[논문]초고온성 고세균 Thermococcus onnurineus의 개미산으로부터 바이오수소 생산을 위한 통계적 배지 최적화

이성목; 김태완; 이현숙; 이정현; 강성균

doi:10.4217/opr.2017.39.4.269

초고온성 고세균 Thermococcus onnurineus의 개미산으로부터 바이오수소 생산을 위한 통계적 배지 최적화
Statistical Optimization of Medium for Formate-driven Bio-hydrogen Production by the Hyperthermophilic Archaeon, Thermococus onnurineus 원문보기

Ocean and polar research, v.39 no.4, 2017년, pp.269 - 277

이성목 (한국해양과학기술원 해양생명공학연구센터) , 김태완 (전남대학교 생물공학과) , 이현숙 (한국해양과학기술원 해양생명공학연구센터) , 이정현 (한국해양과학기술원 해양생명공학연구센터) , 강성균 (한국해양과학기술원 해양생명공학연구센터)

Abstract ▼ AI-Helper

Medium compositions for the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus onnurineus NA1 was statistically optimized to enhance formate-driven hydrogen ($H_2$) production by using response surface methodology. From the Plackett-Burman design-based experiment, it was confirmed that among the minor components of medium such as KCl, $MgSO_4$, $NH_4Cl$, Cystein-HCl, trace elements, Fe-EDTA and $CaCl_2$, the trace elements were screened as the only positively effective components with respect to $H_2$ production. Subsequently, the optimal concentrations of the trace elements and the major components of a medium such as NaCl, yeast extract and sodium formate were determined from the five-level central composite design (CCD)-based experiment. The resulting quadratic model predicted the maximum $H_2$ production of 46.6 mmol/L in serum bottle and it was validated experimentally using the optimal medium initially supplemented with 26.70 g/L of NaCl, 9.81 g/L of sodium formate, 3.50 g/L of yeast extract and 4.59 mL/L of trace elements. From the duplicate batch cultivations in the fermentor using the optimized medium, the a maximum $H_2$ production rate up to 71.8 mmol/L/h could be obtained, which was a 65% enhanced value compared with that obtained using the control medium, showing the high efficiency of the optimized medium.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구에서는 T. onnurineus NA1의 formate를 이용한 수소생산을 극대화 하기 위해, 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 이용하여 통계적 배지최적 화를 수행하고 그 효율성을 검증하였다. 배지의 미량성분중 수소생산에 영향을 미치는 성분을 선별하기 위해 Plackett-Burman design을 이용하였으며, 그 결과를 통해 선별된 성분(trace element)과 배지의 주 성분인 sodium chloride, sodium formate 그리고 yeast extract의 4가지 성분에 대한 최적의 배지조성을 central composite design (CCD)을 이용하여 확립하였다.
본 연구에서는 T. onnurineus NA1의 개미산을 이용한 바이오수소 생산에 적합한 배지를 개발하고자 통계적 배지최적화를 수행하였다. 이를 위해 먼저 Plackett-Burman design 실험을 통해 T.

제안 방법

따라서 배지 최적화를 위한 첫 번째 단계로서 배지 내 미량성분 들의 수소생산에 미치는 영향을 고찰하고 이들 중 수소생산에 양(+)의 영향을 미치는 성분들을 선별하기 위하여 Plackett-Burman design을 이용한 실험을 수행하였다. KCl (X₁ ), MgSO₄ (X₂ ), NH₄ Cl (X₃ ), cystein-HCl (X₄), trace element (X₅ ), Fe-EDTA (X₆) 그리고 CaCl₂ (X₇ ) 등의 7가지 성분을 독립변수로 사용하여 Plackett-Burman design을 통해 12종류의 실험을 구성하였다(Table 2). 그리고 각각의 성분에 대한 수준 및 농도 범위는 Table 1에 도시하였다.
MM1 배지와 최적화 배지에서의 수소생산 비교를 위해 총 부피 2.5 L 규모의 발효기(CNS Co., Daejeon, South Korea)에서 회분식 배양이 수행되었다. 즉, 발효기 안에 1.
onnurineus NA1의 개미산으로부터 수소생산에 가장 적합한 배지성분 최적화를 실시하였다. Plackett-Burman design을 통해 선별된 trace element (X₄ )와 MM1 배지의 주성분인 sodium chloride (X₁ ), sodium formate (X₂ ) 그리고 yeast extract (X₃ )의 4가지 성분을 독립변수로 지정하여 중심합성계획법(central composite design, CCD) 기반의 실험을 구성하였다(Table 5). 독립변수들의 부호화 수준 및 농도 범위는 Table 4에 나타내었다.
균주의 성장을 확인하기 위해 UV-visible spectrophotometer (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 600 nm에서 optical density를 측정하였다. Serum bottle 또는 발효기내 head space에 존재하는 가스(H₂ , N₂ , CO₂ ) 조성은 gas chromatography (GC)를 이용하여 분석하였다(Bae et al. 2015). 가스의 분리 및 검출을 위해 packed column (3FT 1/8 IN Molsieve 5A Column, 10FT 1/8 IN Porapak N Column, Supelco, USA), thermal conductivity detector (TCD) 그리고 flame ionization detector (FID) 등이 장착되었고, 이동상으로서 아르곤 가스가 30 mL/min의 속도로 공급되었다.
2015). 가스의 분리 및 검출을 위해 packed column (3FT 1/8 IN Molsieve 5A Column, 10FT 1/8 IN Porapak N Column, Supelco, USA), thermal conductivity detector (TCD) 그리고 flame ionization detector (FID) 등이 장착되었고, 이동상으로서 아르곤 가스가 30 mL/min의 속도로 공급되었다. Serum bottle 배양을 통해 생산된 수소의 농도(mmol/L)는 head space의 가스 조성과 총 압력으로부터 계산되었고, 발효기 배양의 경우에는 head space의 가스 조성과 습식가스미터(Shinagawa, Tokyo, Japan)를 통해 측정된 배출가스의 총 유량으로부터 계산되었다.
각 독립변수들은 −2, −1, 0, 1, 2 다섯 단계로 부호화 되었다(Table 4), 실험결과값의 통계적 분석을 통해 아래의 2차 회귀모델을 얻음으로써 각각의 독립변수들 간의 상호작용을 분석하고 각 변수들의 최적 농도를 예측하였다.
균주의 성장을 확인하기 위해 UV-visible spectrophotometer (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 600 nm에서 optical density를 측정하였다. Serum bottle 또는 발효기내 head space에 존재하는 가스(H₂ , N₂ , CO₂ ) 조성은 gas chromatography (GC)를 이용하여 분석하였다(Bae et al.
Serum bottle 배양을 통해 생산된 수소의 농도(mmol/L)는 head space의 가스 조성과 총 압력으로부터 계산되었고, 발효기 배양의 경우에는 head space의 가스 조성과 습식가스미터(Shinagawa, Tokyo, Japan)를 통해 측정된 배출가스의 총 유량으로부터 계산되었다. 또한, 수소생산속도(mmol/L/h)는 단위시간당 단위부피당 생산된 수소의 양으로부터 계산되었고, 수소의 부피생산성은 수소의 최종 생산농도를 총 배양시간으로 나누어 계산되었다. 배양액 내의 개미산의 농도는 HPLC 를 이용하여 측정되었다 (Bae et al.
59 mL/L로 추정되었다. 모델의 검증을 위해 최적농도 조건에서 배양실험을 통해 수소생산농도를 확인하였다. 그 결과 47.
반응표면분석법(RSM)을 이용하여 T. onnurineus NA1의 개미산으로부터 수소생산에 가장 적합한 배지성분 최적화를 실시하였다. Plackett-Burman design을 통해 선별된 trace element (X₄ )와 MM1 배지의 주성분인 sodium chloride (X₁ ), sodium formate (X₂ ) 그리고 yeast extract (X₃ )의 4가지 성분을 독립변수로 지정하여 중심합성계획법(central composite design, CCD) 기반의 실험을 구성하였다(Table 5).
배양기에서의 T. onnurineus NA1의 회분식 배양을 통해 최적화 배지와 기존의 MM1 배지에서의 수소생산과 세포성장을 비교하여 최적화 배지의 성능을 평가하였다 (Fig. 2). 전체적으로 최적화 배지에서 세포성장 및 formate의 소모 속도가 빠른 것으로 나타났다(Fig.
onnurineus NA1의 formate를 이용한 수소생산을 극대화 하기 위해, 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 이용하여 통계적 배지최적 화를 수행하고 그 효율성을 검증하였다. 배지의 미량성분중 수소생산에 영향을 미치는 성분을 선별하기 위해 Plackett-Burman design을 이용하였으며, 그 결과를 통해 선별된 성분(trace element)과 배지의 주 성분인 sodium chloride, sodium formate 그리고 yeast extract의 4가지 성분에 대한 최적의 배지조성을 central composite design (CCD)을 이용하여 확립하였다.
2014). 이러한 결과를 바탕으로 MM1배지 내 미량성분 중 수소 생산에 영향을 미치는 양(+)의 인자로서 trace element를 선정하였고, 배지 내 주성분들인 sodium formate, yeast extract, sodium chloride와 함께 통계학적 배지 최적화를 수행하였다.
onnurineus NA1의 세포성장과 수소생산에 영향을 미치는 인자로 잘 알려진 NaCl, yeast extract 그리고 sodium formate를 제외한 나머지 미량성분들 중에서 수소생산에 영향을 미치는 성분을 선별하기 위해 PlacketBurman design을 수행하여 수소생산에 영향을 미치는 배지성분을 선별하였다. 이를 위해 MM1 배지의 미량성분 중에서 KCl, MgSO₄ , NH₄ Cl, Cystein-HCl, trace element, Fe-EDTA 그리고 CaCl₂ 등의 7가지 성분을 독립변수로 선정하였고, Plackett-Burman design에 의해 12종류의 실험을 구성하였다(Table 2). 이때, 각 독립변수는 low (−1) 와 high (+1)의 두 가지 수준에서 부호화(coded)되었다 (Table 1).
이를 위해 먼저 Plackett-Burman design 실험을 통해 T. onnurineus NA1 배양의 기본 배지로 알려진 MM1 배지의 미량성분 중 수소 생산에 양(+)의영향을 미치는 trace metal element 성분을 스크리닝 하였다.
onnurineus NA1 배양의 기본 배지로 알려진 MM1 배지의 미량성분 중 수소 생산에 양(+)의영향을 미치는 trace metal element 성분을 스크리닝 하였다. 이후 trace element 성분과 함께 MM1 배지의 주 성분인 NaCl, sodium formate 그리고 yeast extract 성분들을 독립변수로 선정하여 중심합성계획법 기반의 반응표면분 석법을 통해 최적 수소생산을 위한 독립변수들의 최적 농도를 도출하였다. 그 결과, 최적화 배지를 사용하여 T.
통계적 배지 최적화를 수행하기 전에, MM1 배지의 주성분으로서 T. onnurineus NA1의 세포성장과 수소생산에 영향을 미치는 인자로 잘 알려진 NaCl, yeast extract 그리고 sodium formate를 제외한 나머지 미량성분들 중에서 수소생산에 영향을 미치는 성분을 선별하기 위해 PlacketBurman design을 수행하여 수소생산에 영향을 미치는 배지성분을 선별하였다. 이를 위해 MM1 배지의 미량성분 중에서 KCl, MgSO₄ , NH₄ Cl, Cystein-HCl, trace element, Fe-EDTA 그리고 CaCl₂ 등의 7가지 성분을 독립변수로 선정하였고, Plackett-Burman design에 의해 12종류의 실험을 구성하였다(Table 2).

대상 데이터

MM1 배지의 다른 성분들 중 Plackett-Burman design 실험에서 수소생산에 음(−)의 영향을 미치는 것으로 나타난 성분들인 KCl, NH4 Cl, Cystein-HCl, MgSO4 , Fe-EDTA 그리고 CaCl2 는 Table 1에서 설정한 low level (−1)에 해당하는 농도가 배지최적화에 사용되었고, 나머지 성분들인 Na2 HPO4 , Na2 SiO3 , NaHCO3 그리고 vitamin solution은 MM1 배지와 동일한농도로 사용되었다.
균주는 심해 열수구에서 분리된 초고온성 고세균 Thermococcus onnurineus NA1이 사용되었다(Bae et al. 2006). 배지최적화를 위해 사용된 기본 배지는 MM1 배지 (Sokolova et al.
배지최적화를 위해 사용된 기본 배지는 MM1 배지 (Sokolova et al. 2004; Kim et al. 2010)이었고, 성분은 다음과 같다: yeast extract 1 g/L, NaCl 35 g/L, KCl 0.7 g/L, MgSO4 3.9 g/L, CaCl2 ·2H2 O 0.4 g/L, NH4 Cl 0.3 g/L, Na2 HPO4 0.15 g/L, Na2 SiO3 0.03 g/L, NaHCO3 0.5 g/L, cysteine-HCl 0.5 g/L, Holden's trace elements/Fe-EDTA solution 1 mL (Holden et al. 2001), Balch's vitamin solution 1 mL (Balch and Wolfe 1976), sodium formate 10 g/L.
분석칼럼은 shodex RSpak KC-811 Columns (8.0 × 300 mm with an internal diameter of 6 μm)을 이용하였고 이동상은 0.1% (v/v) H3 PO4 를 1.0 mL/min의 속도로 공급하였으며, UV detector (210 nm)로 검출하였다.
Plackett-Burman design 실험 결과의 통계적 분석을 통해 수소생산에 양(+)의 영향을 미치는 것으로 선별된 trace element와 MM1 배지의 주성분들인 NaCl, yeast extract 그리고 sodium formate의 농도를 최적화하기 위해 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 실시하였다. 이를 위해, 중심합성계획법(central composite design, CCD)에 기반하여 30 종류의 실험이 구성되었고,이 중에는 6개의 중심점(central point) 실험이 반복하여 포함되었다(Table 5). 각 독립변수들은 −2, −1, 0, 1, 2 다섯 단계로 부호화 되었다(Table 4), 실험결과값의 통계적 분석을 통해 아래의 2차 회귀모델을 얻음으로써 각각의 독립변수들 간의 상호작용을 분석하고 각 변수들의 최적 농도를 예측하였다.
5 L의 MM1 배지 또는 최적화 배지를 각각 넣어준 후 각각의 배지에서 종배양된 배양액 100 mL을 접종해주었다. 접종 전, 각각의 배지는 고순도의 아르곤(Ar, 99.999%) 가스를 30분 이상 충분히 불어넣어주어 배지 내 산소를 모두 제거해 주었다. 배양기간 동안 배양액의 pH는 2 N HCl 용액을 이용하여 6.

데이터처리

Plackett-Burman design 실험 결과의 통계적 분석을 통해 수소생산에 양(+)의 영향을 미치는 것으로 선별된 trace element와 MM1 배지의 주성분들인 NaCl, yeast extract 그리고 sodium formate의 농도를 최적화하기 위해 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 실시하였다. 이를 위해, 중심합성계획법(central composite design, CCD)에 기반하여 30 종류의 실험이 구성되었고,이 중에는 6개의 중심점(central point) 실험이 반복하여 포함되었다(Table 5).
는상호계수, 그리고 x는 각각의 독립변수 sodium chloride, sodium formate, yeast extract 그리고 trace element를 나타낸다. Plackett-Burman design과 CCD 실험의 통계적 유의성은 소프트웨어(Design-Expert 7.0.0 Trial)를 이용한 분산분석(analysis of variance, ANOVA)에 의해 결정되었다.
이때, 각 독립변수는 low (−1) 와 high (+1)의 두 가지 수준에서 부호화(coded)되었다 (Table 1). 구성된 12 종류의 실험은 모두 3회 반복 수행되었고, 얻어진 결과값(수소생산농도)을 아래의 1차 모델에 적용하여 회귀분석을 수행하였다.
그리고 각각의 성분에 대한 수준 및 농도 범위는 Table 1에 도시하였다. 실험 결과, 수소생산농도(3회 반복 시행의 평균 값 취함)는 변수들의 농도변화에 따라 최소 14.7mmol/L부터 최대 27.7 mmol/L까지 다양하게 관측되었고 (Table 2), 이 값들을 이용하여 분산분석을 실시하였다 (Table 3). 그 결과 결정계수(R₂ )는 0.

이론/모형

그러나, 위에 언급한 주요 성분들 외에 배지를 구성하는 다른 미량성분들의 경우에는 수소생산에 어떠한 영향을 미치는지 현재까지 알려진 바가 없다. 따라서 배지 최적화를 위한 첫 번째 단계로서 배지 내 미량성분 들의 수소생산에 미치는 영향을 고찰하고 이들 중 수소생산에 양(+)의 영향을 미치는 성분들을 선별하기 위하여 Plackett-Burman design을 이용한 실험을 수행하였다. KCl (X₁ ), MgSO₄ (X₂ ), NH₄ Cl (X₃ ), cystein-HCl (X₄), trace element (X₅ ), Fe-EDTA (X₆) 그리고 CaCl₂ (X₇ ) 등의 7가지 성분을 독립변수로 사용하여 Plackett-Burman design을 통해 12종류의 실험을 구성하였다(Table 2).
배양은 80 ^oC의 incubator에서 6시간 동안 정치배양 모드로 이루어졌고, 모든 배양은 3회 반복되었다. 배지최적화 검증실험에는 MM1 배지 대신 Plackett-Burman design과 중심합성계획법(central composite design)을 통해 확립된 최적화 배지가 사용되었다.

성능/효과

0075)한것으로 확인되었다. 각 변수의 유의성에 있어서는 cystein-HCl (X₄ )과 trace element (X₅ )의 p-value가 0.050 보다 작아 유의성 있는 결과를 보여주었고(Table 3), 그 중에서도 trace element 만이 수소생산에 양(+)의 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 T.
모델의 검증을 위해 최적농도 조건에서 배양실험을 통해 수소생산농도를 확인하였다. 그 결과 47.0 mmol/L의 수소 생산이 관측되었고(데이터 미제시), 모델의 예측치와 거의 일치하였다. 이러한 점으로 미루어보아 본 최적화를 통해 도출된 2차 회귀 모델식은 타당한 것으로 판단된다.
7 mmol/L까지 다양하게 관측되었고 (Table 2), 이 값들을 이용하여 분산분석을 실시하였다 (Table 3). 그 결과 결정계수(R₂ )는 0.9684로 1에 가깝게 매우 높게 나타났으며, 모델 전체도 유의(p = 0.0075)한것으로 확인되었다. 각 변수의 유의성에 있어서는 cystein-HCl (X₄ )과 trace element (X₅ )의 p-value가 0.
이후 trace element 성분과 함께 MM1 배지의 주 성분인 NaCl, sodium formate 그리고 yeast extract 성분들을 독립변수로 선정하여 중심합성계획법 기반의 반응표면분 석법을 통해 최적 수소생산을 위한 독립변수들의 최적 농도를 도출하였다. 그 결과, 최적화 배지를 사용하여 T.onnurineus NA1을 배양하였을 경우 기본 배지인 MM1 배지 대비 바이오수소의 부피생산성이 41% 가량 매우 높게 증가하는 것으로 관측되었고, 이를 통해 본 연구에서 디자인된 최적 배지의 효율성이 매우 높은 것으로 입증되 었다.
4% 에 해당된다. 따라서 본 연구를 통해 개발된 최적화 배지가 T. onnurineus NA1의 개미산으로부터 바이오수소 생산에 매우 효과적인 것으로 판단된다.
이러한 점으로 미루어보아 본 최적화를 통해 도출된 2차 회귀 모델식은 타당한 것으로 판단된다. 또한 본 최적화 배지의 효율성을 측정하기 위해 대조군으로 사용된 기본 배지인 MM1 배지를 이용하여 배양한 결과, 약 35.91 mmol/L의 수소가 생산되었다(데이터 미제시). 이는 최적화 배지에서의 배양을 통해 얻어진 결과의 약 76.
2b). 또한, 최적화 배지에서의 배양결과 5시간 만에 155.49 mmol/L의수소가 생산되었으나 MM1 배지에서는 6.5시간 동안 143.48 mmol/L의 수소가 생산된 것으로 관측되어 최적화 배지를 이용함으로써 바이오수소의 부피생산성을 약 41% 증가시킬 수 있는 것으로 확인되었다(Fig. 2c). 이는 본 연구를 통해 개발 된 최적화 배지의 효율성을 잘 보여주는 결과인 것으로 판단된다.
0 mmol/L의 수소 생산이 관측되었고(데이터 미제시), 모델의 예측치와 거의 일치하였다. 이러한 점으로 미루어보아 본 최적화를 통해 도출된 2차 회귀 모델식은 타당한 것으로 판단된다. 또한 본 최적화 배지의 효율성을 측정하기 위해 대조군으로 사용된 기본 배지인 MM1 배지를 이용하여 배양한 결과, 약 35.
2). 전체적으로 최적화 배지에서 세포성장 및 formate의 소모 속도가 빠른 것으로 나타났다(Fig. 2a, 2c). 최적화 배지에서의 최대 비생장속도(maximum specific growth rate)는 0.
최적화 배지에서의 최대 비생장속도(maximum specific growth rate)는 0.93 h −1 로 계산되었는데, 이는 MM1 배지 에서의 0.71 h −1 대비 약 31% 증가한 값이다.

후속연구

2006, 2012, 2015). 따라서 배지 내 위 성분들의 농도를 통계적 방법을 통해 최적화 함으로서 수소생산을 극대화 할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나, 위에 언급한 주요 성분들 외에 배지를 구성하는 다른 미량성분들의 경우에는 수소생산에 어떠한 영향을 미치는지 현재까지 알려진 바가 없다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	환경적 측면에서 수소의 장점은 무엇인가?	수소는, 바이오 에탄올 또는 디젤과 달리 연소과정에서 생성되는 이산화탄소의 배출이 없고, 화석연료의 연소에서 발생하는 황산화물(SOx)과 질산화물(NOx) 같은 오염 물질도 발생하지 않으며, 오직 산소와 반응하여 물로 전환되기 때문에 청정에너지로 인식되고 있다(Suleman et al. 2015; Yadav et al.
	수소 생산 방법은 무엇이 있는가?	수소는 전기분해, 물의 광분해와 열분해, 바이오 매스의 열분해 및 가스화, 수증기 개질 등의 다양한 방법을 통해 생산이 가능하다. 현재 대부분의 수소 생산은 천연가스를 이용하여 수증기 개질 방식을 통해 이루어지고 있으며, 특히 수증기 메탄 개질의 경우 비용이 적게 들고 가장 일반적인 방법으로 알려져 있다(Acar and Dincer 2015). 그러나 이러한 수소생산 방법들은 고온 고압의 조건을 필요로 하며, 반응과정에서 이산화탄소를 발생한다는 단점이 있다(Sharmaa et al.
	에너지로써 수소의 장점은 무엇인가?	2015). 또한 1 g당 생산할 수 있는 열량이 142 kJ로 다른 연료들(ethanol 26.9 kJ/g, diesel 42 kJ/g)에 비해 매우 높은 에너지를 낼 수 있으며(Hay et al. 2013; Patel et al. 2016), 연료전지를 통해 쉽게 전기로 전환이 가능하다는 장점을 가지고 있다(Levin et al. 2004).

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Zhang D, Wang J, Lin Y, Si Y, Huang C, Yang J, Huang B, Li W (2017) Present situation and future prospect of renewable energy in China. Renew Sust Energ Rev 76:865-871

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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