탄저병이 발생한 자두에서 11개 탄저병균을 순수 분리하여 병원성을 검정한 후 PDA에 접종하여 $25^{\circ}C$에서 7-10일 동안 배양하면서 각 균주의 균사 생장속도, colony의 특징과 색, 포자 형태 및 크기를 관찰하였다. 각 균주의 genomic DNA를 추출하여 rDNA-ITS 영역을 증폭한 다음, PCR을 하여 염기서열을 해독하였다. 각 균주의 배양적 특성, 포자의 형태와 크기 및 염기서열을 NCBI GenBank의 염기서열과 상동성을 비교하여 동정한 결과 6개 균주는 Colletotrichum acutatum으로, 5개 균주는 C. gloeosporioides로 동정되었다.
탄저병이 발생한 자두에서 11개 탄저병균을 순수 분리하여 병원성을 검정한 후 PDA에 접종하여 $25^{\circ}C$에서 7-10일 동안 배양하면서 각 균주의 균사 생장속도, colony의 특징과 색, 포자 형태 및 크기를 관찰하였다. 각 균주의 genomic DNA를 추출하여 rDNA-ITS 영역을 증폭한 다음, PCR을 하여 염기서열을 해독하였다. 각 균주의 배양적 특성, 포자의 형태와 크기 및 염기서열을 NCBI GenBank의 염기서열과 상동성을 비교하여 동정한 결과 6개 균주는 Colletotrichum acutatum으로, 5개 균주는 C. gloeosporioides로 동정되었다.
BACKGROUND: Although the filamentous fungal pathogen Colletotrichum species causing anthracnose disease on various fruits including peach, apple, persimmon and grape, there is no report on Japanese plum in Korea. METHODS AND RESULTS: In 2016, diseased fruits showing typical anthracnose symptoms of J...
BACKGROUND: Although the filamentous fungal pathogen Colletotrichum species causing anthracnose disease on various fruits including peach, apple, persimmon and grape, there is no report on Japanese plum in Korea. METHODS AND RESULTS: In 2016, diseased fruits showing typical anthracnose symptoms of Japanese plum were collected in market and ochards. Diseased tissue was cut off and disinfected subsequently with 70% ethanol for 1 min, and in 1% sodium hypochloride solution for 1 min, followed by three washes with sterile distilled water. The disinfected tissues were placed onto potato dextrose agar (PDA), and incubated at $25^{\circ}C$ in the dark for 5 to 7 days. For single-spore isolation, conidia were scraped off the plate using a loop, and suspended with 10 mL sterile distilled water. One hundred microliter of the conidial suspension was spread on PDA plates and incubated at $25^{\circ}C$. Finally, one germinated conidium was transferred onto PDA plates. Morphological and cultural characteries of colonies and spores of isolated Colletotrichum were observed after 7 to 10 days incubation on PDA. Molecular identification of isolates were analyzed by comparing rDNA-ITS gene sequences with NCBI GeneBank. CONCLUSION: Of eleven isolates of Colletotrichum isolated from anthracnose diseased Japanese plum fruits, six were identified as C. acutatum, and five as C. gloeosporioides based on diagnostic characteristics such as colony growth rate, shape and size of conidia, and rDNA-ITS sequences. This is the first report of Colletotrichum causing the anthracnose on Japanese plum in Korea.
BACKGROUND: Although the filamentous fungal pathogen Colletotrichum species causing anthracnose disease on various fruits including peach, apple, persimmon and grape, there is no report on Japanese plum in Korea. METHODS AND RESULTS: In 2016, diseased fruits showing typical anthracnose symptoms of Japanese plum were collected in market and ochards. Diseased tissue was cut off and disinfected subsequently with 70% ethanol for 1 min, and in 1% sodium hypochloride solution for 1 min, followed by three washes with sterile distilled water. The disinfected tissues were placed onto potato dextrose agar (PDA), and incubated at $25^{\circ}C$ in the dark for 5 to 7 days. For single-spore isolation, conidia were scraped off the plate using a loop, and suspended with 10 mL sterile distilled water. One hundred microliter of the conidial suspension was spread on PDA plates and incubated at $25^{\circ}C$. Finally, one germinated conidium was transferred onto PDA plates. Morphological and cultural characteries of colonies and spores of isolated Colletotrichum were observed after 7 to 10 days incubation on PDA. Molecular identification of isolates were analyzed by comparing rDNA-ITS gene sequences with NCBI GeneBank. CONCLUSION: Of eleven isolates of Colletotrichum isolated from anthracnose diseased Japanese plum fruits, six were identified as C. acutatum, and five as C. gloeosporioides based on diagnostic characteristics such as colony growth rate, shape and size of conidia, and rDNA-ITS sequences. This is the first report of Colletotrichum causing the anthracnose on Japanese plum in Korea.
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제안 방법
1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems,Thermo Fisher, USA)와 Primer는 PCR 증폭에서 사용한 것과 동일한 것을 사용하여 DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)를 사용하여 PCR하였다. PCR 반응이 끝난 후 dNTP와 반응물을 제거하여 정제한 후, ABI PRISM 3730XL Analyzer (96 capillary type,Hitachi, Japan)에 loading 하여 염기서열을 해독한 다음, 각 균주의 염기서열을 NCBI GenBank의 염기서열과 상동성을 비교하여 동정하였다.
PDA배지에서 7일 동안 자란 분리된 탄저병균 균총의 가장자리에서 떼어낸 5 mm의 균사 조각을 새로운 PDA에 접종한 다음 25℃에서 7일간 배양한 후 배양적 특성을 관찰하였으며, 포자의 형태적인 특징은 광학현미경(Nikon Eclipse 50i, Japan)상에서 포자의 형태 및 크기를 관찰하였다.
PDA에서 10일 동안 배양한 후 포자를 멸균수로 회수하여 4겹의 거즈로 거른 다음 포자현탁액(105 spore/mL)을 만들어 건전 자두(품종 : 추희)에 micro pipette (Gilson, P 100, France)으로 20 μL 씩 약 2 mm 깊이로 상처를 내면서 포자현탁액을 주입하여 접종하였다.
탄저병이 발생한 자두에서 11개 탄저병균을 순수 분리하여 병원성을 검정한 후 PDA에 접종하여 25℃에서 7-10일 동안 배양하면서 각 균주의 균사 생장속도, colony의 특징과 색, 포자 형태 및 크기를 관찰하였다. 각 균주의 genomic DNA를 추출하여 rDNA-ITS 영역을 증폭한 다음, PCR을 하여 염기서열을 해독하였다.
병원균을 순수 분리하기 위해 병반부와 건전부위의 경계 조직을 5 mm×5 mm 크기로 절단한 다음 70% Ethanol에 1분 간 침지한 다음, 1% NaOCl에 침지하여 표면 살균을 하고 멸균수로 3회 세척하였다.
본 연구에서는 2016년 5월부터 9월 사이 경북 군위 지역의 과원과 대구시 과일 시장에서 수집한 자두 과실에 발생한 탄저병 병반으로부터 병원균을 분리하였으며, 배양적 특성과 포자의 형태 및 rDNA-ITS 유전자 염기서열분석을 통해 병원균을 동정하였다.
순수 분리한 균주를 형태적동정과 유전자분석에 의한 동정을 한 균주들을 이용하여 병원성 검정을 하였다. PDA에서 10일 동안 배양한 후 포자를 멸균수로 회수하여 4겹의 거즈로 거른 다음 포자현탁액(105 spore/mL)을 만들어 건전 자두(품종 : 추희)에 micro pipette (Gilson, P 100, France)으로 20 μL 씩 약 2 mm 깊이로 상처를 내면서 포자현탁액을 주입하여 접종하였다.
염기서열 분석을 위해 증폭된 유전자를 BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems,Thermo Fisher, USA)와 Primer는 PCR 증폭에서 사용한 것과 동일한 것을 사용하여 DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)를 사용하여 PCR하였다. PCR 반응이 끝난 후 dNTP와 반응물을 제거하여 정제한 후, ABI PRISM 3730XL Analyzer (96 capillary type,Hitachi, Japan)에 loading 하여 염기서열을 해독한 다음, 각 균주의 염기서열을 NCBI GenBank의 염기서열과 상동성을 비교하여 동정하였다.
접종 후 플라스틱 상자에 넣어 25℃ 항온기에서 6일 동안 배양 후 병징 발현과 병반 직경을 측정하였다. 자두 1개당 2곳에 접종하였으며, 3반복으로 시험을 수행하였다.
자두 탄저병균을 분리하기 위해 이병과를 자두과원과 유통과정에 탄저병이 발생하는 과실을 채집하였다. 병원균을 순수 분리하기 위해 병반부와 건전부위의 경계 조직을 5 mm×5 mm 크기로 절단한 다음 70% Ethanol에 1분 간 침지한 다음, 1% NaOCl에 침지하여 표면 살균을 하고 멸균수로 3회 세척하였다.
5%)에 치상하여 25℃에서 배양하였다. 자라난 균사를 potato dextrose agar(PDA, Difco Laboratories)에 접종하여 탄저병균을 분리하였다. 분리한 탄저병균을 PDA에서 5-7일 동안 배양한 후 포자를 멸균수로 회수하여 4겹의 거즈로 거른 다음 포자현탁액(102 spores/mL)을 만들어 PDA에 100 μL를 도말하여 25℃에서 배양하였다.
대조는 동일한 방법으로 멸균수를 사용하였다. 접종 후 플라스틱 상자에 넣어 25℃ 항온기에서 6일 동안 배양 후 병징 발현과 병반 직경을 측정하였다. 자두 1개당 2곳에 접종하였으며, 3반복으로 시험을 수행하였다.
탄저병이 발생한 자두에서 11개 탄저병균을 순수 분리하여 병원성을 검정한 후 PDA에 접종하여 25℃에서 7-10일 동안 배양하면서 각 균주의 균사 생장속도, colony의 특징과 색, 포자 형태 및 크기를 관찰하였다. 각 균주의 genomic DNA를 추출하여 rDNA-ITS 영역을 증폭한 다음, PCR을 하여 염기서열을 해독하였다.
대상 데이터
2016년 5월에서 9월 동안 경북 군위군, 영천시, 경산시 등 3지역 6농가와 과실 유통 시장에서 탄저병이 발생한 자두 이 병과를 채집하였다. 자두 과원에서 탄저병 발생은 거의 관찰되지 않았으며, 조사 농가 과원에서 10개의 이병과를 채집할 수 있었다.
rDNA-ITS 영역을 증폭하기 위해 White 등(1990)이 사용한 primer ITS1 5’ (TCC GTA GGT GAA CCT GCGG) 3’와 ITS4 5’ (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) 3'를 사용하였다.
분리한 탄저병균을 PDA에서 5-7일 동안 배양한 후 포자를 멸균수로 회수하여 4겹의 거즈로 거른 다음 포자현탁액(102 spores/mL)을 만들어 PDA에 100 μL를 도말하여 25℃에서 배양하였다. 배양 2-3일 후 한 개의 포자에서 자란 단일 균총(colony)를 순수 분리하여 실험에 사용하였다.
이론/모형
균주를 PDA에 접종하여 25℃에서 7일간 배양 후 균사체를 수확하여 Lee와 Taylor(1990)의 방법으로 genomic DNA를 추출하였다.
성능/효과
분리 균주들을 PDA에 접종 후 25℃에서 7일 간 배양한 다음 균총의 특징과 균사 생장속도를 측정한 결과 4 group으로 분류할 수 있었다(Table 3). Humoosa에서 분리한 71501, 71502 균주와 Akihime (추희)에서 분리한 91901, 92205 균주는 균총의 색이 옅은 재색에서 짙은 재색으로 관찰되었으며, 배양기상에서의 분비색은 옅은 재색이었다(Fig. 3). 균사는10-11.
각 균주의 배양적 특성, 포자의 형태와 크기 및 염기서열을 NCBI GenBank의 염기서열과 상동성을 비교하여 동정한 결과 6개 균주는Colletotrichum acutatum으로, 5개 균주는 C. gloeosporioides로 동정되었다.
rDNA-ITS 영역을 증폭하여 해독한 염기서열을 NCBI GenBank의 염기서열과 비교하여 분석한 결과는 Table 5와 같다. 균사가 배양 7일 후 약 80 mm 생장하여 빠른 생장속도를 나타낸 71501, 71502, 91901, 92205 및 92240 균주는 colony의 특성이나 색은 각각 특이성이 있었지만 모두 NCBI에 등록된 C. gloeosporioides과 분석된 염기서열 부위가 99-100% 일치하였다. 배양 7일 후 균사가 43.
, 2015), 동일 종 내에서도 병원성과 배양적 특성 등이 다양한 것으로 보고되어 있다. 본 연구 결과 자두에서 분리한 탄저병균을 PDA에서 배양 후 colony의 특성, 균사 생장속도, 포자 형태 및 분자생물학적 분석에 의해 C. acutatum과 C. gloeosporioides으로 분류 동정하였다. 이러한 결과는 C.
, 1998). 분리 균주들을 PDA에 접종 후 25℃에서 7일 간 배양한 다음 균총의 특징과 균사 생장속도를 측정한 결과 4 group으로 분류할 수 있었다(Table 3). Humoosa에서 분리한 71501, 71502 균주와 Akihime (추희)에서 분리한 91901, 92205 균주는 균총의 색이 옅은 재색에서 짙은 재색으로 관찰되었으며, 배양기상에서의 분비색은 옅은 재색이었다(Fig.
2). 생성된 병반 직경은 기중균사를 생성하면서 부패시킨 71501, 71502, 91901 및 92205 균주가 92206 균주 등에 비해 더 크게 형성되어 병원성이 큰 것으로 평가되었다(Table 2).
병징의 특징은 발병 초기 과실 표면에 엷은 갈색의 작은 반점으로 시작해 점차 둥근 겹무늬로 확대되며 중앙부가 움푹 들어가고 병반 상에는 연분홍색의 병원균에서 분생 포자를 형성하는 것으로 일반 과실류의 탄저병 증상과 유사하였다. 시장에서 유통 중인 자두에서는 이병과가 농가 포장에서 보다 빈도가 높게 관찰되었으며, 병징은 재배포장에서 발생하는 병징과 다르게 윤문이 뚜렷하게 나타나지 않은 상태에서 부패가 진행되는 증상을 보였다(Fig. 1).
이병과에서 분리한 탄저병균(Table 1)을 추희 품종의 자두에 상처 접종하여 병원성을 검정한 결과 병징이 3일 후부터 발현되었으며, 6일 후 관찰한 결과 균주간 병징 발현에 차이가 있었다. 71501, 71502, 91901 및 92205 균주를 접종한 자두에서는 접종부위에 기중균사가 자라고 포자퇴가 대량으로 형성되면서 부패하였으나, 9226 균주 등 다른 균주들은 포자괴만 윤문으로 형성되면서 부패하였다(Fig.
후속연구
In vitro에서 C. gloeosporioides로 분류된 균주들의 병원성이 C. acutatum으로 분류된 균주들 보다 높은 것으로 나타났지만 실제 포장에서의 분리빈도는 조사되지 않았기 때문에 종에 따른 탄저병 발생 빈도의 조사와 탄저병 발생 시 농약을 사용하여 방제하기 위해서는 농약 고시가 우선인데,이를 위해 이들 탄저병균 균주들의 농약에 대한 감수성 정도에 대한 시험이 수행되어야 할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
탄저병 발생으로 나타날 수 있는 손실은?
Colletotrichum 속에 의한 탄저병은 전 세계적으로 채소 및 과수 등 다양한 작물에 발생하여 품질과 수량을 저하시켜경제적으로 큰 손실을 일으킨다(Jeger and Bailey, 1992; Perfect et al., 1999).
국내 자두나무의 재배면적 및 생산량의 변화는?
)는 장미과에 속하는 과수로 Japanese plum 또는 Chinese plum이라고 불리며, 우리나라를 비롯하여 중국, 일본, 미국, 호주 등에서 재배된 다. 통계연감에 의하면 우리나라의 자두 재배면적은 2015년 5,920 ha, 생산량은 67,810 ton으로 5,803 ha에서 64,816 ton을 생산하였던 2007년 이후 다소 증가하였다.
자두 과원의 탄저병의 특징은?
자두 과원에서 탄저병 발생은 거의 관찰되지 않았으며, 조사 농가 과원에서 10개의 이병과를 채집할 수 있었다. 병징의 특징은 발병 초기 과실 표면에 엷은 갈색의 작은 반점으로 시작해 점차 둥근 겹무늬로 확대되며 중앙부가 움푹 들어가고 병반 상에는 연분홍색의 병원균에서 분생 포자를 형성하는 것으로 일반 과실류의 탄저병 증상과 유사하였다. 시장에서 유통 중인 자두에서는 이병과가 농가 포장에서 보다 빈도가 높게 관찰되었으며, 병징은 재배포장에서 발생하는 병징과 다르게 윤문이 뚜렷하게 나타나지 않은 상태에서 부패가 진행되는 증상을 보였다(Fig.
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