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문제 정의
- 그러므로 본 연구는 꾸지나무 뿌리로부터 분리된 화합물인 BCB를 대상으로 암 예방 치료제로 사용하기 위한 기초자료를 제공하기 위하여 BCB가 HepG2 암세포의 증식 억제 및 apoptosis에 미치는 영향을 조사한 결과 매우 흥미로운 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 그런 다음 400 μL의 binding buffer를 첨가하여 flow cytome-try(Cytomics FC500, Beckman, Miami, FL, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 24시간이 지난 후 EZ-Cytox 시약 10 μL를 넣고 4시간 동안 배양한 후 microplate reader(Benchmark Plus, BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 480 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성은 대조군에 대한 생존율로 나타내 었다.
- 먼저, 간암 세포를 최종농도 5×104 cells/ mL가 되도록 96 well plate에 분주한 후, 37oC, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 다음, 꾸지나무 유래 화합물인 BCB를 0, 5, 10, 20, 40, 60 μM의 농도로 첨가하여 배양하였다.
- 세포독성 측정 − 세포독성은 EZ-Cytox cell viability assay kit(DAEIL lab)를 사용하여, 제조사에서 권장하는 실험방법에 따라서 측정하였다.
- Caspase inhibitor 처리에 의한 세포생존율 측정 − BCB 처리에 의한 HepG2 간암 세포의 사멸이 caspase에 의존하여 일어나는지를 확인하기 위해 z-VAD-fmk(R&D Systems)를 사용하여 확인하였다.
- BCB에 의한 HepG2 세포의 apoptosis 유도 − BCB에 의한 HepG2 세포증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지를 알아보기 위하여 annexin V/PI 이중 염색을 하여 유세포 분석기로 조사하였다.
- 암세포 증식 억제효과 − 먼저 HepG2 간암 세포를 대상으로 BCB가 세포증식에 미치는 효과를 조사하기 위하여 수용성 tetrazolium salt인 WST-1을 사용하여 조사하였다.
- ROS 측정 −ROS 생성은 carboxy-H2DCFDA(Invitrogen)를 사용하여 검출하였다.
- 1% Tween 20) buffer로 10분간 3번 세척하고 2차 항체를 처리하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TBS-T buffer로 10분간 3번 세척하고 enhanced chemiluminescence detection system(Amersham Pharmacia, Bucks, UK)를 사용하여 특정단백질의 발현을 분석하였다.
- 배양 1시간 후에 10 μM의 carboxy-H2DCFDA를 처리하여 20분간 배양하였다. 배양후 PBS로 세척하고 well에서 세포를 회수하여 flow cytometry(Cytomics FC500)를 이용하여 측정하였다.
- 활성화된 caspase-3가 세포의 증식과 생존에 중요한 역할을 하는 PARP를 절단하거나 직접적으로 핵의 응축과 DNA를 절단하여 apoptosis를 유도하는 것으로 알려져 있다.1,4,20,21) 따라서 BCB에 의해 일어난 apoptosis가 caspase cascade와 관련되어 있는지를 western blot을 통해 확인하였다. 그 결과 caspase8 단백질은 변화가 미미하였지만, caspase-9, -3의 protein levels은 BCB 20 μM 농도에서 감소되었으며, 활성화된 cleavead caspase-8, caspase-3의 protein levels은 BCB 20 μM 농도에서 증가하는 것을 확인하였다(Fig.
- Bcl-2및 Bax 발현 양상의 변화 − Bcl-2 family 단백질은 미토콘드리아를 통한 apoptosis에서 중요한 역할을 하며,22,23) 그 중 anti-apoptosis protein인 Bcl-2와 pro-apoptosis protein인 Bax의 발현을 조사하였다.
- 이는 BCB 처리에 의한 HepG2 세포의 apoptosis 유도에 caspase의 활성화가 연관되어 있음을 보여준다. 또한, BCB에 의한 세포사멸이 caspase-의존 경로를 통하여 일어나는지 general caspase inhibitor인 z-VAD-fmk를 투여하여 BCB에 의한 HepG2 세포의 세포사멸이 억제되는지 세포생존율을 측정하여 확인하였다. 그 결과 Fig.
- 25,26) 최근 많은 연구에 의하면 플라보노이드와 같은 천연물 유래 화합물이 ROS-미토콘드리아 의존적인 apoptosis 를 유도한다고 보고되었다.27-30) 따라서 ROS 생성이 BCB에 의한 apoptosis 유도와 관련되어 있는지 증명하기 위하여 먼저 BCB를 농도별로 처리하고 세포내 ROS 생성을 확인하였다. 그 결과 Fig.
- 7A). 게다가 BCB에 의한 세포사멸이 ROS 생성과 연관되어 있는지를 확인하기 위하여, ROS 소거제인 NAC를 전처리하여 BCB에 의한 HepG2 세포의 세포사멸이 억제되는지 세포생존율을 측정하여 확인하였다. 그 결과 Fig.
대상 데이터
- 1차 항체(caspase-3, caspase-9, caspase-8, cleaved caspase-3, cleaved caspase-8)는 Cell Signaling Technology사(Danvers, MA, USA)에서, β-tubulin은 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)는 BD Pharmingen 사(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- 10% FBS (fetal bovine serum, Life Technology, Carlsbad, CA, USA)와 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Life Technology) 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
- 세포배양 − 본 실험에 사용된 세포는 인체 유래 간암세포주인 HepG2 세포로 American Type Culture Collection (ATCC)(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다.
- Caspase 저해제인 z-VAD-fmk는 R&D systemes사(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다.
- 에서 보고한 것처럼, 한국생명공학연구원 천연물의약연구센터 류형원 박사가 꾸지나무 뿌리에서 분리하였고 친절히 제공하였다. 세포독성 및 세포사멸 분석 kit는 대일 랩(Seoul, Korea)과 MBL International사(Nagoya, Japan)에서 각각 구입하였다. 1차 항체(caspase-3, caspase-9, caspase-8, cleaved caspase-3, cleaved caspase-8)는 Cell Signaling Technology사(Danvers, MA, USA)에서, β-tubulin은 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)는 BD Pharmingen 사(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- 2차 항체 anti-mouse IgG HRP-conjugated 항체는 Zymed사(San Francisco, CA, USA)에서 구입하였고, anti-rabbit IgG HRP-conjugated 항체와 5-(and-6)-carboxy2′7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate(carboxy-H2DCFDA)는 Invitrogen사(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. Caspase3 분석 kit와 N-acetylcysteine(NAC) 및 기타 분석급 시약은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
- 2차 항체 anti-mouse IgG HRP-conjugated 항체는 Zymed사(San Francisco, CA, USA)에서 구입하였고, anti-rabbit IgG HRP-conjugated 항체와 5-(and-6)-carboxy2′7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate(carboxy-H2DCFDA)는 Invitrogen사(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 통계분석−모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 대조군과 실험군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 SPSS statistics program(version 22 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 one-way ANOVA를 이용한 분산분석 후 Duncan 사후 검정을 실시하였으며, 조사 항목들 간의 유의성 검정은 p<0.05 수준에서 실시하였다.
이론/모형
- Caspase-3 활성 분석 − Caspase-3 활성은 caspase-3 colorimetric assay kit(Sigma-Aldrich)를 사용하여, 제조사에서 권장하는 실험방법에 따라 측정하였다.
- 세포사멸 분석−세포사멸은 MEBCYTO apoptosis kit(MBL International)를 사용하여, 제조사에서 권장하는 실험방법에 따라서 측정하였다.
성능/효과
- 4) 또한 최근에는 암세포에만 선택적으로 작용할 수 있는 항암제 개발에 천연물을 활용하는 연구들이 증가하고 있다.3) 일명 프로그램화된 세포 사멸이라 불리는 apoptosis는 세포의 항상성 유지에서 매우 중요한 역할을 하며, 세포질 및 염색질 응축, 세포막 수포화 현상, 핵의 단편화 현상, apoptotic body의 형성 및 caspase 활성화 등과 같은 형태적 또는 생화학적인 변화가 수반되어지며, 이러한 과정은 세포 내부의 정교한 신호전달에 의해 조절되어진다.5,6)
- 그 결과 BCB에 의한 apoptosis 유발을 확인할 수 있었고, BCB 20 μM을 처리하였을 때 미처리 대조군 2.8%에 비해 17.3%로 증가되는 것을 확인하였다(Fig. 2B and 2C).
- HepG2 간암 세포에 BCB를 5-60 μM의 농도로 처리하여 24 시간 후에 확인한 결과 BCB의 HepG2 세포에 대한 증식 억제 효과는 5 μM에서 98.02%, 10 μM에서 85.81%, 20 μM에서 42.28%, 40 μM에서 24.76%, 60 μM에서 18.85%로 농도 의존적으로 세포증식 억제 효과가 있었다(Fig. 2A).
- 그 결과 caspase8 단백질은 변화가 미미하였지만, caspase-9, -3의 protein levels은 BCB 20 μM 농도에서 감소되었으며, 활성화된 cleavead caspase-8, caspase-3의 protein levels은 BCB 20 μM 농도에서 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 3A).
- 3A). 또한 caspase3의 활성을 조사한 결과 BCB 처리 후에 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). 이는 BCB 처리에 의한 HepG2 세포의 apoptosis 유도에 caspase의 활성화가 연관되어 있음을 보여준다.
- 그 결과 Fig. 4에 나타낸 바와 같이 BCB 처리 전에 20 μM의 z-VAD-fmk를 1시간 전 처리한 군은 BCB 단독 처리 군과 비교하여 HepG2 세포의 세포생존율이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다(p<0.001).
- 그 중 anti-apoptosis protein인 Bcl-2와 pro-apoptosis protein인 Bax의 발현을 조사하였다. 그 결과 HepG2 세포에 BCB를 처리하면 Bcl-2의 발현은 감소하였고, Bax의 발현은 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 5A). 또한 apoptosis에서 Bax와 Bcl-2의 비율은 세포의 민감성을 나타내는 중요한 인자로 알려져 있다.
- 그 결과 Fig. 7B에 나타낸 바와 같이 BCB 처리 전에 2 mM의 NAC를 1시간 전 처리한 군은 BCB 단독 처리 군과 비교하여 HepG2 세포의 세포생존율이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다(p<0.001).
- 27-30) 따라서 ROS 생성이 BCB에 의한 apoptosis 유도와 관련되어 있는지 증명하기 위하여 먼저 BCB를 농도별로 처리하고 세포내 ROS 생성을 확인하였다. 그 결과 Fig. 6에 나타낸 바와 같이 ROS 생성이 BCB 처리 농도의존적으로 크게 증가함을 확인하였고, 양성 대조군으로 사용한 과산화수소 1 mM 처리군과 비교할 때 매우 낮은 농도에서 ROS를 유발함을 알 수 있었다. 그러나 ROS 소거제인 NAC를 전처리하였을 경우 BCB에 의해 생 성된 ROS가 감소함을 확인할 수 있었다(Fig.
- 연구는 간암 세포인 HepG2에서 꾸지나무 유래 화합물인 BCB의 암세포 증식 억제 및 그 기전을 조사하였다. BCB는 HepG2 세포의 성장을 억제하였고, caspase-8, -9, -3의 활성화, PARP의 절단, Bcl-2의 발현 억제, Bax의 발현 증가에 의해 apoptosis를 유도함을 확인할 수 있었다. 또한 BCB에 의한 apoptosis 유도는 ROS 생성과 관련되어 있음을 확인하였다.
- BCB는 HepG2 세포의 성장을 억제하였고, caspase-8, -9, -3의 활성화, PARP의 절단, Bcl-2의 발현 억제, Bax의 발현 증가에 의해 apoptosis를 유도함을 확인할 수 있었다. 또한 BCB에 의한 apoptosis 유도는 ROS 생성과 관련되어 있음을 확인하였다. 이상의 결과를 종합해볼 때 BCB는 HepG2 간암 세포의 apoptosis를 유도하는 것으로 나타나 BCB의 항암효과 가능성을 제시하였고, 암 예방 기능성 후보 소재로서 활용이 가능할 것으로 사료된다.
후속연구
- 꾸지나무 껍질 유래 prenylflavone 계열 화합물은 유방암 세포의 성장 억제가 우수하고,18) 꾸지나무 열매 유래 alkaloid 성분은 피부암, 간암, 자궁암 세포의 성장 억제에 뛰어나며,19) 최근에 꾸지나무 뿌리 유래 화합물인 kazinol A는 방광암세포의 성장 억제에 뛰어나다고 보고되었다.17) 본 연구 결과 또한 꾸지나무 유래 화합물인 BCB가 HepG2 간암 세포의 성장 억제가 우수하므로 간암 치료 후보 소재로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 BCB에 의한 apoptosis 유도는 ROS 생성과 관련되어 있음을 확인하였다. 이상의 결과를 종합해볼 때 BCB는 HepG2 간암 세포의 apoptosis를 유도하는 것으로 나타나 BCB의 항암효과 가능성을 제시하였고, 암 예방 기능성 후보 소재로서 활용이 가능할 것으로 사료된다.
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