[논문]출아효모에서 xylitol dehydrogenase (XYL2)의 최적 생산을 위한 발현 시스템 구축

정회명; 김연희

doi:10.5352/jls.2017.27.12.1403

[국내논문] 출아효모에서 xylitol dehydrogenase (XYL2)의 최적 생산을 위한 발현 시스템 구축
Expression System for Optimal Production of Xylitol Dehydrogenase (XYL2) in Saccharomyces cerevisiae 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.27 no.12 = no.212, 2017년, pp.1403 - 1409

정회명 (동의대학교 스마트바이오헬스학과) , 김연희 (동의대학교 스마트바이오헬스학과)

초록
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본 연구에서는 lignocellulosic biomass (xylose)의 부가가치를 높이고 효율적인 활용을 위해 xylitol dehydrogenase를 Saccharomyces cerevisiae 숙주세포에서 분비 생산하고자 하였다. 먼저 S. cerevisiae와 Pichia stipitis유래 XYL2 유전자(S.XYL2 and P.XYL2 gene)의 발현 시스템을 구축하기 위하여 GAL10 promoter와 ADH1 promoter 하류에 각각 mating factor ${\alpha}$ ($MF{\alpha}$) signal sequence와 XYL2유전자를 가진 $pGMF{\alpha}-S.XYL2$, $pGMF{\alpha}-P.XYL2$, $pAMF{\alpha}-S.XYL2$와 $pAMF{\alpha}-P.XYL2$ plasmid를 구축하였다. 각각의 plasmid는 S. cerevisiae $SEY2102{\Delta}trp1$ 균주에 형질전환되었고, 생산된 xylitol dehydrogenase의 활성을 조사해 본 결과, GAL10 promoter가 ADH1 promoter보다 XYL2유전자의 발현에 더욱 적합함을 확인 할 수 있었다. 또한 P. stipitis 유래의 xylitol dehydrogenase 효소 활성이 S. cerevisiae 유래의 효소 활성보다 2배 이상 더 높았으며, 활성의 증가를 위해 두 유전자 모두 cofactor로 $NAD^+$에 의존한다는 것을 확인하였다. 재조합 유전자가 가지는 분비서열에 의해 $SEY2102{\Delta}trp1/pGMF{\alpha}-P.XYL2$ 균주에서 xylitol dehydrogenase의 약 77%는 periplasmic space로 분비 발현되었음을 알 수 있었다. 또한 재조합 xylitol dehydrogenase의 효율적인 생산을 위해 탄소원의 영향을 조사해본 결과, glucose 단독보다 glucose와 xylose를 혼합 배양한 경우에서 효소활성이 최대 41% 정도 증가되었음을 확인 할 수 있었다. 본 연구에서 최적화한 발현 시스템 및 배양 조건은 xylose 뿐만 아니라 다양한 biomass를 이용한 유용물질 생산을 위한 관련 단백질의 발현 분비시스템 구축 및 대량생산에도 응용될 수 있을 것이라 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, the xylitol dehydrogenase (XYL2) gene was expressed in Saccharomyces cerevisiae as a host cell for ease of use in the degradation of lignocellulosic biomass (xylose). To select suitable expression systems for the S.XYL2 gene from S. cerevisiae and the P.XYL2 gene from Pichia stipitis, $pGMF{\alpha}-S.XYL2$, $pGMF{\alpha}-P.XYL2$, $pAMF{\alpha}-S.XYL2$ and $pAMF{\alpha}-P.XYL2$ plasmids with the GAL10 promoter and ADH1 promoter, respectively, were constructed. The mating factor ${\alpha}$ ($MF{\alpha}$) signal sequence was also connected to each promoter to allow secretion. Each plasmid was transformed into S. cerevisiae $SEY2102{\Delta}trp1$ strain and the xylitol dehydrogenase activity was investigated. The GAL10 promoter proved more suitable than the ADH1 promoter for expression of the XYL2 gene, and the xylitol dehydrogenase activity from P. stipitis was twice that from S. cerevisiae. The xylitol dehydrogenase showed $NAD^+$-dependent activity and about 77% of the recombinant xylitol dehydrogenase was secreted into the periplasmic space of the $SEY2102{\Delta}trp1/pGMF{\alpha}-P.XYL2$ strain. The xylitol dehydrogenase activity was increased by up to 41% when a glucose/xylose mixture was supplied as a carbon source, rather than glucose alone. The expression system and culture conditions optimized in this study resulted in large amounts of xylitol dehydrogenase using S. cerevisiae as the host strain, indicating the potential of this expression system for use in bioethanol production and industrial applications.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

실제로 xylitol dehydrogenase의 발현을 constitutive promoter를 사용하여 조절하여 xylitol accumulation을 낮추고, ethanol production yield를 증가시킨 결과도 보고되었고[12], 발현시키고자 하는 유전자의 특성에 따라 발현에 적합한 promoter (constitutive or inducible promoter)와 유전자의 combination이 달라진다는 결과도 보고하였다[11]. 따라서 본 연구에서는 S. cerevisiae와 P. stipitis의 XYL2 유전자(S.XYL2 and P.XYL2 gene)를 inducible promoter인 GAL10(galactose inducible) promoter와 constitutive promoter인ADH1 (constantly expression) promoter를 이용하여 발현시키고, xylitol dehydrogenase의 발현 생산에 가장 적합한 promoter와 유전자 발현시스템(expression system)을 구축하고자 하였다.
본 연구에서는 lignocellulosic biomass (xylose)를 이용한 바이오에탄올 생산 및 부산물의 효과적인 이용을 위해 xylitoldehydrogenase의 과발현시스템을 구축하였다. 효율적으로xylitol dehydrogenase를 분비 생산하기 위한 promoter의 선별, 유전자의 선별 및 탄소원에 대한 영향을 비교 분석하여 최적의 발현 조건을 제시하였으며, S.

제안 방법

ADH1 promoter를 이용하여 S.XYL2 유전자와 P.XYL2 유전자를 과발현 시키기 위한 plasmid의 구축을 위해서는 pVT103U plasmid [25]를 vector로 사용하였고, pGMFα-S.XYL2와pGMFα-P.XYL2 plasmid를 주형으로 pAMFα-F (5’-GCTGGATCCTCTAGAATGAGATTCCCATCC-3’)와 pAS.XYL2-R (5’-TGCTGCAGGCTCGAGTCATTCCGGGCCCTC-3’), pAP.XYL2-R (5‘-TGCTGCAGGCTCGAGTTACT CAGGGCCGTC-3’) primer를 이용하여 S.XYL2와 P.XYL2 유전자를 증폭하였다.
Primer는 각각 XbaI과 SalI 제한효소서열을 포함한 22bp vector서열을 포함하도록 디자인되었고, pGMFα-XYLP plasmid (vector)는 XbaI과 SalI 제한효소로 처리하여 cloning에 사용하였다.
GAL10 promoter를 이용하여 S. cerevisiae의 XYL2 유전자(S.XYL2)와 P. stipitis의 XYL2 유전자(P.XYL2)의 과발현을 위한 plasmid를 구축하기 위해서 pGMFα-XYLP plasmid [10]를vector로 사용하였고, 각각 SEY2102 △trp1과 P. stipitis (KCTC 7230) 균주의 genomic DNA를 주형으로 S.XYL2-F (5’-AGGTGTTCCTCTAGATAAGAGAACTGACTTAACTACA-3’)와S.XYL2-R (5’-TTCGTTCAAGTC GACTCATTCCGGGCCCTC-3’), P.XYL2-F (5’-AGGTGTTCCTCTAGATAAGAGAACTGCTAACCC TTCC-3’)와 P.XYL2-R (5’-TTCGTTCAAGTCGACTTACTCAGGGCCGTC-3’) primer set를 이용하여 S.XYL2와 P.XYL2 유전자를 증폭하였다.
Xylitol dehydrogenase의 효소활성 측정을 위하여 YPDG배지에서 48시간 배양한 배양액을 3,000 rpm으로 원심분리하여 얻은 균체 침전물에 Y-PER (Yeast Protein extraction reagent, Thermo Fisher Scientific)을 첨가하여 단백질을 추출하였다. 2 ml의 Y-PER을 균체에 첨가하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 균체와 동량의 glass beads (0.
Xylitol dehydrogenase의 효소활성 측정을 위하여 YPDG배지에서 48시간 배양한 배양액을 3,000 rpm으로 원심분리하여 얻은 균체 침전물에 Y-PER (Yeast Protein extraction reagent, Thermo Fisher Scientific)을 첨가하여 단백질을 추출하였다. 2 ml의 Y-PER을 균체에 첨가하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 균체와 동량의 glass beads (0.4~0.6 mm)를 추가하여 3회~10회정도 vortexing하고, 원심분리하여 상등액을 분리 한 다음 현미경 관찰을 통해 세포 파쇄 여부를 확인하였다. Periplasmic space (P)와 cytoplasmic space (C)의 효소액을 분리하기 위해서는 Y-PER만 첨가하여 반응시킨 후, 상등액(P)을 분리하고 남은 원형질체에 다시 한번 동량의 Y-PER와 glass beads를 추가하여 완전히 균체를 파쇄(C)하였다.
6 mm)를 추가하여 3회~10회정도 vortexing하고, 원심분리하여 상등액을 분리 한 다음 현미경 관찰을 통해 세포 파쇄 여부를 확인하였다. Periplasmic space (P)와 cytoplasmic space (C)의 효소액을 분리하기 위해서는 Y-PER만 첨가하여 반응시킨 후, 상등액(P)을 분리하고 남은 원형질체에 다시 한번 동량의 Y-PER와 glass beads를 추가하여 완전히 균체를 파쇄(C)하였다. 분리된 상등액 및 세포추출물 내의 protein 농도는 Bradford법[3]으로 정량하였고, BSA (Bovine Serum Albumin)를 표준물질로 0mg/ml, 0.
Periplasmic space (P)와 cytoplasmic space (C)의 효소액을 분리하기 위해서는 Y-PER만 첨가하여 반응시킨 후, 상등액(P)을 분리하고 남은 원형질체에 다시 한번 동량의 Y-PER와 glass beads를 추가하여 완전히 균체를 파쇄(C)하였다. 분리된 상등액 및 세포추출물 내의 protein 농도는 Bradford법[3]으로 정량하였고, BSA (Bovine Serum Albumin)를 표준물질로 0mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1.0mg/ml의 양만큼 첨가하여 표준적정곡선을 작성하였다. Xylitol dehydrogenase의 효소활성 측정은 0.
SEY2102△trp1 균주와 각각의 형질전환체에서 S.XYL2와 P.XYL2 유전자의 발현률을 비교하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. Trizol method [9]를 통해 각 효모 균주의 total RNA를추출하였고, Hyperscript™ First strand synthesis Kit (GeneAllⓇ)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
구축된 pGMFα-S.XYL2, pGMFα-P.XYL2, pAMFα-S.XYL2와 pAMFα-P.XYL2 plasmid를 각각 S. cerevisiae SEY2102△trp1 균주에 형질전환하여 YNBCAD배지에서 1차 선별하였다.
SEY2102△trp1/pGMFα-S.XYL2 균주, SEY2102△trp1/pAMFα-S.XYL2 균주, SEY2102△trp1/pGMFα-P.XYL2 균주 및 SEY2102△trp1/pAMFα-P.XYL2 균주로부터 total RNA를 추출하고, cDNA 합성 후, S.XYL2, P.XYL2 유전자와 ACT1 유전자를 증폭하는 primer set로 PCR을 수행하였다.
각 5개~10개의 형질전환체를 선별하여 XYL2 유전자의 유무를 확인해보기 위해 colony PCR을 수행한 결과, 모든 형질전환체에서 XYL2 유전자가 증폭되었음을 알 수 있었다(datanot shown). 다음으로 각 형질전환체들 중 1개의 형질전환체를 선별하여 YPDG 배지에서 48시간 배양한 후 xylitol dehydrogenase 활성을 비교해보았다(Table 1). 먼저 promoter에따른 xylitol dehydrogenase 활성을 조사해 본 결과, ADH1promoter보다 GAL10 promoter를 사용하였을 때 xylitol dehydrogenase 활성이 5.
XYL2 유전자의 과발현에 ADH1 promoter를 사용했을 때보다 GAL10 promoter를 사용했을 때가 xylitol dehydrogenase의 활성이 높아지고, 특히 P. stipitis 유래의 P.XYL2 유전자발현이 상대적으로 증가되었음을 확인할 수 있었는데, 이것이 XYL2 유전자의 transcription level의 증가인지 단백질 활성 증가의 영향인지 확인해보기 위해 RT-PCR을 수행하였다.SEY2102△trp1/pGMFα-S.
Xylitol dehydrogenase의 효율적인 분비발현을 위해서 각각의 plasmid 구축 시, S. cercevisiae의 MFα signal sequence(s.s)를 S.XYL2 유전자 및 P.XYL2 유전자의 앞에 도입하였다.
S. cerevisiae에서 xylitol dehydrogenase의 활성이 배지 중의탄소원(glucose, galactose and xylose)에 의해 조절되고 변화할 수 있다는 몇몇 보고[2, 20, 23]에 근거하여, 재조합 xylitol dehydrogenase 생산에 최적인 SEY2102△trp1/pGMFα-P.XYL2균주를 사용하여 다양한 배지조성과 조건에서 xylitol dehydrogenase의 활성 변화를 조사해보았다.
먼저, 각 형질전환주를 YPD배지(SEY2102△trp1/pAMFα-S.XYL2 균주와 SEY2102△trp1/pAMFα-P.XYL2 균주 배양)와 YPDG배지(SEY2102△trp1/pGMFα-S.XYL2 균주와 SEY2102△trp1/pGMFα-P.XYL2 균주 배양)에서 48시간 배양한 후, 배양상등액(E, extracellular fraction)과 세포추출물(P+C, P, periplasmicfraction; C, cytoplasmic fraction)에서의 효소활성을 조사해보았다(Fig. 3).
따라서 MFα s.s에 의한 재조합 xylitol dehydrogenase의 분비효율을 각각의 형질전환주에 대해서 비교해보았다.
효모 유래 분비 서열을 이용하여 S.XYL2와 P.XYL2 유전자를 유도적, 구성적으로 발현·분비시키기 위하여 GAL10 promoter와 ADH1 promoter 하류에 각각 mating factor α (MFα)signal sequence와 S.XYL2와 P.XYL2 유전자를 cloning하여 pGMFα-S.XYL2 (7.44 kb), pGMFα-P.XYL2 (7.34 kb), pAMFαS.XYL2 (8.3 kb)와 pAMFα-P.XYL2 (8.4 kb) plasmid를 구축하였다(Fig. 1).

대상 데이터

Plasmid 구축 및 증폭을 위한 Escherichia coli 숙주세포는 DH5α를 사용하였고, 효모 숙주세포는 Saccharomyces cerevisiae SEY2102 (MATα ura3-52 leu2-3 leu2-112 his4-519 suc2△9)의 TRP1 (ORF 0.7kb)유전자가 KanMX 유전자로 대체되어 TRP1 유전자가 결실된 SEY2102△trp1 균주를 사용하였다.
효모 S. cerevisiae와 P. stipitis의 XYL2 유전자 발현을 위한 발현 plasmid는 유도성 promoter인 GAL10 promoter를 포함하는 pGMFα-S.XYL2와 pGMFα-P.XYL2를 구성적 promoter인 ADH1promoter를 포함하는 pAMFα-S.XYL2와 pAMFα-P.XYL2plasmid를 사용하였다.
S. cerevisiae 균주의 증식배지로는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)를 사용하였으며, 유전자 발현유도 시에는 YPDG 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 1% glucose, 1% galactose)를 사용하였다. 또한 탄소원의 종류 및 조성에 따른 유전자 발현률 비교를 위해서는 YPD(2%)G(2%), YPDGX (2% xylose) 및 YPG(2%)X(2%) 배지 등을 사용하였다.
cerevisiae 균주의 증식배지로는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)를 사용하였으며, 유전자 발현유도 시에는 YPDG 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 1% glucose, 1% galactose)를 사용하였다. 또한 탄소원의 종류 및 조성에 따른 유전자 발현률 비교를 위해서는 YPD(2%)G(2%), YPDGX (2% xylose) 및 YPG(2%)X(2%) 배지 등을 사용하였다. 형질전환체의 선별을 위한 배지로는 YNBCAD 배지(0.
또한 탄소원의 종류 및 조성에 따른 유전자 발현률 비교를 위해서는 YPD(2%)G(2%), YPDGX (2% xylose) 및 YPG(2%)X(2%) 배지 등을 사용하였다. 형질전환체의 선별을 위한 배지로는 YNBCAD 배지(0.67% yeast nitrogen base w/o amino acid, 0.5% casamino acid,2% glucose)를 사용하였다. 재조합 효모 균주는 5 ml YPD 배지에서 16~24시간 동안 전배양 한 후 10 ml YPDG 배지에 접종(initial OD600 0.
1M DTT 1 μl, Hyperscript™ Reverse Transcriptse (200U/μl) 1 μl, ZymAll™ RNase Inhibitor 1 μl를 첨가하여 55℃에서 60분간 반응 후, 85℃에서 5분 반응하여 ice에서 cooling 하였다. 합성된 cDNA는 PCR의 주형으로 사용되었고, S.XYL2및 P.XYL2 유전자의 증폭을 위해 S.XYL2-F와 S.XYL2-R, P.XYL2-F와 P.XYL2-R primer set을 사용하였다. Actin 단백질을 코드하는 ACT1 유전자는 internal control로서 ACT1-F (5’-ATCCAAGAGAGGTATCT-3’)와 ACT1-R (5’-CACACTTCATGATGGAG-3’) primer를 사용하여 증폭되었다.

데이터처리

Actin 단백질을 코드하는 ACT1 유전자는 internal control로서 ACT1-F (5’-ATCCAAGAGAGGTATCT-3’)와 ACT1-R (5’-CACACTTCATGATGGAG-3’) primer를 사용하여 증폭되었다. 전기영동 후 각각 signal intensity는 Scion image (http://www.scioncorp.com/)program을 이용하여 비교 분석하였다[14].

이론/모형

이렇게 구축된 재조합 plasmid는 E.coliDH5α에서 증폭, 추출되었고, S. cerevisiae 균주로 형질전환을 위해서는 salmon testes 유래의 single-stranded carrier DNA를 사용하는 high efficiency transformation법[6]을 이용하였다.
Primer는 각각 XbaI과 SalI 제한효소서열을 포함한 22bp vector서열을 포함하도록 디자인되었고, pGMFα-XYLP plasmid (vector)는 XbaI과 SalI 제한효소로 처리하여 cloning에 사용하였다. Cloning을 위해서 vector와 증폭된 XYL2 유전자의 일부분의 overlap region을 사용하여 fusion시키는 In-fusion cloning (Clonetech)법을 이용하였다
XYL2 유전자를 증폭하였다. pVT-103U plasmid를 BamHI과 XhoI 제한효소로 처리하여 vector로 사용하였고, In-fusion cloning 법을 이용하여 재조합 plasmid를 구축하였다. 이렇게 구축된 재조합 plasmid는 E.
Trizol method [9]를 통해 각 효모 균주의 total RNA를추출하였고, Hyperscript™ First strand synthesis Kit (GeneAllⓇ)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.

성능/효과

따라서SEY2102△trp1/pGMFα-P.XYL2 균주에서 xylitol dehydrogenase의 효소활성이 높게 나타난 것은 GAL10 promoter에 의해 조절된 P.XYL2 유전자의 transcription level의 증가에 의한 것으로 S. cerevisiae를 숙주세포로 하여 도입한 P.XYL2 유전자가 숙주세포 내에서 정상적인 전사, 번역시스템을 통해 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.
cerevisiae SEY2102△trp1 균주에 형질전환하여 YNBCAD배지에서 1차 선별하였다. 각 5개~10개의 형질전환체를 선별하여 XYL2 유전자의 유무를 확인해보기 위해 colony PCR을 수행한 결과, 모든 형질전환체에서 XYL2 유전자가 증폭되었음을 알 수 있었다(datanot shown). 다음으로 각 형질전환체들 중 1개의 형질전환체를 선별하여 YPDG 배지에서 48시간 배양한 후 xylitol dehydrogenase 활성을 비교해보았다(Table 1).
다음으로 각 형질전환체들 중 1개의 형질전환체를 선별하여 YPDG 배지에서 48시간 배양한 후 xylitol dehydrogenase 활성을 비교해보았다(Table 1). 먼저 promoter에따른 xylitol dehydrogenase 활성을 조사해 본 결과, ADH1promoter보다 GAL10 promoter를 사용하였을 때 xylitol dehydrogenase 활성이 5.8~8배 정도 증가됨을 확인 할 수 있었는데, 이는 XYL2유전자의 source에 상관없이 GAL10 promoter가 XYL2유전자의 발현에 더욱 적합함을 보여주는 것이다. 또한 xylitol dehydrogenase 활성에 영향을 미치는 cofactor의 종류(NAD⁺and NADP⁺)에 따른 효소활성을 비교해본 결과, S.
8~8배 정도 증가됨을 확인 할 수 있었는데, 이는 XYL2유전자의 source에 상관없이 GAL10 promoter가 XYL2유전자의 발현에 더욱 적합함을 보여주는 것이다. 또한 xylitol dehydrogenase 활성에 영향을 미치는 cofactor의 종류(NAD⁺and NADP⁺)에 따른 효소활성을 비교해본 결과, S.XYL2 유전자와 P.XYL2 유전자 모두 NAD+를 cofactor로 사용하였을 경우에 효소 활성이 3.5~7.7배 정도 높게나옴을 알 수 있었다. XYL2 유전자의 source 에 따른 xylitol dehydrogenase의 활성 정도를 promoter와 cofactor의 영향을반영하여 최종적으로 비교해 보면, P.
XYL2) 보다S. cerevisiae 숙주세포에서 약 2배 이상 높게 발현됨을 알 수 있었다. 따라서 S.
cerevisiae 숙주세포에서 약 2배 이상 높게 발현됨을 알 수 있었다. 따라서 S. cerevisiae 균주를 숙주세포로 사용하여 재조합 xylose dehydrogenase의 과발현을 유도하기 위해서는 유도적 promoter인 GAL10 promoter를 사용하는 것이 효율적이며, P. stipitis 유래의 xylitol dehydrogenase 효소활성이 더 높았으며, 효소활성의 증가를 위해 cofactor로 NAD+가 적합함을 확인하였다.
XYL2 유전자와 ACT1 유전자를 증폭하는 primer set로 PCR을 수행하였다. 그 결과, S.XYL2유전자와 P.XYL2 유전자 모두 ADH1 promoter 보다 GAL10promoter를 사용했을 때 각 유전자의 transcription level이 약 4배정도 증가되었음을 확인할 수 있었고(Fig. 2), 또한 P.XYL2유전자의 transcription level이 S.XYL2 유전자보다 약 1.7배정도 더 높게 나옴을 알 수 있었다(Fig. 2, lane 1 and 3). 따라서SEY2102△trp1/pGMFα-P.
Xylan을 xylose로 분해하는 β-xylosidase 효소의 경우에도MFα s.s에 의한 분비 생산을 유도했을 때, β-xylosidase단백질이 periplasmic space까지만 분비되는 것을 확인할 수 있었는데, 이 또한 β-xylosidase를 구성하는 소수성 아미노산의 비율과 막 투과성의 변화에 의한 것임을 알 수 있었다(data notshown).
하지만 세포추출액을 periplasmic space와 cytoplasmic space로 나누어서 조사해 본 결과, SEY2102△trp1/pGMFα-P.XYL2균주의 경우 효소활성의 약 77%가 periplasmic space에서 관찰되었으며, 이는 분비서열에 의해 cytosol에서 periplasmicspace까지 xylitol dehydrogenase가 분비되었음을 알 수 있었다.
3). 그 결과, 모든 형질전환균주에서 세포 밖(배지)으로 분비되는 xylitol dehydrogenase의 활성은 확인 할 수 없었으며, 대부분 세포 내에 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 하지만 세포추출액을 periplasmic space와 cytoplasmic space로 나누어서 조사해 본 결과, SEY2102△trp1/pGMFα-P.
XYL2균주의 경우 효소활성의 약 77%가 periplasmic space에서 관찰되었으며, 이는 분비서열에 의해 cytosol에서 periplasmicspace까지 xylitol dehydrogenase가 분비되었음을 알 수 있었다. 이는 xylitol dehydrogenase 단백질을 구성하는 아미노산의 charge 및 분비를 위한 다양한 factor의 영향에 의해 분비효율이 감소했을 가능성을 생각해 볼 수 있고, 분비서열의 사용에 의해서 다른 형질전환균주에서도 약 50%~61% 단백질을periplasmic space까지 분비시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.Xylan을 xylose로 분해하는 β-xylosidase 효소의 경우에도MFα s.
XYL2균주를 사용하여 다양한 배지조성과 조건에서 xylitol dehydrogenase의 활성 변화를 조사해보았다. 먼저 GAL10 promoter의 유도를 위해 사용하는 galactose 농도와 재조합 균주의 성장을 위한 glucose의 농도를 각각 1%에서 2%로 증가시켰을 경우, xylitol dehydrogenase의 활성은 약 20~34% 정도증가되었음을 알 수 있었다. 다음으로 전체적인 탄소원의 농도를 4%로 고정하고 xylose를 추가하여 xylitol dehydrogenase의 활성증가를 비교해 본 결과, YPD(1%)G(1%) 배지에서의 경우보다는 약 32~41%의 효소활성 증가를 보였고, YPD(2%)G (2%) 배지에서의 경우와 비교하였을 때는 약 5~10%정도의 활성 증가를 보임을 확인 할 수 있었다.
먼저 GAL10 promoter의 유도를 위해 사용하는 galactose 농도와 재조합 균주의 성장을 위한 glucose의 농도를 각각 1%에서 2%로 증가시켰을 경우, xylitol dehydrogenase의 활성은 약 20~34% 정도증가되었음을 알 수 있었다. 다음으로 전체적인 탄소원의 농도를 4%로 고정하고 xylose를 추가하여 xylitol dehydrogenase의 활성증가를 비교해 본 결과, YPD(1%)G(1%) 배지에서의 경우보다는 약 32~41%의 효소활성 증가를 보였고, YPD(2%)G (2%) 배지에서의 경우와 비교하였을 때는 약 5~10%정도의 활성 증가를 보임을 확인 할 수 있었다. 하지만 glucose가 배지중에 존재하지 않고 galactose와 xylose만 첨가한 배지에서는 세포의 성장속도 및 xylitol dehydrogenase 효소활성의 저하(약 46~58% 활성감소)됨이 관찰되었다(Table 2).
하지만 glucose가 배지중에 존재하지 않고 galactose와 xylose만 첨가한 배지에서는 세포의 성장속도 및 xylitol dehydrogenase 효소활성의 저하(약 46~58% 활성감소)됨이 관찰되었다(Table 2). 이러한 결과로 기존에 보고[2, 20, 23]된 S. cerevisiae 유래의 xylitol de-hydrogenase와는 달리, P. stipitis 유래의 재조합 xylitol dehydrogenase는 glucose와 xylose가 공존할 때 최대의 효소활성을 보인다는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 xylan 또는xylose로부터 바이오에탄올 생산을 위해 배지 중에 xylose가 첨가될 때 더 효율적인 xylitol dehydrogenase 활성 증가를기대 할 수 있을 것이다.
본 연구에서는 lignocellulosic biomass (xylose)를 이용한 바이오에탄올 생산 및 부산물의 효과적인 이용을 위해 xylitoldehydrogenase의 과발현시스템을 구축하였다. 효율적으로xylitol dehydrogenase를 분비 생산하기 위한 promoter의 선별, 유전자의 선별 및 탄소원에 대한 영향을 비교 분석하여 최적의 발현 조건을 제시하였으며, S. cerevisiae를 숙주세포로하여 외래 유전자의 발현이 잘 조절되고 있음을 확인 할 수있었다. 따라서, 본 연구에서 최적화한 발현 시스템은 xylose뿐만 아니라 다양한 biomass를 이용한 bioethanol 생산을 위한 관련 단백질의 발현 분비시스템 구축 및 대량생산에도 응용될 수 있을 것이라 생각된다.

후속연구

stipitis 유래의 재조합 xylitol dehydrogenase는 glucose와 xylose가 공존할 때 최대의 효소활성을 보인다는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 xylan 또는xylose로부터 바이오에탄올 생산을 위해 배지 중에 xylose가 첨가될 때 더 효율적인 xylitol dehydrogenase 활성 증가를기대 할 수 있을 것이다.
cerevisiae를 숙주세포로하여 외래 유전자의 발현이 잘 조절되고 있음을 확인 할 수있었다. 따라서, 본 연구에서 최적화한 발현 시스템은 xylose뿐만 아니라 다양한 biomass를 이용한 bioethanol 생산을 위한 관련 단백질의 발현 분비시스템 구축 및 대량생산에도 응용될 수 있을 것이라 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	S. cerevisiae는 왜 xylulose의 존재 하에서 잘 자랄 수 있는가?	S. cerevisiae는 상대적으로 xylose 이용은 잘 못하는데, xylulokinase의 활성이 좋기 때문에 xylulose의 존재 하에서는 잘 자랄 수 있다고 보고되고 있다[4, 22]. 하지만 S.
	S. cerevisiae에서 xylitol dehydrogenase의 활성이 각 연구마다 차이를 보인 이유는 무엇인가?	[23]은 xylitol dehydrogenase의 활성이 세포에서 검출되지 않았다고 보고했다. 이러한 활성의 차이를 보이는 것은 xylitol dehydrogenase가 배양 조건에 따라 활성이 달라지기 때문인데, glucose 존재 하에서 세포가 자랄 때는 xylitol dehydrogenase 활성이 검출되지 않고, xylose가 배지 중에 존재할 때에만 xylitol dehydrogenase의 활성을 나타내기 때문인 것으로 보고되었다[20]. 이는 xylitol dehydrogenase의 발현율(expression level)이 당(glucose, xylose)에 의해 조절된다는 것을 의미한다.
	Xylose의 대사에는 어떤 대사경로가 이용되는가?	cerevisiae 가 다른 여러 효모들(Pichia stipitis, Candida shehatae)과 달리 xylose에서 성장이나 발효를 할 수 없다고 할 지라도 매우 느리게는 xylose를 대사한다는 것도 보고 되어지고 있다[24]. Xylose의 대사에는 일반적으로 3개의 cytosolic enzymes (xylose reductase, xylitol dehydrogenase, and xylulokinase)이 관여하는 pathway가 이용되고, 이 효소들에 의해서 xylose는 pentose phosphate pathway를 통해 대사가 가능한 xylulose 5-phosphate로 전환이 가능해진다[7]. S.

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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