108 pfu/ml 농도에 맞춰 각각 100 ml을 접종한 다음, 2주 후에 생체량 및 상층부생장길이를 측정하여 비교하였다. 모든 실험은 3 반복 이상 수행하여 평균값을 측정하였다.
- 분리된 미생물의 식물 생육 촉진능력을 측정하기 위하여, 상추 생육비 교 실험을 수행하였다. 분리된 미생물을 LB 배지에 30℃, 200 rpm 조건의 배양기에서 overnight 배양한 후, 6일간 생육시킨 상추가 존재하는 pot 당 균주 수를 108 pfu/ml 농도에 맞춰 각각 100 ml을 접종한 다음, 2주 후에 생체량 및 상층부생장길이를 측정하여 비교하였다.
- 인산분해 활성을 가진 미생물을 분리하고자 순천시 서면 지본리 소재 순천대학교 부속농장의 유기농 재배지 토양으로부터 시료를 채취하여 0.5% 인산칼슘[Ca3(PO4)2]를 포함하는 Pikovskaya agar배지에 도 말하여 인산분해 활성을 보이는 균주를 분리하였다 [22]. 분리된 미생물로부터 genomic DNA 를 분리하여 16S rDNA 영역을 27F primer (5’-AGAGTTTGA TCCCTGGCTCAG-3’) 과 1492R primer (5’-GGTTACCTTGT TACGACTT-3’)을 이용하여 연쇄 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 확보하였다.
- 지베렐린 생성 활성 측정은 배양액상 등액 1 ml과 에탄올 1 ml 그리고 3.75 M 염화수소(HCl) 8 ml을 첨가하여 10 ml 되게 한 후 10초간 혼합하여 실온에서 5분 정도 둔 다음 흡광 광도계로 254nm 흡광도를 측정하여 정량적으로 분석하였다 [11]. 모든 실험은 3회 반복 수행하였으며 정량적인 분석을 위하여 인돌아세트산(IAA)과 지베렐린(GA3) 표준용액을 이용하여 표준 곡선을 활용하여 정량적인 분석을 수행하였다.
- 분리된 미생물로부터 genomic DNA 를 분리하여 16S rDNA 영역을 27F primer (5’-AGAGTTTGA TCCCTGGCTCAG-3’) 과 1492R primer (5’-GGTTACCTTGT TACGACTT-3’)을 이용하여 연쇄 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 확보하였다. 확보된 16S rDNA 연쇄 증폭 반응 산물을 Solgent 회사(Daejeon, Korea)에 염기서열분석을 의뢰하여 염기서열을 확보한 다음, BLAST analysis 와 NCBI database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 이용하여 유사염기서열을 분석하였다. Phylogenic tree는 CLUSTAL X 프로그램을 이용하여 neighbor-joining 방법과 MEGA4 프로그램을 활용하여 분석하였다 [17, 28, 33].
대상 데이터
- 인산분해능력을 가진 미생물을 분리하고자 순천시 서면 지본리 소재 순천대학교 부속농장의 유기농 재배지 토양으로부터 채취한 시료를 0.5% Ca3(PO4)2가 함유되어 있는 Pikovskaya agar 배지에도말하여 3일 배양 후 투명환(clear zone)을 보이는 약 50여종의 미생물을 확보하였다. 이들 분리된 미생물들을 16S rDNA 염기서열 분석 방법으로 확인한 결과, Pseudomonas, Burkholderia, Bacillus, Pantoea속 미생물들로 확인되었다.
데이터처리
- of variance)에 적용하여 분석하였다. 다양한 처리 방법들 사이의 차이는 5%(p≤0.05) 확률 유의 수준에 해당하는 LSD (least significant differences test)를 사용하여 비교 하였다[32]. 모든 처리는 3회 반복 하였다.
- 모든 실험 data는 SAS package [29]를 이용한 ANOVA (analysis of variance)에 적용하여 분석하였다. 다양한 처리 방법들 사이의 차이는 5%(p≤0.
- 분리된 미생물을 LB 배지에 30℃, 200 rpm 조건의 배양기에서 overnight 배양한 후, 6일간 생육시킨 상추가 존재하는 pot 당 균주 수를 108 pfu/ml 농도에 맞춰 각각 100 ml을 접종한 다음, 2주 후에 생체량 및 상층부생장길이를 측정하여 비교하였다. 모든 실험은 3 반복 이상 수행하여 평균값을 측정하였다.
이론/모형
- gov/BLAST)를 이용하여 유사염기서열을 분석하였다. Phylogenic tree는 CLUSTAL X 프로그램을 이용하여 neighbor-joining 방법과 MEGA4 프로그램을 활용하여 분석하였다 [17, 28, 33].
- 측정하였다. 분리된 균주를 0.2% tryptophan을 함유하고있는 King's medium에 24시간 배양한 다음, 배양액 상등액과 Salkowski's reagent를 1:2(v/v)의 비율로 혼합한 다음, Gordon 과 Weber 방법[10]을 바탕으로 분홍색으로 발색 되는 정도를 흡광광도계 (UV-Visible Spectrophotometer, Shimadzu)를 이용하여 530 nm에서 흡광도로 측정하였다.
- 인 돌 아세트산 생성 활성은 Leveau 와 Lindow 방법[18]에 따라 측정하였다. 분리된 균주를 0.
성능/효과
- 이들 중 서로 다른 네 종류의 Pantoea species를 각각 Pa1, Pc1, Pd1, Pv1으로 명명한 다음 무기인산염 분해 활성 등 식물생장 촉진능력을 규명하고자 하였다. 16S rDNA 염기서열을 이용하여 BLAST search 와 phylogenic tree 분석 방법에 의하여 미생물을 분석한 결과, Pa1는 Pantoea ananatis LMG2665와 99% 유사성, Pc1는 Pantoea citrea LMG22049와 99% 유사성, Pd1는 Pantoea dispersa LMG2603와 99% 유사성, Pv1는 Pantoea vagans LMG241999와 95% 유사성을 각각 보였다 (Fig. 1).
- 5값을 보였다. 따라서 미생물의 인산분해 활성은 pH 가 가장 낮은 1일차에 가장 높은 활성을 보이다가 pH가 점차 증가함에 따라 분해 활성이 낮아지는 결과를 보이는 것으로 인산 분해 활성은 pH 감소와 상당한 연관성이 있는 것으로 나타났다.
- 특히 대부분의 인산분해 미생물과 식물생장 촉진미생물은 일반적으로 인돌 아세트산과 지베렐린 호르몬 생성하며 궁극적으로 식물 생장을 촉진하는 기능을 가지는 것으로 알려져 있다 [1, 3, 14,18-19, 31]. 따라서 본 연구에서 분리된 네 종류의 인산분해 미생물인 Pantoea species의 경우에도 인산분해 능력뿐만 아니라 인돌아세트산과 지베렐린 같은 식물생장호르몬을 생성함으로써 잠재적으로 식물생장 촉진 활성을 가지는 것으로 생각된다.
- 있다. 따라서 본 연구에서 분리된 인산분해 미생물의 인돌 아세트산과 지베렐린 생성 활성을 측정한 결과 대부분의 미생물의 경우 매우 높은 인돌아세트산과 지베렐린 생성 활성을 보였다(Fig. 3).지베렐린 생성의 경우, Pa1, Pc1, Pd1의 경우 각각 331.
- 최근에는 발표된 인산 분해 미생물인 Pantoea cypripedii PS1의 경우에도 인산분해 활성이 초기 2일차에 가장 높은 활성을 보이다가 점차적으로 감소하는 경향을 보였고 pH변화도 본 연구결과와 유사하게 인산분해 활성이 높은 2일 차에 가장 낮은 수치를 보이다가 점차적으로 증가하는 결과를 보였다[31]. 따라서 본연구에서 분리된 네 종류의 미생물들 역시 다양한 유기산 생성으로 pH를 감소시키면서 무기 인산 분해 활성을 보이는 것으로 생각된다.
- 2A).무기 인산분해능력을 정량적으로 분석한 결과(Fig. 2B)에 의하면, 분리된 네 종류의 Pantoea 미생물은 모두 접종 후 1일차에 가장 높은 활성(113.2±6.8 mg/l for Pa1, 107.1±5.9 mg/l for Pc1, 90.4±6.2 mg/l for Pd1, 122.5±7.5 mg/l for Pv1)을 보인 후 점차적으로 감소하는 경향을 보였다. 같은 조건에서의 pH변화를 0일, 1일, 2일, 3일, 5일 배양된 상등액을 측정한 결과(Fig.
- 분리된 모든 미생물들은 높은 무기인산 가용화, 인돌아세트산 및 지베렐린 생성 활성을 나타내었고, 어린 상추 (lettuce)의 생장을 촉진시키는 활성을 보였다.
- 5% Ca3(PO4)2가 함유되어 있는 Pikovskaya agar 배지에도말하여 3일 배양 후 투명환(clear zone)을 보이는 약 50여종의 미생물을 확보하였다. 이들 분리된 미생물들을 16S rDNA 염기서열 분석 방법으로 확인한 결과, Pseudomonas, Burkholderia, Bacillus, Pantoea속 미생물들로 확인되었다. 이들 중 서로 다른 네 종류의 Pantoea species를 각각 Pa1, Pc1, Pd1, Pv1으로 명명한 다음 무기인산염 분해 활성 등 식물생장 촉진능력을 규명하고자 하였다.
- 3A). 인돌아세트산 호르몬 생성 활성은 네 종류의 미생물인 Pa1, Pc1, Pd1, Pv1 모두 높은 활성을 보였고, 생성농도의 경우 각각 85.3±16.3 μg/ml, 183.9±16.8 μg/ml, 28.8±17.3 μg/ml, 114.1±16.5 μg/ml 수치를 보였다 (Fig. 3B).
- 4). 처리된 네 종류의 미생물 모두 식물의 생장을 촉진시키는 활성으로 보였으며 생체량(fresh weight)의 분석 결과에 의하면 대조구의 경우 0.19±0.06 g/ plant를 보인 반면, 처리구의 경우 0.25~0.26±0.08 g/plant를 보였으며 대조구에 비해 상대적으로 32~37%의 증진효과를 보였다. 상층부 길이생장(shoot length)의 경우에도 대조구에 비해 10~15% 증가를 보였다.
후속연구
- 따라서 본 연구에서 분리된 네 종류의 Pantoea ananatis (Pa1), Pantoea citrea (Pc1), Pantoea dispersa (Pd1), Pantoea vagans (Pc1) 미생물들 역시 친환경농업에 적용될 수 있는 인산분해 활성, 식물 생장호르몬 생성 활성 등 다양한 생물비료 특성 및 식물 생장 촉진특성을 보이므로 이들 미생물을 미생물 비료 재료로 경작지에 적용한다면 농가의 수익 증대에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
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