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문제 정의
- 그러나, 본 연구에서는 서론에서 밝힌 바와 같이 먹는샘물 자체의 미생물 분포실태를 조사하고자 하는 것이 아니었으며, 음용하는 과정 중에 소비자의 구강 또는 환경으로부터 오염된 먹는샘물이 여러 보관조건에서 병원성 지표 미생물 등 미생물학적 수질이 어떻게 변화하는지 알아보고자 하는 것이 주목적이었다. 이에 대한 결과는 비교할 만한 보고가 없었다.
- 따라서 본 연구에서는 먹는 샘물을 개봉하고 음용 과정에서 구강과 환경에 노출된 후 보관 상태에 따라 일반세균과 병원성 지표 세균의 증식이 어떻게 변화하는지를 알아보고자 시중에 판매되고 있는 먹는샘물을 선정하여 동일량의 침을 주입한 후 시간 경과에 따른 세균의 변화를 확인하고자 하였다. 본 연구는 소비자들에게 먹는샘물을 보다 더 안전하게 음용할 수 있는 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
- 따라서 본 연구에서는 먹는 샘물을 개봉하고 음용 과정에서 구강과 환경에 노출된 후 보관 상태에 따라 일반세균과 병원성 지표 세균의 증식이 어떻게 변화하는지를 알아보고자 시중에 판매되고 있는 먹는샘물을 선정하여 동일량의 침을 주입한 후 시간 경과에 따른 세균의 변화를 확인하고자 하였다. 본 연구는 소비자들에게 먹는샘물을 보다 더 안전하게 음용할 수 있는 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
제안 방법
- 동일한 브랜드의 먹는샘물을 10개의 실험군을 대상으로 냉장(4oC), 실온(20~25oC), 중온(36oC)에 각각 보관하면서 시간의 경과에 따른 미생물학적 수질변화를 알아보았다. 10개의 실험군은 시료의 균질화와 최악의 조건을 검토하기 위해 10명의 개인으로부터 5~6 mL 정도의 침을 제공받아 일정량(0.1mL)을 주입 하였으며, 비교를 위해 침 주입을 하지는 않고 개봉만 한 시료를 대조군으로 사용하였다. 또한 일반적 음용조건을 검토하기 위해 일부 시료는 개봉하여 입을 대고 마시는 일반적인 음용을 실시한 후 해당 시료는 실온보관 조건에서만 보관하여 조사를 수행하였다.
- 아황산환원혐기성포자형 성균은 시료 50 mL를 75oC에서 10분간 정치하여 아포를 형성한 세균만 살아남도록 처리 후 differential reinforced clostridial media에 접종하고 시료와 배지를 혼합한 후 미리 멸균한 액체파라핀을 소량 주입하여 배지표면을 막아 혐기성 상태가 되도록 한 다음 35oC에서 48시간 배양하였다. 그리고 배지가 검게 변하게 되면 양성으로 판정하였다. 살모넬라와 쉬겔라는 시료 250 mL를 여과하여 여과막을 Selenite broth에 넣어 37oC에서 24시간 배양, 증균한 후 살모넬라는 Bismuth sulfite agar에 접종하고 35oC에서 48시간 배양하여 가장자리에 하얀 얇은 테를 두른 검고 반짝이는 집락을 분리하였고, 쉬겔라는 Xylose Lysine Desoxycholate agar에 접종하여 35oC, 24시간 배양하여 붉은색 집락을 분리한 후, tryptic soyagar에 이식하여 생성된 집락을 MALDI-TOF 질량분석기를 사용하여 동정하였다.
- 분원성연쇄상구균은 azide dextrose broth에서 48시간 배양 후 혼탁이 있는 경우 enterococcosel agar에 이식하여 35oC에서 24시간 배양하였으며, 집락주위가 갈색으로 변하고, 집락이 흑갈색으로 변하였을 경우 양성으로 판정하였다. 녹농균은 Asparazine 배지에 접종 후 35oC에서 48시간 배양하여 자외선램프로 365 nm의 파장을 조사하여 녹색을 띨 경우 Acetamide agar에 접종하여 35oC 24시간 배양하고 적자색을 나타내는 경우 녹농균 양성으로 판정하였다. 아황산환원혐기성포자형 성균은 시료 50 mL를 75oC에서 10분간 정치하여 아포를 형성한 세균만 살아남도록 처리 후 differential reinforced clostridial media에 접종하고 시료와 배지를 혼합한 후 미리 멸균한 액체파라핀을 소량 주입하여 배지표면을 막아 혐기성 상태가 되도록 한 다음 35oC에서 48시간 배양하였다.
- 먹는 샘물은 국내에서 생산되어 시중에 판매되고 있는 동일한 한 브랜드의 제품만을 사용하였는데, 이는 본 조사의 목적이 먹는샘물 자체의 미생물 품질조사를 비교하고자 함이 아니라 개봉 후 음용과정에서 구강 또는 환경으로부터 유래하는 세균으로 인해 먹는샘물의 미생물학적 품질변화를 보고자 함이 주목적이었기 때문이다. 동일한 브랜드의 먹는샘물을 10개의 실험군을 대상으로 냉장(4oC), 실온(20~25oC), 중온(36oC)에 각각 보관하면서 시간의 경과에 따른 미생물학적 수질변화를 알아보았다. 10개의 실험군은 시료의 균질화와 최악의 조건을 검토하기 위해 10명의 개인으로부터 5~6 mL 정도의 침을 제공받아 일정량(0.
- 1mL)을 주입 하였으며, 비교를 위해 침 주입을 하지는 않고 개봉만 한 시료를 대조군으로 사용하였다. 또한 일반적 음용조건을 검토하기 위해 일부 시료는 개봉하여 입을 대고 마시는 일반적인 음용을 실시한 후 해당 시료는 실온보관 조건에서만 보관하여 조사를 수행하였다. 실험조건은 Fig.
- 미생물 분석항목으로는 일반세균(저온일반세균, 중온일반세균)에 대하여 초기 일주일 동안은 12시간마다 분석하였고, 이후에는 24시간마다 28일간 분석하여 시간에 따른 수질변화를 조사하였고, 병원성 지표 세균 6종(총대장균군, 분원성연쇄상구균, 녹농균, 아황산환원혐기성포자형성균, 살모넬라균, 쉬겔라균)은 침을 접종한 직후인 초기시료와 28일 후의 최종 시료를 분석하였다.
- 0oC에서 72시간 배양하였고, 중온 일반세균은 표준한천배지(Plate count agar)를 사용하여 35oC에서 24시간동안 배양하여 나타나는 집락을 계수하여 집락 형성단위(Colony Forming Unit; CFU/mL)로 표현하였고, 병원성 지표세균 중 총대장균군은 β-galactosidase의 활성을 이용하여 노란색의 발색유무로 판정하였다. 분원성연쇄상구균은 azide dextrose broth에서 48시간 배양 후 혼탁이 있는 경우 enterococcosel agar에 이식하여 35oC에서 24시간 배양하였으며, 집락주위가 갈색으로 변하고, 집락이 흑갈색으로 변하였을 경우 양성으로 판정하였다. 녹농균은 Asparazine 배지에 접종 후 35oC에서 48시간 배양하여 자외선램프로 365 nm의 파장을 조사하여 녹색을 띨 경우 Acetamide agar에 접종하여 35oC 24시간 배양하고 적자색을 나타내는 경우 녹농균 양성으로 판정하였다.
- 그리고 배지가 검게 변하게 되면 양성으로 판정하였다. 살모넬라와 쉬겔라는 시료 250 mL를 여과하여 여과막을 Selenite broth에 넣어 37oC에서 24시간 배양, 증균한 후 살모넬라는 Bismuth sulfite agar에 접종하고 35oC에서 48시간 배양하여 가장자리에 하얀 얇은 테를 두른 검고 반짝이는 집락을 분리하였고, 쉬겔라는 Xylose Lysine Desoxycholate agar에 접종하여 35oC, 24시간 배양하여 붉은색 집락을 분리한 후, tryptic soyagar에 이식하여 생성된 집락을 MALDI-TOF 질량분석기를 사용하여 동정하였다.
- 녹농균은 Asparazine 배지에 접종 후 35oC에서 48시간 배양하여 자외선램프로 365 nm의 파장을 조사하여 녹색을 띨 경우 Acetamide agar에 접종하여 35oC 24시간 배양하고 적자색을 나타내는 경우 녹농균 양성으로 판정하였다. 아황산환원혐기성포자형 성균은 시료 50 mL를 75oC에서 10분간 정치하여 아포를 형성한 세균만 살아남도록 처리 후 differential reinforced clostridial media에 접종하고 시료와 배지를 혼합한 후 미리 멸균한 액체파라핀을 소량 주입하여 배지표면을 막아 혐기성 상태가 되도록 한 다음 35oC에서 48시간 배양하였다. 그리고 배지가 검게 변하게 되면 양성으로 판정하였다.
- 일반세균은 평판집락법을 사용하였는데, 저온일반세균은 저온 일반세균 배지(R2A 배지)를 사용하여 21.0oC에서 72시간 배양하였고, 중온 일반세균은 표준한천배지(Plate count agar)를 사용하여 35oC에서 24시간동안 배양하여 나타나는 집락을 계수하여 집락 형성단위(Colony Forming Unit; CFU/mL)로 표현하였고, 병원성 지표세균 중 총대장균군은 β-galactosidase의 활성을 이용하여 노란색의 발색유무로 판정하였다.
- 분석수행 중 추정 양성집락은 MALDI-TOF 질량분석기(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)(ASTA, MicroIDSys®)를 사용하여 최종 확인하였다. 추정 또는 확정시험에서 양성 추정된 집락을 확인시험 배지인 tryptic soy agar에 이식하여 나타난 콜로니를 채취하여 MALDI plate의 슬라이드 상에 도말한 후, 그 위에 70 % 포름산 용액을 1.5 uL 올려 건조 후 CHCA Matrix 용액을 1.5 uL 떨어뜨렸다, 그 후 기기의 자동 분석 기능인 Auto Run 방법으로 분석하였다.
대상 데이터
- 10개의 실험군에서의 병원성 지표 미생물의 검출결과를 나타내었다(Table 1). 먹는샘물의 병원성 지표 미생물은 총대장균군, 분원성연쇄상구균, 녹농균, 아황산환원혐기성포자형성균, 살모넬라, 쉬겔라 등 6종을 대상으로 하였다. 이들 병원성 지표 미생물은 침을 주입한 직후의 초기실험에서 조사대상 6종 모두 불검출을 나타내었다.
- 또한 일반적 음용조건을 검토하기 위해 일부 시료는 개봉하여 입을 대고 마시는 일반적인 음용을 실시한 후 해당 시료는 실온보관 조건에서만 보관하여 조사를 수행하였다. 실험조건은 Fig. 1과 같으며, 일반세균과 6종의 병원성 지표 세균에 대한 10개의 실험군과 그의 대조군을 각각 3가지 보관 조건에서 보관하고, 추가로 실제음용조건을 고려한 10개의 먹는샘물을 포함하여 총 430개의 먹는샘물을 사용하였다(Fig. 1).
데이터처리
- 박스에 연결된 라인의 양 끝은 특이점(outlier)을 제외한 데이터들의 최솟값과 최댓값을 의미하고, 특이점이 존재하는 경우는 라인의 양 끝 바깥에 동그란 점으로 나타난다. 또한 대조군과 실험군의 통게적 차이를 알아보기 위해 시그마플롯 프로그램(SigmaPlot 13.0, 시그마소프트)을 사용하여 ANOVA(Analysis of variance) 통계분석을 수행하였다.
이론/모형
- 미생물 분석 방법은 먹는물수질공정시험법을 기초로 하여 분석하였다. 일반세균은 평판집락법을 사용하였는데, 저온일반세균은 저온 일반세균 배지(R2A 배지)를 사용하여 21.
- 분석수행 중 추정 양성집락은 MALDI-TOF 질량분석기(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)(ASTA, MicroIDSys®)를 사용하여 최종 확인하였다.
성능/효과
- 또한 ANOVA를 통해 대조군과 실험군의 차이를 통계 분석한 결과, 냉장 보관은 P<0.01, 중온보관은 P<0.001로 대조군과 침을 넣은 실험군이 유의한 차이가 있다고 나타났지만, 실온보관의 경우 P값이 0.05보다 크게 나타나 대조군과 실험군의 유의한 차이가 없다.
- 그러나 10개의 실험군 중 5개의 실험군의 최종시료에서 총대장균군이 양성으로 검출되었으며, 효소발색법으로 분석하여 시료 자체가 액체상태이었으므로 별도로 고체배지에 배양하여 콜로니를 취한 후 동정을 실시하지는 않았다. 또한 조사대상 중 1개 실험군의 냉장, 실온 보관된 최종시료에서 녹농균 추정 콜로니가 생성되어 Maldi TOF 질량분석기로 동정한 결과 최종 녹농균으로 확인되었다.
- 또한, 음용과정에서 각 개인의 구강으로부터 유래한 녹농균 등의 병원성 지표세균이 증식할 가능성이 있음이 확인되었다. 이번 조사에서 검출된 병원성 지표세균 중 일부 시료에서 총대장균군과 녹농균이 검출된 것으로 확인되었다.
- 본 연구의 결과에서 모든 보관 조건에서 시간이 경과함에 따라 저온 일반세균은 증가하거나 유지하는 경향을 나타내었으며, 중온일반세균은 실온과 중온보관 조건에서 실험기간 내 높은 수준의 개체수를 나타내었으며, 냉장보관 시에는 시간경과에 따라 낮아지는 경향을 나타내었으나, 전반적으로 비교적 높은 수준을 나타내었다.
- 냉장 보관된 대조군의 평균검출범위는 508~11,590 CFU/mL이었고, 실온 보관된 대조군은 380~12,220 CFU/mL, 중온 보관된 대조군은 76~4,760 CFU/mL의 범위를 나타내었다. 실험군에서는 대조군과 비교하여 저온 일반세균의 변동 폭이 보다 더 크게 나타났으며, 보관 조건에 상관없이 시간이 경과함에 따라 개체수가 10일째까지 증가한 이후 유지하거나 소폭의 감소 경향을 나타내었다. 실험군의 냉장 보관 시료는 평균검출범위가 275~65,220 CFU/mL, 실온 보관 시료는 320~171,238 CFU/mL, 중온 보관 시료는 314~155,624 CFU/mL으로 나타났다(Fig.
- 실험군에서는 대조군과 비교하여 저온 일반세균의 변동 폭이 보다 더 크게 나타났으며, 보관 조건에 상관없이 시간이 경과함에 따라 개체수가 10일째까지 증가한 이후 유지하거나 소폭의 감소 경향을 나타내었다. 실험군의 냉장 보관 시료는 평균검출범위가 275~65,220 CFU/mL, 실온 보관 시료는 320~171,238 CFU/mL, 중온 보관 시료는 314~155,624 CFU/mL으로 나타났다(Fig. 2). 일반적인 음용조건의 실험군은 평균검출범위가 438~9,613 CFU/mL로 대체적으로 대조군과 유사한 경향을 나타내었다(Fig.
- 음용 중 구강과 접촉한 먹는샘물의 미생물학적 수질에 대해 대조군과 실험군의 차이를 통계 조사한 결과, 저온일반세균은 냉장보관과 중온보관에서 유의한 차이가 나타났으나, 실온보관할 경우와 대조군과 일반적인 음용조건에서는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다.
- 먹는샘물의 병원성 지표 미생물은 총대장균군, 분원성연쇄상구균, 녹농균, 아황산환원혐기성포자형성균, 살모넬라, 쉬겔라 등 6종을 대상으로 하였다. 이들 병원성 지표 미생물은 침을 주입한 직후의 초기실험에서 조사대상 6종 모두 불검출을 나타내었다. 최종실험에서 또한 분원성연쇄상구균, 아황산환원성혐기성포자형성균, 살모넬라, 쉬겔라는 불검출 되었다.
- 또한, 음용과정에서 각 개인의 구강으로부터 유래한 녹농균 등의 병원성 지표세균이 증식할 가능성이 있음이 확인되었다. 이번 조사에서 검출된 병원성 지표세균 중 일부 시료에서 총대장균군과 녹농균이 검출된 것으로 확인되었다. 그러나, 이는 먹는샘물 자체에서 기인한 것은 아니며, 소비자의 구강, 침으로부터 기인한 것이며 침을 주입한 직후의 초기 시료에서는 검출되지 않았고, 최종시료 중 병원성 지표 세균이 검출된 시료에서도 모든 보관조건에서 검출되지 않은 것은 오염된 초기시료에서 병원성 지표세균이 많지 않았던 것으로 판단된다.
- 10개 실험군의 일반세균 변화에 대한 결과 통계를 시간 경과별로 나타내었다. 저온 일반세균은 대조군에서 전반적으로 일주일째까지는 증가하다가 그 이후 냉장 및 중온보관에서는 개체수를 유지하거나 소폭 감소하는 경향을 나타내었으며, 실온보관에서는 현저하게 감소하는 경향을 나타내었다. 냉장 보관된 대조군의 평균검출범위는 508~11,590 CFU/mL이었고, 실온 보관된 대조군은 380~12,220 CFU/mL, 중온 보관된 대조군은 76~4,760 CFU/mL의 범위를 나타내었다.
- 중온일반세균은 모든 조건에서 대조군과 실험군 간에 유의한 차이를 나타내었으며, 대조군과 일반적 음용조건에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다. 한편, 일부 침을 주입한 시료에서는 녹농균 등 병원성 지표세균이 나타나 가급적 개봉 후에는 빨리 소비하거나 개인용 컵 등을 이용하고, 다른 사람과 교차 음용을 하지 않는 것이 바람직한 먹는샘물의 음용 방법이라고 할 수 있다.
- 총대장균군, 분원성연쇄상구균, 녹농균, 살모넬라, 쉬겔라는 250 mL, 아황산환원혐기성포자형성균은 50 mL를 분석하여 검출, 불검출로 표현하였다.
- 이들 병원성 지표 미생물은 침을 주입한 직후의 초기실험에서 조사대상 6종 모두 불검출을 나타내었다. 최종실험에서 또한 분원성연쇄상구균, 아황산환원성혐기성포자형성균, 살모넬라, 쉬겔라는 불검출 되었다. 그러나 10개의 실험군 중 5개의 실험군의 최종시료에서 총대장균군이 양성으로 검출되었으며, 효소발색법으로 분석하여 시료 자체가 액체상태이었으므로 별도로 고체배지에 배양하여 콜로니를 취한 후 동정을 실시하지는 않았다.
- 그러나, 실험군에서는 검출경향이 대조군과 상당히 다르게 나타났다. 침을 주입한 실험군은 초기시료부터 높은 개체수를 나타내었으며 저온보관에서는 점차 감소하는 경향이었으나, 실온 및 중온보관에서는 지속적으로 높은 개체수를 나타내었으며, 실험군마다 중온 일반세균의 변동 폭이 매우 크게 나타났다. 냉장 보관 시료는 평균 검출 범위 146~15,520 CFU/mL, 실온 보관 시료는 164~127,469CFU/mL, 중온 보관 시료는 134~339,757 CFU/mL의 범위를 나타내었다(Fig.
- 한편, 저온 및 중온 일반세균에 대해 각 보관조건 별로 대조군과 실험군을 ANOVA 분석한 결과, 일반적인 음용조건에서는 저온 일반세균, 중온 일반세균 모두 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 침을 주입한 실험군은 대부분의 모든 조건에서 대조군과 유의한 차이를 나타내었다. 이는 어느 정도 예상된 결과로 일반적인 음용조건의 경우는 구강으로부터 세균 유입이 크지 않으나, 본 실험에서 일정한 조건을 제공하고 최악의 경우를 고려하기 위해 실험군에 침을 주입하였으므로 구강의 많은 세균들이 먹는샘물에 오염되어 보관조건에 따라 세균이 크게 증식한 것으로 판단된다.
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