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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 주요 어병세균인 S. iniae에 대해 시판한 약재 추출물 13종의 항균활성을 검색하였고, 이중에서 활성이 높은 희렴 추출물로부터 항균활성을 확인함으로써 양식 현장에서의 항생제를 대체하거나 그 사용량을 감소시킬 수 있는 어류 질병 치료 및 예방 약제로서의 가능성을 탐색하고자 하였다.
제안 방법
- , 2003). 37℃에서 24시간 배양한 후 대상 세균의 생육이 저해된 최저 농도를 MIC로 결정하였다.
- 농축하여 용매를 완전히 제거하였다. 각 용매 별 농축물을 DMSO에 10 mg/mL의 농도로 용해시켜 -20℃에 보관하면서 대상균주에 대한 항균활성을 측정하였다.
- 시료 추출액의 조제는 각 한약재 별로 약재를 세절하고 잘게 부수어 3배(v/v)의 80% methanol을 첨가하여 혼합하여 24시간 실온에서 침지한 후, Whatman No.2 (USA) 여과지로 2회 여과하였다. 추출액은 rotary vacuum evaporator로 40℃에서 감압 농축하여 용매를 완전제거였으며, 각각의 농축물을 다시 DMSO에 20 mg/mL의 농도로 용해시켜 각 세균 별 항균 활성 측정을 위한 stock solution으로 사용하였다.
- 측정하였다. 즉, 적정배지에서 하룻밤 배양한 대상 균주배양액 200 µL를 한천 배지 상에 멸균된 면봉으로 3회에 걸쳐 고르게 도말하고 지름 8 mm paper disk (Avantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 올린 후, 각 추출물을 30 µL씩 흡수시켜 37℃의 incubator에서 18시간 배양 후 paper disc 주위의 생육 저해 환의 크기를 측정하였다.
- 추출물의 각 어병세균에 대한 액체배지 상의 증식 억제 효과는 배양 배지에 추출물을 0, 50 및 100 µg/mL씩을 첨가하고 37℃ 에서 진탕배양하면서 배양 0시간부터 24시간까지 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 관찰하였다.
- 항균활성에서 가장 높은 결과를 보인 n-hexane과 ethyl acetate 분획물의 S. iniae에 대한 증식 억제효과를 살펴보기 위해, 배양배지에 최종농도 0, 50 및 100 µg/mL씩을 첨가하여 생육 정도를 흡광도를 통해 측정하였다(Fig. 2). 접종초기부터 배양 24시간까지 관찰한 결과, 두 분획물 모두 100 µg/mL 첨가 군에서는 S.
- 희렴의 methanol 추출물을 분획여두에서 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, 그리고 물로 용매의 극성에 따라 순차적으로 분획하여 각각의 유기용매 가용 분획을 얻었다(Fig. 1). 각 분획물의 항균활성은 disk diffusion method에 따라 측정한 결과를 Table 2에 사진과 함께 표기하였으며, n-hexane과 ethyl acetate 분획물은 S.
대상 데이터
- 사용 한약재의 일반명과 학명은 다음과 같으며, 요약한 내용은 Table 1에 나타내었다. 괄루인(Trichosanthes kirilowii), 대황(Rheum officinale), 백출 (Atractylodes macrocephala), 연자육(Nelumbo nucifera), 인진호(Artemisia capillaris), 하고초(Prunella vulgaris), 해동피(Kalopanax septemlobus), 해조(Sargassum fusiforme), 현초 (Geranium thunbergii), 홍화자(Carthamus tinctorius), 화피 (Prunus yedoensis), 회향(Foeniculum vulgare), 희렴(Siegesbeckia pubescens) 그 밖의 시약은 분석용 grade 및 Sigma Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에서는 1976년에 아마존강 담수 돌고래(Inia geoffrensis)에서 분리되어 보고된 beta-hemolysin을 생산하는 S. iniae KCTC3657 병원성 표준균주를 사용하였다. S.
- 한약재는 시중에서 유통되고 있는 것으로 대한생약제품(주) 로부터 구입하여 사용하였다. 사용 한약재의 일반명과 학명은 다음과 같으며, 요약한 내용은 Table 1에 나타내었다.
- 항균활성 대상균주인 Streptococcus iniae KCTC 3657는 Korean Collection for Type Cultures (KCTC, Korea)에서 구입하여 Brain Heart Infusion broth (Difco Co., USA)에서 배양하며 실험에 사용하였다.
이론/모형
- , 2016). S. iniae에 대한 13종의 한약재 methanol 추출물의 항균활성을 disc diffusion method로 측정하고 생육 저해환의 크기가 10 mm이상인 경우를 활성이 있다고 판단하였으며, 그 결과는 Table 1에 나타내었다. 백출(Atractylodes macrocephala), 인진호(Artemisia capil-laris), 하고초(Prunella vulgaris), 현초(Geranium thunbergii), 회향(Foeniculum vulgare), 희렴(Siegesbeckia pubescens)의
- 1). 각 분획물의 항균활성은 disk diffusion method에 따라 측정한 결과를 Table 2에 사진과 함께 표기하였으며, n-hexane과 ethyl acetate 분획물은 S. iniae에 대해 활성을 나타내었으나, n-buthanol과물 분획물에서는 항균활성을 나타내지 않았다.
- 추출물의 최소생육저해 농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)는 96-well plate와 Muller-Hinton 배지(Difco Co., USA)를 이용한 표준 2배 희석 방법으로 측정하였다(Lee et al., 2003). 37℃에서 24시간 배양한 후 대상 세균의 생육이 저해된 최저 농도를 MIC로 결정하였다.
- 항균활성은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2009)의 표준방법에 따라 disk diffusion method를 사용하여 측정하였다. 즉, 적정배지에서 하룻밤 배양한 대상 균주배양액 200 µL를 한천 배지 상에 멸균된 면봉으로 3회에 걸쳐 고르게 도말하고 지름 8 mm paper disk (Avantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.
성능/효과
- iniae의 생육이 완전히 저지되었다. Ethyl acetate 분획물 50 µg/mL 첨가군에서는 S. iniae의 생육이 24시간 배양 후를 기준으로 할 때 약 88% 정도 저해되었고, n-hexane 분획물 50 µg/mL 첨가군에서는 생육이 완전히 저해되었다. 즉, n-hexane과 ethyl acetate 용매의 분획 극성에서의 차이와 ethyl acetate 분획물에 대해 뚜렷한 차이를 나타낸 n-hexane 분획물의 결과를 바탕으로 고려하면, 두 분획물에는 서로 다른 항균활성 지표 물질이 포함되어 있을 것으로 사료된다.
- , 2015). 본 연구에서 나타난 희렴 n-hexane 분획물의 S. iniae에 대한 MIC가 8 µg/mL 임을 고려할 때, 상당히 특이적이고 강한 활성임을 짐작할 수 있다. 또한 본 연구에서 사용된 희렴의 methanol 추출물이나 n-hexane 및 ethyl acetate 분획물 시료가 정제정도가 낮아서 활성지표성분이 다른 성분들과 섞여 있는 조 추출물임을 감안할 때, 더욱 정제되어 단일 물질화 하였을 경우에는 상당히 낮은 농도에서도 S.
- iniae에 대한 최소생육저해농도(Minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정한 결과, 각각 32 µg/ mL, 8 µg/mL, 그리고 32 µg/mL로 측정되었다(Table 3). 이 결과는 각 추출물을 MIC 농도로 사용하였을 경우에 병원성 균주의 성장을 저해시킬 수 있음을 의미하며, n-hexane 분획물은 ethyl acetate 분획물이나 methanol 추출물에 비해 4배 정도 더 효과적으로 활용할 수 있음을 알 수 있다.
- 2). 접종초기부터 배양 24시간까지 관찰한 결과, 두 분획물 모두 100 µg/mL 첨가 군에서는 S. iniae의 생육이 완전히 저지되었다. Ethyl acetate 분획물 50 µg/mL 첨가군에서는 S.
- iniae의 생육이 24시간 배양 후를 기준으로 할 때 약 88% 정도 저해되었고, n-hexane 분획물 50 µg/mL 첨가군에서는 생육이 완전히 저해되었다. 즉, n-hexane과 ethyl acetate 용매의 분획 극성에서의 차이와 ethyl acetate 분획물에 대해 뚜렷한 차이를 나타낸 n-hexane 분획물의 결과를 바탕으로 고려하면, 두 분획물에는 서로 다른 항균활성 지표 물질이 포함되어 있을 것으로 사료된다.
- 추출물에서 항균활성을 나타내었으며, 이 중 희렴 추출물에서 S. iniae에 대해 가장 높은 항균활성을 나타내었다(Table 1). 활성을 나타낸 6가지의 한약재 추출물은 모두 S.
- 희렴 80% methanol 추출물과 n-hexane 분획물, 그리고 ethyl acetate 분획물의 S. iniae에 대한 최소생육저해농도(Minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정한 결과, 각각 32 µg/ mL, 8 µg/mL, 그리고 32 µg/mL로 측정되었다(Table 3). 이 결과는 각 추출물을 MIC 농도로 사용하였을 경우에 병원성 균주의 성장을 저해시킬 수 있음을 의미하며, n-hexane 분획물은 ethyl acetate 분획물이나 methanol 추출물에 비해 4배 정도 더 효과적으로 활용할 수 있음을 알 수 있다.
- 희렴 추출물을 이용하여 본 실험 결과에서 나타난 S. iniae에대한 강한 항균활성은 어병세균을 대상으로 한 점에서 기존의 다른 결과와 차별성을 나타낸다. 희렴의 어병세균에 대한 항균 활성 단일물질을 분리 및 구조동정하고, 어병세균에 대한 항균 활성 메커니즘을 밝히고, 또한 어병세균에 대해 상용되고 있는 항생제와의 병용투여 효과 및 투여 조건 등에 대한 연구가 향후 필요하다고 사료된다.
후속연구
- iniae에 대한 MIC가 8 µg/mL 임을 고려할 때, 상당히 특이적이고 강한 활성임을 짐작할 수 있다. 또한 본 연구에서 사용된 희렴의 methanol 추출물이나 n-hexane 및 ethyl acetate 분획물 시료가 정제정도가 낮아서 활성지표성분이 다른 성분들과 섞여 있는 조 추출물임을 감안할 때, 더욱 정제되어 단일 물질화 하였을 경우에는 상당히 낮은 농도에서도 S. iniae에 대한 저해능을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- iniae에대한 강한 항균활성은 어병세균을 대상으로 한 점에서 기존의 다른 결과와 차별성을 나타낸다. 희렴의 어병세균에 대한 항균 활성 단일물질을 분리 및 구조동정하고, 어병세균에 대한 항균 활성 메커니즘을 밝히고, 또한 어병세균에 대해 상용되고 있는 항생제와의 병용투여 효과 및 투여 조건 등에 대한 연구가 향후 필요하다고 사료된다.
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