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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 보리순 물 추출물의 항비만 효과를 검증하기 위해, 마우스 유래 3T3-L1 세포에서 지방합성과 관련된 유전자 발현을 측정하여 보리순의 분화유도 억제에 관한 연구를 수행하였다. 또한 고지방식이로 유도한 비만 동물모델에서 보리순 추출물에 따른 지방 축적 및 혈장 내 지방질 함량과 당에 미치는 효능을 조사하였다.
제안 방법
- 3T3-L1 preadipocyte를 96 well plate에 5 × 103 cells/well로 분주하였으며, BS를 농도별로 (0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 ㎍/㎖) 처리하여 48 시간 동안 배양하였다.
- 1). BS가 지방분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 Oil red O와 세포 내 triglyceride 함량을 측정하였다. 그 결과 BS를 처리하지 않고 분화를 유도하였을 때 지방구가 활발하게 형성되었으나, BS을 처리하였을 경우에는 농도 의존적으로 지방구의 형성이 현저하게 감소되었다(Fig.
- Total RNA는 배양한 3T3-L1 지방전구세포를 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 mRNA를 분리한 뒤 cDNA로 합성하여 Real-time PCR기기(ABI7500, Applied Biosystem, Foster, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였으며 (Sim et al., 2015), 실험에 사용한 유전자의 primer sequencing 정보는 Table 1에 나타내었다.
- 25 mM dexamethasone, 10 ㎍/㎖ insulin이 첨가된 배지를 처리하여 분화유도를 2 일간 한 뒤, 다시 2 일간 10% FBS-DMEM에 10 ㎍/㎖ insulin이 첨가된 배지로 교체해주었다. 그 후 2 일 간격으로 10% FBSDMEM 배지로 교체해주었으며, 보리순 물추출물 (BS)의 처리는 분화유도 시점부터 같이 처리하였다 (Sim et al., 2014).
- 그 후의 각각 MTS 용해액을 첨가한 후 37℃에서 4 시간 배양한 후 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN GmbH, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다 (Seo et al., 2017).
- Adiponectin 혈중 수치는 정상인에 비해 비만 환자에서 감소한다고 알려져 있다. 따라서 고지방식이를 제공한 마우스에서 BS 투여에 의한 혈중 인슐린 및 leptin, adiponectin 농도에 미치는 영향을 실험하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 보리순 물 추출물의 항비만 효과를 검증하기 위해, 마우스 유래 3T3-L1 세포에서 지방합성과 관련된 유전자 발현을 측정하여 보리순의 분화유도 억제에 관한 연구를 수행하였다. 또한 고지방식이로 유도한 비만 동물모델에서 보리순 추출물에 따른 지방 축적 및 혈장 내 지방질 함량과 당에 미치는 효능을 조사하였다.
- 보리(Hordeum vulgare L.)순 물추출물 (BS)은 모든 농도에서 독성이 나타나지 않아 125, 250, 500, 1,000 ㎍/㎖ 의 농도로 모든 실험을 진행하였다 (Fig. 1). BS가 지방분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 Oil red O와 세포 내 triglyceride 함량을 측정하였다.
- )순은 ㈜새뜸원(Yeonggwang, Korea)에서 구입하여 시료로 사용하였다. 보리순의 물추출물을 획득하기 위하여 보리순 분말 100 g의 1 ℓ 증류수를 첨가하여 105℃ 온도에 3 시간 동안 3 회 가열하여 추출한 뒤 여과하여 불순물을 제거하였다. 추출한 시료는 동결 건조 시킨 후 (PVTFD20R, Ilshin Biobase Co.
- 분화가 완료된 지방세포를 Oil red O staining kit(Sciencell, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 kit의 사용설명에 따라 염색하였으며, 완료된 세포는 세척 한 다음 광학현미경(TS100, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다 (Sim et al., 2015).
- , Carlsbad, CA, USA)배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건의 incubator에서 배양하였다. 세포가 confluence 상태가 되면 10% FBS-DMEM에 0.5 mM 3-isobutyle-1-methylxanthine, 0.25 mM dexamethasone, 10 ㎍/㎖ insulin이 첨가된 배지를 처리하여 분화유도를 2 일간 한 뒤, 다시 2 일간 10% FBS-DMEM에 10 ㎍/㎖ insulin이 첨가된 배지로 교체해주었다. 그 후 2 일 간격으로 10% FBSDMEM 배지로 교체해주었으며, 보리순 물추출물 (BS)의 처리는 분화유도 시점부터 같이 처리하였다 (Sim et al.
- 마우스는 1 주간 일반식이로 순화시킨 후 난괴법으로 분류하였다. 정상식이군 (ND)과 고지방식이군 (HF)으로 나누어서 사육한 뒤, HF군은 난괴법에 의하여 HF, BS 100 ㎎/㎏, BS 300 ㎎/㎏, BS 500 ㎎/㎏ 투여군으로 6 마리씩 나누어 6 주간 사육하였다. 동물 사육 기간 동안 항온 (22 ± 2℃), 항습 (50 ± 5%), 12 시간 간격 (08:00 - 20:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하였다.
- 지방조직의 형태학적 관찰은 적출한 지방조직 일부를 10% formaldehyde 용액에 24 시간 고정한 다음, hematoxylin and eosin (H and E) 염색을 실시하였고, 광학현미경 (TS100, Nikon, Tyoko, Japan)으로 200 배 배율로 관찰하였다.
- 혈청 중의 지질함량은 생화학 분석기 (FUJI DRI-CHEM 4000i, Fujifilm Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 혈청 adipokine (leptin, adiponectin) 및 insulin, glucose 함량 측정은 Multiplex detection kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 및 Luminex 200 Labmap system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하였으며, 데이터분석은 Bio-Plex manager soft ware version 5.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 고지방식이 (60% kcal from fat)는 샘 타코 (SAMTAKO, Osan, Korea)로부터 구입하여서 제공하였으며, 음수와 식이는 자유급식 하였고, 체중은 주 1 회 같은 시각에 측정하였으며, 식이섭취량은 매일 동일한 시각에 공급량에서 잔량을 감하여 측정하였다.
- 실험동물은 6 주령 수컷 C57BL/6 마우스를 샘타코(SAMTAKO, Osan, Korea)로부터 구입하였다. 마우스는 1 주간 일반식이로 순화시킨 후 난괴법으로 분류하였다.
- 실험에 사용한 마우스 지방전구세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, 10% new born calf serum (NBCS, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)과 100 unit/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)이 함유된 DMEM (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건의 incubator에서 배양하였다. 세포가 confluence 상태가 되면 10% FBS-DMEM에 0.
- 실험에 사용한 보리 (Hordeum vulgare L.)순은 ㈜새뜸원(Yeonggwang, Korea)에서 구입하여 시료로 사용하였다. 보리순의 물추출물을 획득하기 위하여 보리순 분말 100 g의 1 ℓ 증류수를 첨가하여 105℃ 온도에 3 시간 동안 3 회 가열하여 추출한 뒤 여과하여 불순물을 제거하였다.
- 보리순의 물추출물을 획득하기 위하여 보리순 분말 100 g의 1 ℓ 증류수를 첨가하여 105℃ 온도에 3 시간 동안 3 회 가열하여 추출한 뒤 여과하여 불순물을 제거하였다. 추출한 시료는 동결 건조 시킨 후 (PVTFD20R, Ilshin Biobase Co., Dongducheon, Korea) 28.8%의 회수율을 얻어 실험 시료 (BS)로 사용하였다.
데이터처리
- *Means not sharing a common letters (a-c) are significantly different between groups based on One-way ANOVA with Duncan’s Multiple Range post hoc Test at p < 0.05.
- The values are expressed as the means ± SD and significantly different between groups according to Student's t-test.
- The values are expressed as the means ± SD and significantly different between groups according to Student’s t-test.
- 모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차 (means ± SD)로 나타내었으며, SPSS (18.0, Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 일원변량분석(One-way ANOVA)을 실시한 후 유의성 검증은 95% 수준에서 세포실험은 Student’s t-test로 동물실험은 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 실시하였다.
- , Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 혈청 adipokine (leptin, adiponectin) 및 insulin, glucose 함량 측정은 Multiplex detection kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 및 Luminex 200 Labmap system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하였으며, 데이터분석은 Bio-Plex manager soft ware version 5.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.
이론/모형
- 본 실험에 사용한 BS가 지방세포에 독성을 나타내는지를 측정하기 위하여 MTS assay를 수행하였다. 3T3-L1 preadipocyte를 96 well plate에 5 × 103 cells/well로 분주하였으며, BS를 농도별로 (0, 31.
성능/효과
- Normal군에 비해 HF군에서 혈당, leptin, 인슐린의 함량이 유의적으로 증가했으며, adiponectin의 함량은 유의적으로 감소하였다. BS의 섭취시 인슐린 농도가 농도 의존적으로 감소하였으며, leptin은 BS 섭취군에서 모두 유의적으로 감소하였다. 이로 인해 혈중 혈당 역시 감소하였다.
- 8 에 나타내었다. Normal 군에 비하여 HF군의 간조직에서는 정상군에 비하여 많은 지방구가 관찰되었으며, 모든 물질 섭취군에서는 지방구가 감소한 것을 볼 수 있었다. 또한, HF군은 normal 군에 비하여 지방세포의 크기가 커진 반면 물질 섭취군 에서는 농도 의존적으로 지방세포의 크기가 감소하였다.
- Normal군에 비해 HF군에서 혈당, leptin, 인슐린의 함량이 유의적으로 증가했으며, adiponectin의 함량은 유의적으로 감소하였다. BS의 섭취시 인슐린 농도가 농도 의존적으로 감소하였으며, leptin은 BS 섭취군에서 모두 유의적으로 감소하였다.
- 이는 BS섭취가 전체 콜레스테롤 중 HDL-C의 비율을 증가함으로써 BS 추출물 섭취가 혈중 콜레스테롤 농도 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다. 결과적으로 BS의 섭취는 HTR의 비율을 높이고, TG함량을 낮춤으로서 고지방식이로 유도된 고지혈증 개선에 효능이 있는 것으로 판단된다.
- 2와 같다. 고지방식이 섭취군은 정상식이군에 비해 유의적으로 체중증가가 유도되었으며, BS 섭취군에서는 고지방식에 의해 증가된 체중이 6 주차에 유의적으로 감소하였으며, 특히 BS 500 ㎎/㎏ 섭취군에서는 체중 증가량이 유의적으로 감소하였다. 그러나 BS는 식이섭취량에는 유의적인 영향을 미치지 않았다.
- BS가 지방분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 Oil red O와 세포 내 triglyceride 함량을 측정하였다. 그 결과 BS를 처리하지 않고 분화를 유도하였을 때 지방구가 활발하게 형성되었으나, BS을 처리하였을 경우에는 농도 의존적으로 지방구의 형성이 현저하게 감소되었다(Fig. 2).
- 따라서, BS는 분화가 유도된 3T3-L1 세포에서 C/EBPα 와 PPARγ 발현을 조절하여 지방구 생성을 억제함에 따라 비만치료에 효과적일 것으로 사료된다.
- 6). 따라서, 본 결과는 BS의 섭취는 adipokine 및 혈당, 인슐린 농도를 개선함에 따라 비만으로 인한 대사성 질환을 개선할 것으로 사료된다.
- 3에 나타난 바와 같이 분화를 유발하였을 경우, PPARγ, C/EBPα 의 발현이 현저하게 증가하였지만 BS 처리에 의하여 농도 의존적인 감소가 유발되었다. 또한, FABP4 및 FAS 경우에도 Fig. 3에서와 같이 BS 처리에 의하여 현저하게 감소하였음을 확인하였다. 따라서, BS는 분화가 유도된 3T3-L1 세포에서 C/EBPα 와 PPARγ 발현을 조절하여 지방구 생성을 억제함에 따라 비만치료에 효과적일 것으로 사료된다.
- Normal 군에 비하여 HF군의 간조직에서는 정상군에 비하여 많은 지방구가 관찰되었으며, 모든 물질 섭취군에서는 지방구가 감소한 것을 볼 수 있었다. 또한, HF군은 normal 군에 비하여 지방세포의 크기가 커진 반면 물질 섭취군 에서는 농도 의존적으로 지방세포의 크기가 감소하였다. 이를 통하여 물추출물의 섭취는 간 조직내 지방조직의 지방축적을 효과적으로 개선할 것으로 사료된다.
- 먼저 C/EBPα 와 PPARγ의 발현 정도를 Real-time PCR로 확인한 결과 Fig. 3에 나타난 바와 같이 분화를 유발하였을 경우, PPARγ, C/EBPα 의 발현이 현저하게 증가하였지만 BS 처리에 의하여 농도 의존적인 감소가 유발되었다.
- 고지방식이 섭취는 간 및 지방조직에 중성지질 및 콜레스테롤 등의 축적을 일으켜 간 중량을 증가시킨다. 본 실험 결과에서 간 무게 및 부고환 지방의 무게는 고지방 식이의 영향으로 HF군이 normal군에 비하여 유의적으로 증가하였으며, 이는 고지방식이에 의해 간 및 지방조직 내에 콜레스테롤 및 중성지질 등이 축적된 것으로 사료된다. 또한 지방조직의 중량 증가는 지방이 축적되어 그 함량이 증가할수록 대사성 질환 위험 역시 증가 된다고 알려져 있다.
- 본 실험에서 BS의 섭취는 고지방식이로 인한 간 무게 및 지방조직 무게 증가를 억제하였다 (Fig. 5). 따라서 보리순의 섭취에 따라서는 간 무게 및 지방조직의 중량이 감소함에 따라 대사성 질환 위험 역시 감소시킬 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는, HDL-C의 함량은 HF군과 시료 섭취군에서는 유의적인 차이를 보이지는 않았지만, HDL-C/total cholesterol ratio (HTR)의 경우 물질 섭취 군이 정상수준까지 개선됨을 알 수 있었다. 이는 BS섭취가 전체 콜레스테롤 중 HDL-C의 비율을 증가함으로써 BS 추출물 섭취가 혈중 콜레스테롤 농도 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 보리순의 혈액내의 지질 농도 분석 결과는 Table 2에 나타내었다. 혈청 내 triglyceride (TG)함량은 고지방식이에 의해 가장 큰 영향을 받는데 고지방식이만을 섭취한 HF군에 비해 BS 300 ㎎/㎏, BS 500 ㎎/㎏ 섭취군 에서 혈청 TG 함량이 유의적으로 감소하였다. High density lipoprotein cholesterol(HDL-C)은 혈중의 동맥경화를 유발시키는 저분자 콜레스테롤을 간으로 이동시켜 제거하는 좋은 콜레스테롤로 알려져 있다(Sim et al.
후속연구
- , 2010). 따라서, 본 실험에서 BS가 지방구의 형성을 억제함에 따라 비만 억제에 크게 기여할것으로 사료된다.
- 본 연구에서는, HDL-C의 함량은 HF군과 시료 섭취군에서는 유의적인 차이를 보이지는 않았지만, HDL-C/total cholesterol ratio (HTR)의 경우 물질 섭취 군이 정상수준까지 개선됨을 알 수 있었다. 이는 BS섭취가 전체 콜레스테롤 중 HDL-C의 비율을 증가함으로써 BS 추출물 섭취가 혈중 콜레스테롤 농도 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다. 결과적으로 BS의 섭취는 HTR의 비율을 높이고, TG함량을 낮춤으로서 고지방식이로 유도된 고지혈증 개선에 효능이 있는 것으로 판단된다.
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