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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 흰쥐에 인위적으로 유발된 무용성 근 위축에 대해 두충 투여가 미치는 영향을 검증하기 위하여 2주 동안 흰쥐의 왼쪽 뒷다리 발목관절을 고정시키고 두충 추출액를 경구 투여한 후 체중 변화, 좌우 비복근 근육의 무게 및 근 섬유의 변화를 측정하였다. 그 결과, 두충이 무용성 근 위축 손상에 대해 유의한 보호효과를 나타내어 이를 보고하는 바이다.
- 따라서, 본 연구에서는 흰쥐에 인위적으로 유발된 무용성 근 위축에 대해 두충 투여가 미치는 영향을 검증하기 위하여 2주 동안 흰쥐의 왼쪽 뒷다리 발목관절을 고정시키고 두충 추출액를 경구 투여한 후 체중 변화, 좌우 비복근 근육의 무게 및 근 섬유의 변화를 측정하였다. 그 결과, 두충이 무용성 근 위축 손상에 대해 유의한 보호효과를 나타내어 이를 보고하는 바이다.
- 본 연구는 무용성 근 위축 손상에서 두충이 미치는 방어효과를 검증하기 위한 실험으로, 무용성 근 위축을 유도하기 위하여 흰쥐의 발목관절을 2주간 붕대로 고정시키고 두충 물추출물을 경구 투여한 후, 2주 후에 실험동물의 체중 변화, 비복근 무게, 비복근의 근섬유 단면적 변화를 관찰한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 현미경으로 관찰한 근섬유 직경의 변화를 수치화하기 위하여, 본 연구에서는 영상분석을 통해 비복근의 근섬유 단면적을 측정하여 비교하였다. 그 결과 대조군에서는 오른쪽에 대한 왼쪽의 근육 단면적의 평균 감소량은 15.
제안 방법
- 오른쪽 발목에는 아무런 처치도 하지 않아서 자유롭게 움직이도록 하였다. EU군에는 매일 오전 정해진 시간에 두충 추출물을 1회 경구투여 하였으며, 대조군에는 동일량의 생리식염수를 같은 방식으로 투여하였다.
- 2, USA)를 이용하여 근육 단면의 면적(cross section area)을 측정하였다. 각 실험군의 근섬유의 평균 면적은 각각의 근육조직에서 최소 30개 이상의 근섬유를 관찰하여 측정하였다.
- 실험 개시 2주 후 실험동물을 안락사 시켜 부검을 통해 실험동물의 오른쪽 후지로부터 비복근을 분리 채취하여 중량을 측정하였다. 근육의 무게는 실험동물의 체중을 측정한 다음 체중 100 g당 근육 무게를 계산하였다.
- 근육의 변화를 좀 더 구체적으로 확인하기 위해 비복근을 8 ㎛ 두께로 냉동 절편하여 H&E 염색을 통해 근육 단면적의 변화를 관찰하였다.
- 동결 보관된 근육조직 중에 비복근의 중앙부분(mid-belly)을 연속적으로 8 ㎛ 두께로 냉동절편하여 헤마톡실린-에오신 염색법(hematoxylin and eosin staining, H&E staining)을 시행 후, 현미경 하에서 관찰하고 사진 촬영 후 영상분석용 소프트웨어(Axiovision LE software, Carl Zeiss Vision, ver 4.2, USA)를 이용하여 근육 단면의 면적(cross section area)을 측정하였다.
- 따라서, 본 연구에서도 임상에서 흔히 나타나는 무용성 근위축의 양상과 유사한 동물모델을 이용하여 실험동물에 후지고정법을 채택하였으며, 흰쥐의 왼쪽 발목관절을 2주간 붕대로 고정시킴으로 종아리근육의 위축을 유발하고 비복근의 변화를 관찰하였다. 동시에 두충 추출물을 경구 투여하여 근 위축에 미치는 효과를 검증하였다. 그 결과, 2주간의 평균 체중의 변화에 있어서는 두충을 투여한 EU군과 동일량의 생리식염수를 투여한 대조군 간에 유의한 차이는 발견되지 않았다.
- 따라서, 본 연구에서도 임상에서 흔히 나타나는 무용성 근위축의 양상과 유사한 동물모델을 이용하여 실험동물에 후지고정법을 채택하였으며, 흰쥐의 왼쪽 발목관절을 2주간 붕대로 고정시킴으로 종아리근육의 위축을 유발하고 비복근의 변화를 관찰하였다. 동시에 두충 추출물을 경구 투여하여 근 위축에 미치는 효과를 검증하였다.
- 실험동물의 체중을 측정하기 위해 실험기간 동안 매일 오전 동일한 시간에 측정하였으며, 실험 마지막 날에는 부검 직전에 측정하였다. 실험 개시 2주 후 실험동물을 안락사 시켜 부검을 통해 실험동물의 오른쪽 후지로부터 비복근을 분리 채취하여 중량을 측정하였다. 근육의 무게는 실험동물의 체중을 측정한 다음 체중 100 g당 근육 무게를 계산하였다.
- 실험 시작일로부터 2주 후 흰쥐의 양쪽 비복근을 적출하여 각 무게를 측정하고 체중 100 g당 근육 무게를 환산하여 좌․우 근육 및 각각의 군 간의 근육 무게 변화를 비교하였다. 그 결과, 대조군의 경우 자유롭게 움직임이 가능하게 한 오른쪽 비복근은 506.
- 실험군을 분리하기 위해 흰쥐를 무작위로 10마리씩 나누어 EU(Eucommia ulmoides)군에는 두충을 투여하였고 대조군에는 동일량의 생리식염수를 투여하였으며, 물과 사료는 모든 군에서 전체 실험기간 동안 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
- 실험동물의 체중을 측정하기 위해 실험기간 동안 매일 오전 동일한 시간에 측정하였으며, 실험 마지막 날에는 부검 직전에 측정하였다. 실험 개시 2주 후 실험동물을 안락사 시켜 부검을 통해 실험동물의 오른쪽 후지로부터 비복근을 분리 채취하여 중량을 측정하였다.
- 시중에서 구매한 두충 200 g을 증류수 2 L와 함께 전 탕기에서 2시간 동안 전탕한 다음 여과액을 감압 및 농축하여 물추출엑기스를 얻었다. 최종 투여량은 60 ㎏ 일반 성인의 하루 20 g 복용량으로 환산하여, 흰쥐 체중 100 g당 33.3 ㎎를 경구 투여하였다.
- 흰쥐의 무용성 근 위축을 유발하기 위한 방법으로, 흰쥐의 왼쪽 발목관절을 완전히 신전(extension) 시킨 후 고정테이프(casting tape, type 82002A, 3M, USA)를 이용하여 발목관절을 고정하였다. 오른쪽 발목에는 아무런 처치도 하지 않아서 자유롭게 움직이도록 하였다.
대상 데이터
- 본 연구를 위하여 10주령, 약 250 g 전․후의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐 20마리를 사용하였고 (주)샘타코(대한민국)에서 구입하였다. 흰쥐의 사육환경은 조명 12시간 명/암, 온도 23∼24 ℃, 습도 40∼60 %로 자동 유지되었다.
- 시중에서 구매한 두충 200 g을 증류수 2 L와 함께 전 탕기에서 2시간 동안 전탕한 다음 여과액을 감압 및 농축하여 물추출엑기스를 얻었다. 최종 투여량은 60 ㎏ 일반 성인의 하루 20 g 복용량으로 환산하여, 흰쥐 체중 100 g당 33.
데이터처리
- 스튜던트 T검정(student's t-test)를 사용하여 p<.05 및 p<.01의 유의수준으로 검증하였으며, 모든 값의 수치는 평균±표준오차(mean±standard error)로 표시하였다.
성능/효과
- 4 g으로, EU군이 대조군에 비해 평균 체중이 약간 증가하였으나 유의성 있는 차이는 아니었다. 2주간의 실험기간 동안 모든 군에서 시간이 지남에 따라 체중이 점차 증가하는 양상이 나타났다.
- EU군과 대조군을 비교한 결과에서는 오른쪽 비복근에서는 두 군 간에 차이점을 발견할 수 없었으나 왼쪽의 경우는 EU군에서 대조군에 비해 근섬유 단면적 감소의 정도가 상대적으로 덜한 편이었으며, 더불어 근섬유 주변에서의 핵 응집도 상대적으로 적게 관찰되었다.
- 그 결과 대조군에서는 오른쪽에 대한 왼쪽의 근육 단면적의 평균 감소량은 15.5±2.9 %로 계산된 반면, 두충 추출물을 투여한 EU군의 경우는 오른쪽에 대한 왼쪽의 근육 단면적의 평균 감소량은 10.7±1.9 %로 계산되어, EU군이 대조군에 비해 근육위축이 유의성 있게 회복된 결과를 보였다(p<.05) (표 2).
- 동시에 두충 추출물을 경구 투여하여 근 위축에 미치는 효과를 검증하였다. 그 결과, 2주간의 평균 체중의 변화에 있어서는 두충을 투여한 EU군과 동일량의 생리식염수를 투여한 대조군 간에 유의한 차이는 발견되지 않았다. 하지만, 비복근 무게의 변화에 있어서는 유의성 있는 차이가 발생하였는데, 발목관절을 붕대로 고정시킨 왼쪽 비복근에서 EU군이 대조군에 비해 근 위축이 유의성 있게 회복된 결과를 나타냈다(p<.
- 그 결과, 대조군의 경우 자유롭게 움직임이 가능하게 한 오른쪽 비복근은 506.8±3.6 ㎎/100 g인 반면, 붕대로 압박하여 움직이지 못하게 한 왼쪽은 418.1±3.6 ㎎/100 g로 측정되어 유의성 있는 감소가 나타났다(p<.01)(표 1).
- 근육의 변화를 좀 더 구체적으로 확인하기 위해 비복근을 8 ㎛ 두께로 냉동 절편하여 H&E 염색을 통해 근육 단면적의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 발목관절 고정에 의해 왼쪽 비복근이 오른쪽에 비해 근섬유의 단면적의 크기가 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다. 아울러, 2주간의 발목관절 고정에 의해 비복근의 근육세포에서 염증반응과 핵의 응집이 관찰되었는데, 비복근에서의 염증반응은 형태학적으로 일정한 형태 없이 근섬유 다발 사이에 핵들이 응집되어 있는 특징을 나타 내었다(그림 1).
- 대조군과 EU군을 비교한 결과에서는 아무런 처치를 가하지 않은 오른쪽 비복근 무게는 유의성 있는 차이가 없었으나, 발목관절을 붕대로 고정시킨 왼쪽의 경우에는 근육감소량의 비교에 있어 EU군이 대조군에 비해 근 위축이 유의성 있게 회복된 결과를 나타냈다(p<.05)(표 1).
- 두충은 장기간의 근육 불사용으로 인한 실험동물의 체중 변화에는 영향을 미치지 않았으나, 비복근의 중량감소를 유의성 있게 방어하는 효과가 있었다. 이러한 방어효과는 비복근의 근섬유의 단면적 감소를 유의성 있게 억제시키고, 근육 내 염증세포와 근육위성세포의 증식을 억제시키기 때문인 것으로 사료된다.
- 비복근의 중앙부를 8 ㎛ 두께로 냉동 절편하여 H&E 염색을 시행하여, 현미경 하에서 근육 단면적의 변화를 관찰한 결과, 대조군과 EU군 모두에서 발목 고정을 시행한 왼쪽 비복근에서 아무런 처치도 가하지 않은 오른쪽에 비해 근섬유의 단면적이 감소되었음을 뚜렷이 확인할 수 있었다. 또한 근육 내 염증세포와 근육위성세포의 증식을 보여주는 근섬유 주변에서의 핵(nucleus) 응집과 결합조직의 증가도 오른쪽에 비해 왼쪽 비복근에서 상대적으로 많이 관찰되었다(그림 1).
- 발목 고정을 시행한 왼쪽의 비교에서는 EU군이 대조군에 비해 근 위축이 회복된 결과를 보였으며, 통계적으로도 유의성 있는 변화를 나타냈다(p<.05)(표 2).
- 비복근 단면적의 변화를 영상분석을 통해 실제 수치화 하여 비교한 결과에서도, 대조군에서는 자유로운 움직임이 가능했던 오른쪽 비복근의 경우 4,356.2±82.1 ㎛2로 측정된 반면, 발목관절을 붕대로 압박하여 움직임을 제한한 왼쪽의 경우 3,665.8±88.3 ㎛2로 측정되어 유의성 있는 감소가 나타났다(p<.01)(표 2).
- 비복근의 중앙부를 8 ㎛ 두께로 냉동 절편하여 H&E 염색을 시행하여, 현미경 하에서 근육 단면적의 변화를 관찰한 결과, 대조군과 EU군 모두에서 발목 고정을 시행한 왼쪽 비복근에서 아무런 처치도 가하지 않은 오른쪽에 비해 근섬유의 단면적이 감소되었음을 뚜렷이 확인할 수 있었다.
- 실험 시작일에 각 군별 흰쥐의 평균 체중은 대조군에서 242.4±2.4 g, EU군에서 241.5±2.5 g이었으며, 2주 후 마지막으로 측정된 체중은 대조군에서 평균 329.1±7.1 g, EU군에서 333.7±12.4 g으로, EU군이 대조군에 비해 평균 체중이 약간 증가하였으나 유의성 있는 차이는 아니었다.
- 그 결과, 발목관절 고정에 의해 왼쪽 비복근이 오른쪽에 비해 근섬유의 단면적의 크기가 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다. 아울러, 2주간의 발목관절 고정에 의해 비복근의 근육세포에서 염증반응과 핵의 응집이 관찰되었는데, 비복근에서의 염증반응은 형태학적으로 일정한 형태 없이 근섬유 다발 사이에 핵들이 응집되어 있는 특징을 나타 내었다(그림 1). 또한, 간혹 핵의 침윤현상이 관찰되었는데, 이는 근섬유다발 속에 죽은 세포 또는 감염된 세포를 처리하기 위해 대식세포(macrophage)가 침입하였음을 보여주는 것이다.
- 위의 결과들을 종합하면, 두충 추출물은 실험동물의 후지 고정으로 유발된 근 위축 손상에서 비복근의 중량 감소를 억제하였으며, 근섬유의 감소를 억제함으로써 단면적 감소를 줄이고, 또한 근육 안에서의 염증반응을 줄여주는 효과가 있는 것으로 판단된다. 앞서 언급한 바와 같이, 최근 붕대고정에 의한 근 위축의 치료에 다양한 물리치료 방법들이 유효한 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다.
- 이렇듯 발목고정을 시행한 왼쪽 비복근에서 단면적 감소와 염증반응이 뚜렷이 관찰되었으나, 두충 추출물을 경구 투여한 EU군이 대조군에 비해 근섬유 단면적 감소의 정도가 상대적으로 줄어들었으며, 근섬유 다발 사이의 핵 응집도 적게 관찰되었다. 이러한 결과는 두충이 2주간 발목고정으로 유발된 근 위축에서 근섬유의 감소를 줄이고, 근육 세포에서 염증반응을 억제시킴으로써 방어효과를 가지고 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.
- 또한, 간혹 핵의 침윤현상이 관찰되었는데, 이는 근섬유다발 속에 죽은 세포 또는 감염된 세포를 처리하기 위해 대식세포(macrophage)가 침입하였음을 보여주는 것이다. 이렇듯 발목고정을 시행한 왼쪽 비복근에서 단면적 감소와 염증반응이 뚜렷이 관찰되었으나, 두충 추출물을 경구 투여한 EU군이 대조군에 비해 근섬유 단면적 감소의 정도가 상대적으로 줄어들었으며, 근섬유 다발 사이의 핵 응집도 적게 관찰되었다. 이러한 결과는 두충이 2주간 발목고정으로 유발된 근 위축에서 근섬유의 감소를 줄이고, 근육 세포에서 염증반응을 억제시킴으로써 방어효과를 가지고 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.
후속연구
- 본 연구를 통해 근 위축에 유의한 방어효과가 있는 것으로 밝혀진 두충이 무용성 근 위축 치료에 유용한 약물로 활용되길 기대해본다. 다만, 본 연구에서는 후지 고정 후의 근 위축에 대한 약물의 효과를 해부조직학적 관찰을 통해 검증하였는데 다양한 근 위축 기전에 미치는 영향에 대해서도 이후 추가적인 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 이러한 무용성 근 위축의 재활에 있어서 다양한 물리치료 기법과 더불어 천연 약재 병용은 더 나은 효과를 발휘하리라 생각된다. 본 연구를 통해 근 위축에 유의한 방어효과가 있는 것으로 밝혀진 두충이 무용성 근 위축 치료에 유용한 약물로 활용되길 기대해본다. 다만, 본 연구에서는 후지 고정 후의 근 위축에 대한 약물의 효과를 해부조직학적 관찰을 통해 검증하였는데 다양한 근 위축 기전에 미치는 영향에 대해서도 이후 추가적인 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 이러한 방어효과는 비복근의 근섬유의 단면적 감소를 유의성 있게 억제시키고, 근육 내 염증세포와 근육위성세포의 증식을 억제시키기 때문인 것으로 사료된다. 이와 같은 결과로 두충은 근육 불사용에 따른 근 위축 변화에 유의한 보호효과를 가지고 있으며, 실제 임상에서 무용성 근 위축의 개선에 있어서 유용한 보조적 약물로써 활용될 수 있으리라 사료된다.
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