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문제 정의
- 국외에서는 Md-ACS1와 Md-ACO1 분자표지를 사과의 저장성 예측과(14) 육종과정 중 저장성 형질과 관련 한 조기 선발 marker assisted selection(MAS)에 적용하고 있으나(15), 아직 국내에서는 연구된 바가 없다. 본 연구에서는 국내에서 개발 된 사과 28품종의 Md-ACS1와 Md-ACO1 대립유전자형을 구명하고 수확 후 에틸렌 발생량 및 경도 연화율을 조사하여 Md-ACS1와 Md-ACO1 분자표지를 국내의 사과 저장성 예측 및 육종 효율 향상을 위한 MAS에 활용할 수 있는지를 검증하고자 수행하였다.
가설 설정
- 2)Means followed by the same letters within the column per parameter are not significantly different (p<0.05).
제안 방법
- 1.6 L 밀폐용기에 소과종인 ‘RubyS'는 3개의 과실을 넣고, 나머지 품종들은 1개의 과실을 넣고 1시간 후 head space에서 1 mL gas 시료를 채취하여 각각 FID(flame ionization detector)와 TCD(thermal conductivity detector)를 장착한 gas chromatography(GC2010, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 조생종으로 품질변화가 빠르게 발생하는 ‘Golden Supreme’과 ‘Summer King’은 2일 간격으로 측정하고, 그 외 ‘Arisoo’ 등 5품종은 3일 간격으로 측정하였다. 3개의 과실을 1반복으로 하여 15개의 과실을 조사 하였다. 1.
- , Kyoto, Japan)를 이용하여 측정하였다. FID 분석조건은 Porapak Q(80/100 2m, Restek, Bellefonte, PA, USA) column을 이용하였고, injector, oven, detector 온도는 각각 100, 90, 200℃로 설정하였으며, flow rate는 He carrier, H2, Air를 각각 25, 40, 400mL/min로 하였다.
- Md-ACS1 및 Md-ACO1 대립유전자형 분석은 30품종 모두 실시하였고, 대립유전자형 조합별로 대표되는 7품종 (‘Fuji', ’RubyS', ‘Hongro', ‘Arisoo', ‘Summer King', ‘Greenball', ‘Golden Supreme')을 대상으로 과실의 에틸렌 발생량 및 경도 조사를 수행하였다.
- PCR 반응은 Maxime PCR Premix kit(i-starTaq, iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 gDNA 20 ng, primer 10 μM, distilled water 17μL 를 첨가하여 총 20 μL 반응액으로 수행하였다.
- PCR 분석에 이용하기 위하여 DNA를 20 ng·μL-1 의 농도로 희석하였다.
- PCR은 C1000 thermocycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 95℃에서 1분간 초기 변성 후 95℃에서 15초, 58℃ 및 65℃에서 15초, 72℃에서 10초로 35회 반복하고 72℃에서 10분간 처리 후 반응을 종료하였다. PCR 산물은 1.2% agarose gel 에서 전기 영동하여 확인하였다.
- PCR 반응은 Maxime PCR Premix kit(i-starTaq, iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 gDNA 20 ng, primer 10 μM, distilled water 17μL 를 첨가하여 총 20 μL 반응액으로 수행하였다. PCR은 C1000 thermocycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 95℃에서 1분간 초기 변성 후 95℃에서 15초, 58℃ 및 65℃에서 15초, 72℃에서 10초로 35회 반복하고 72℃에서 10분간 처리 후 반응을 종료하였다. PCR 산물은 1.
- 경도 연화율은 수확일의 경도에서 수확 후 상온 저장 20일의 경도를 뺀 값에서 상온 저장 기간 20일을 나누어 계산하였다. 통계분석은 Statistic Analysis System(SAS v 9.
- 과실의 경도는 수확일 및 수확 후 상온 저장 20일에 각각 조사하였다. 조사 방법은 과실 당 적도면 세 방향에 과피를 얇게 벗겨내고 11 mm plunger를 장착한 과실경도계(Fruit firmness tester, DFT-01, TR snc, Italy)를 이용하여 측정 후 평균값을 사용하였다.
- 본 연구는 사과 국내육성 28품종의 Md-ACS1 및 Md-ACO1 대립유전자형을 분석하고, ‘Fuji(FJ)', ‘RubyS(RS)', ‘Hongro(HR)', ‘Arisoo(AS)', ‘Summer King(SK)', ‘Greenball(GB)', ‘Golden Supreme(GS)'을 대상으로 수확 후 25일까지의 에틸렌 발생량 및 상온저장(20℃) 20일 동안의 경도 연화율을 조사하였다.
- 에틸렌 발생량은 과실 수확일 부터 상온저장(20℃) 25일까지 조사하였다. 조생종으로 품질변화가 빠르게 발생하는 ‘Golden Supreme’과 ‘Summer King’은 2일 간격으로 측정하고, 그 외 ‘Arisoo’ 등 5품종은 3일 간격으로 측정하였다.
- 과실의 경도는 수확일 및 수확 후 상온 저장 20일에 각각 조사하였다. 조사 방법은 과실 당 적도면 세 방향에 과피를 얇게 벗겨내고 11 mm plunger를 장착한 과실경도계(Fruit firmness tester, DFT-01, TR snc, Italy)를 이용하여 측정 후 평균값을 사용하였다. 3과실을 1반복으로 총 3반복하여 평균(Mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다.
- 조생종으로 품질변화가 빠르게 발생하는 ‘Golden Supreme’과 ‘Summer King’은 2일 간격으로 측정하고, 그 외 ‘Arisoo’ 등 5품종은 3일 간격으로 측정하였다.
- 품종별 genomic DNA 추출은 신초를 채취하여 액체질소와 막자사발로 곱게 마쇄한 후 DNeasy plant mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하였다. 추출한 DNA는 0.8% agarose gel 에 전기 영동하여 순도를 확인하고 분광광도계(BioTek, Winooski, VT, USA)로 정량분석 하였다. PCR 분석에 이용하기 위하여 DNA를 20 ng·μL-1 의 농도로 희석하였다.
- 품종별 genomic DNA 추출은 신초를 채취하여 액체질소와 막자사발로 곱게 마쇄한 후 DNeasy plant mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하였다. 추출한 DNA는 0.
대상 데이터
- 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 육성한 28품종과 국외에서 개발된 저장성이 강한 ‘Fuji’와 저장성이 약한 ‘Golden Supreme’ 품종을 실험재료로 선정하고, 경상북도 군위군에 위치한 농촌진흥청 국립원예특작과학원 사과연구소의 유전자원 보존포에 재식된 나무를 사용하였다.
데이터처리
- 3과실을 1반복으로 총 3반복하여 평균(Mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다.
- 통계분석은 Statistic Analysis System(SAS v 9.4 Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 ANOVA 분석을 행한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- Md-ACS1 및 Md-ACO1 대립유전자형 분석을 위하여 Sunako 등(16)과 Costa 등(5)이 보고한 primer를 실험에 사용하였다(Table 1). PCR 반응은 Maxime PCR Premix kit(i-starTaq, iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 gDNA 20 ng, primer 10 μM, distilled water 17μL 를 첨가하여 총 20 μL 반응액으로 수행하였다.
성능/효과
- ACS1 대립유전자형에 따른 에틸렌 발생량은 ACS1-1/1인 ‘Golden Supreme’이 가장 높았으며, ACS1-2/2인 ‘RubyS’, ‘Hongro’, ‘Arisoo’는 다른 대립유전자형을 가진 품종들에 비해 낮은 에틸렌 발생량을 보였다.
- ACS1-1/2, ACO1-1/2로 FA 2인 품종은 ‘Summer King', 'Greenball' 등 28.6%였고, ACS1-1/1, ACO1-1/2로 FA 1인 품종은 7.1%로 ‘Rosebell’, ‘Summerprince’로 확인되었다.
- 가장 낮은 에틸렌 발생량을 보인 ‘RubyS’(ACS1-2/2, ACO1-1/2, FA 3)를 제외하면, ‘Fuji’(ACS1-2/2, ACO1-1/1, FA 4), ‘Hongro’ (ACS1-2/2, ACO1-1/2, FA 3), ‘Arisoo’(ACS1-2/2, ACO1-1/2, FA 3), ‘Summer King’(ACS1-1/2, ACO1-1/2, FA 2), ‘Greenball’(ACS1-1/2, ACO1-1/2, FA 2), ‘Golden Supreme’(ACS1-1/1, ACO1-1/2, FA 1) 순으로 에틸렌 발생량이 낮은 것으로 조사되었다.
- 본 연구는 사과 국내육성 28품종의 Md-ACS1 및 Md-ACO1 대립유전자형을 분석하고, ‘Fuji(FJ)', ‘RubyS(RS)', ‘Hongro(HR)', ‘Arisoo(AS)', ‘Summer King(SK)', ‘Greenball(GB)', ‘Golden Supreme(GS)'을 대상으로 수확 후 25일까지의 에틸렌 발생량 및 상온저장(20℃) 20일 동안의 경도 연화율을 조사하였다. 그 결과, 낮은 에틸렌 발생량과 관련 된 대립유전자(favorable alleles0(FA)) ACS1-2, ACO1-1이 많을수록 에틸렌 발생량과 경도 연화율이 낮은 경향을 보였다. GS은 ACS1-1/1, ACO1-1/2(FA 1)으로 모든 품종 중 가장 높은 에틸렌 발생 수치와 경도 연화율를 보였다.
- 본 실험에서도 'RubyS'를 제외한 다른 품종들 보다 낮은 에틸렌 발생량을 확인할 수 있었다.
- ACS1-2/2, ACO1-1/1(FA 4)인 FJ는 RS를 제외한 모든 품종 중에 에틸렌 발생량과 경도 연화율이 가장 낮았다. 본 실험의 결과 Md-ACS1 및 Md-ACO1 대립유전자형과 사과의 에틸렌 발생량 및 경도 연화율은 상관성이 있는 것으로 확인되었다. 따라서, Md-ACS1 및 Md-ACO1 분자표지를 사과 국내육성 품종의 저장성 예측과 육종 효율 향상을 위한 Marker-assisted selection에 활용할 수 있을 것으로 생각 된다.
- 이것은 사과의 품질 중 저장성 형질이 아주 중요한 육종 목표이며, 저장성 형질과 관련 된 Md-ACS1와 Md-ACO1 분자표지의 검증 및 활용은 육종효율 향상을 위한 MAS에 꼭 필요하다는 의미가 될 것이다. 본 실험의 결과, 수확 후 저장기간 동안의 에틸렌 발생 및 경도 연화율은 Md-ACS1 및 Md-ACO1 대립유전자형과 상관성이 있는 것으로 확인되었다. 따라서 사과의 저장성 형질과 관련 된 Md-ACS1 및 Md-ACO1 분자표지를 이용한 간단한 PCR 분석을 통해 사과 국내육성품종의 저장성 예측 및 육종 효율향상을 위한 교배조합 작성, 교배실생의 조기선발이 가능할 것으로 생각 된다.
- 수확일로부터 상온저장(20℃) 25일간 조사 된 에틸렌 발생량은 품종별로 큰 차이를 보였으나, 낮은 에틸렌 발생량과 관련 된 대립유전자 ACS1-2, ACO1-1이 많을수록 에틸렌 발생량도 낮은 경향을 보였다(Fig. 2). 가장 낮은 에틸렌 발생량을 보인 ‘RubyS’(ACS1-2/2, ACO1-1/2, FA 3)를 제외하면, ‘Fuji’(ACS1-2/2, ACO1-1/1, FA 4), ‘Hongro’ (ACS1-2/2, ACO1-1/2, FA 3), ‘Arisoo’(ACS1-2/2, ACO1-1/2, FA 3), ‘Summer King’(ACS1-1/2, ACO1-1/2, FA 2), ‘Greenball’(ACS1-1/2, ACO1-1/2, FA 2), ‘Golden Supreme’(ACS1-1/1, ACO1-1/2, FA 1) 순으로 에틸렌 발생량이 낮은 것으로 조사되었다.
- 수확일의 경도는 품종 특성에 따라 다른 것으로 확인되었으나 상온저장 20일 후 경도 연화율은 에틸렌 발생 양상과 비슷한 경향을 보였다(Table 3). 에틸렌 발생량이 가장 높았던 ‘Golden Supreme’은 경도 연화율이 가장 높았다.
- 에틸렌 발생량이 가장 낮았던 ‘RubyS’의 경도 연화율은 가장 낮았고, 다음으로 경도 연화율이 낮은 품종은 ‘Fuji’, ‘Hongro’, ‘Arisoo’, ‘Greenball’, ‘Summer King’의 순이었다.
- 에틸렌 발생량이 가장 높았던 ‘Golden Supreme’은 경도 연화율이 가장 높았다.
후속연구
- ‘Fuji'의 에틸렌 발생이 낮은 것은 ACS1-2/2 promoter region의 SINE retroposon insertion에 의한 것으로 밝혀져 있는데(17), ‘Fuji'와 비슷한 발생 양상을 보인 ‘Hongro'와 더 낮은 발생량을 보인 ’RubyS'도 이와 같은 변이에 대한 확인이 필요할 것으로 생각된다.
- 본 실험의 결과, 수확 후 저장기간 동안의 에틸렌 발생 및 경도 연화율은 Md-ACS1 및 Md-ACO1 대립유전자형과 상관성이 있는 것으로 확인되었다. 따라서 사과의 저장성 형질과 관련 된 Md-ACS1 및 Md-ACO1 분자표지를 이용한 간단한 PCR 분석을 통해 사과 국내육성품종의 저장성 예측 및 육종 효율향상을 위한 교배조합 작성, 교배실생의 조기선발이 가능할 것으로 생각 된다.
- 본 실험의 결과 Md-ACS1 및 Md-ACO1 대립유전자형과 사과의 에틸렌 발생량 및 경도 연화율은 상관성이 있는 것으로 확인되었다. 따라서, Md-ACS1 및 Md-ACO1 분자표지를 사과 국내육성 품종의 저장성 예측과 육종 효율 향상을 위한 Marker-assisted selection에 활용할 수 있을 것으로 생각 된다.
- Oraguzie 등(21)은 저장기간 중 경도 연화율이 ACS1-2/2인 만생종인 경우 가장 낮았고, ACS1-1/1인 조생종의 경우 가장 높았다고 보고하였는데, ACS1-1/1인 조생종 ‘Golden Supreme’의 경도 연화율이 가장 높았고, ‘RubyS’를 제외하고 ACS1-2/2인 만생종 ‘Fuji’가 가장 낮았던 것으로 조사된 본 실험의 결과와 유사하였다. 따라서, 국내육성품종들의 숙기와 ACS1, ACO1 유전자형에 따른 에틸렌 발생, 경도 등 저장성 특성을 검토해 볼 필요성이 있을 것으로 생각된다.
- 따라서 에틸렌 발생이 낮은 유전적 특성을 가진 품종은 저장성이 좋아서 유통 기간을 안정적으로 확보할 수 있으며, 소비자들에게 품질 변화가 적은 과실을 제공할 가능성을 높일 수 있다. 또한 에틸렌 제어제 개발 및 처리에 대한 경제적 부담을 줄일 수 있을 것이다.
- 평균 과중 80-90 g인 소과종 ‘RubyS'는 에틸렌 발생량이 0.1-0.2 μL·L-1·h-1 으로 매우 낮은 수치를 보였는데, 이 결과를 설명하기 위해서는 다른 소과종과의 비교 실험이 필요할 것으로 생각된다.
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