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문제 정의
- 본 연구에서는 패류 생산해역의 위생관리를 위한 육상오염원 저감화 대책과 패류 생산해역에서의 항균제 내성균 출현을 이해하는데 기초자료로 활용하고자 서해안 주요 패류 생산해역에서 양식되는 굴, 바지락 및 가무락에서 대장균 및 장염비브리오균을 분리하고, 각각의 분리 균주가 가진 항균제 내성 특성을 조사 비교하였다.
제안 방법
- 각 균주를 muller hinton broth (Merck, Germany) 에서 35℃, 18-24시간 배양한 다음 균 배양액의 농도를 McFarland No. 0.5로 희석 조정한 후 대장균은 염을 첨가하지 않은 muller hinton agar (Merck, Germany) 평판에 장염비브리오균은 2% NaCl이 첨가된 muller hinton agar 평판에 도말하고, 5 분간 방치한 후 항균제 디스크(Φ 8 mm)를 평판에 고착시켰다.
- 분리된 대장균을 0.5% NaCl이 첨가된 tryptic soy agar (Merck, Germany)에 장염비브리오균은 2% NaCl이 첨가된 tryptic soy agar에 배양한 후 0.85% NaCl 용액에 배양한 대장균 및 장염비브리오균을 현탁하여 McFarland No. 0.5로 조정하고, VI-TEK 2 GN card (BioMerieux Vitek, France)에 균 현탁액을 주입한 후 VITEK system (BioMerieux Vitek, France)를 이용하여 대장균 및 장염비브리오균을 동정하여 항균제 감수성 시험 균주로 사용하였다.
- 서해안 굴, 가무락 및 바지락에서 분리한 E. coli (총 156균주) 및 V. parahaemolyticus (총 194균주)를 대상으로 12종의 항균제에 대하여 감수성 시험을 실시하였으며, 그 결과를 Table 2에 나타내었다. 분리된 E.
- 즉, 패류 시료를 0.1% peptone 희석수를 첨가하여 파쇄한 후 minerals modified glutamate medium (Oxoid, UK)에 접종하여 37±1℃에서 18-24시간 동안 증균 배양하고, tryptone bile glucuronoide agar (Oxoid, UK)에 획선 도말하여 전형적인 반응을 나타내는 청색 집락(Blue colony) 또는 청녹색 집락 (Blue-green colony)을 분리하였다.
- 항균제는 ampicillin (10 µg; AM), gentamicin (10 µg; GM),streptomycin (10 µg; S), amoxicillin/clavulanic acid (20 µg/10 µg; AMC), rifampin (5 µg; RA), chloramphenicol (30 µg;C), tetracycline (30 µg; TE), trimethoprim (5 µg; TMP), trimethoprim/sulfamethoxazole (1.25 µg/23.75 µg; SXT), cefo-taxime (30 µg; CTX), nalidixic acid (30 µg; NA), ciprofloxacin(5 µg; CIP)을 사용하였으며, 미국 CLSI (2012)의 정도 관리 허용기준(Quality control range)에 부합됨을 확인한 후 감수성 시험을 실시하였다.
대상 데이터
- 대장균(E. coli) 및 장염비브리오균(V. parahaemolyticus) 분리를 위하여 2013년 6월부터 11월까지 서해안에서 상업적 패류 생산이 왕성하게 이루어지고 있는 인천광역시 강화군 강화도 남부 해역에서는 굴(Crassostrea gigas), 바지락(Ruditapes philippinarum) 및 가무락(Cyclina sinensis), 인천광역시 옹진군 덕적자월면 해역에서는 굴 및 바지락, 충청남도 태안군 이원면 해역에서는 굴, 전라북도 고창군 곰소만 해역에서는 바지락을 채취하여 대장균 및 장염비브리오균의 항균제 내성 특성 조사를 위한 시험시료로 사용하였다.
- 증균 배양액을 thiosulfate citrate bile salt agar (Difco, France) 에 획선 도말하여 35℃에서 24시간 배양한 후, 전형적인 반응을 나타내는 균주를 대상으로 VITEK system (Biomerieux,France)로 동정하기 위한 분리 균주로 사용하였다.
- 1% peptone 희석수를 첨가하여 파쇄한 후 minerals modified glutamate medium (Oxoid, UK)에 접종하여 37±1℃에서 18-24시간 동안 증균 배양하고, tryptone bile glucuronoide agar (Oxoid, UK)에 획선 도말하여 전형적인 반응을 나타내는 청색 집락(Blue colony) 또는 청녹색 집락 (Blue-green colony)을 분리하였다. 청색 또는 청녹색 집락을 순수 배양한 후 VITEK system (BioMerieux Vitek, France)로 동정하기 위한 분리 균주로 사용하였다.
이론/모형
- 대장균의 분리는 ISO/TS 16649-3 (2005)의 방법에 따라 실시하였다. 즉, 패류 시료를 0.
- 분리 동정된 각각의 대장균 및 장염비브리오균에 대한 항균제 감수성 평가는 Acar and Goldstein (1991)의 디스크 확산법을 이용하였다. 각 균주를 muller hinton broth (Merck, Germany) 에서 35℃, 18-24시간 배양한 다음 균 배양액의 농도를 McFarland No.
- 장염비브리오균의 분리는 Bacteriological Analytical Manual 의 방법에 준하여 실시하였다(Elliot et al., 1995). 박신한 패육과 패액에 phosphate buffered saline (PBS: 140 mM NaCl, 5 mM anhydrous Na 2 HPO 4 and 1.
성능/효과
- 1%) 순으로 항균제 내성율이 높았다. 또한 E.coli는 streptomycin, rifampin, cefotaxime, ciprofloxacin에 대해서는 5% 이하의 내성율을 나타내었으며, gentamicin에 대해서는 모든 분리된 E. coli 균주에서 감수성인 것으로 확인되었다.
- parahaemolyticus 균주들의 ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid 내성율의 차이는 미비하였으나, trimethoprim에 대한 내성 율은 다소 차이가 있었다. 또한, streptomycin, chloramphenicol, tetracycline, cefotaxime, ciprofloxacin에 대해서는 E. coli 균주들에서만 내성이 확인되었고, 분리된 V. parahaemolyticus 균주들은 모두 감수성을 나타내어 항균제에 대한 내성 차이를 확인할 수 있었다.
- , 1998). 본 연구에서 3종 이상의 항균제에 내성을 나타내는 다제내성균은 E. coli 및 V. parahaemo-lyticus 분리 균주들에서 각각 14균주(9.0%) 및 2균주(1.0%)로 확인되어 V. parahaemolyticus 보다는 E. coli 분리 균주에서 다제내성균이 많이 검출되었다(Table 3 및 Table 4). Yu et al.
- parahaemolyticus (총 194균주)를 대상으로 12종의 항균제에 대하여 감수성 시험을 실시하였으며, 그 결과를 Table 2에 나타내었다. 분리된 E. coli 156균주는 ampicillin (34.0%)에 대한 내성율이 가장 높게 나타내었으며, trimethoprim (11.5%),amoxicillin/clavulanic acid (9.0%), chloramphenicol (5.8%), trimethoprim/sulfamethoxazole (5.8%), tetracycline (5.1%),nalidixic acid (5.1%) 순으로 항균제 내성율이 높았다. 또한 E.
- 6%의 내성 율을 보였다. 분리된 V. parahaemolyticus는 rifampin, trimethoprim/sulfamethoxazole, nalidixic acid에 대한 내성율은 1% 이하로 확인되었고, gentamicin, streptomycin, chloramphenicol, tetracycline, cefotaxime, ciprofloxacin에 대해서는 모든 분리 균주에서 감수성으로 나타났다.
- 서해안 패류양식장에서 채취한 90개 시료에서 E. coli는 156 균주, V. paraheamolyticus 194균주가 분리 동정되었으며, 조사 해역별로 살펴보면 강화도 남부 해역의 굴 6개, 바지락 6개 및 가무락 6개 시료에서 E. coli 및 V. parahaemolyticus가 각각 27균주 및 35균주, 덕적자월면 해역의 굴 12개 및 바지락 30개 시료에서 E. coli 75균주와 V. parahaemolyticus 76균주를 분리하였다. 이원면 해역과 곰소만에서 생산되는 굴 및 바지락에서 E.
- 이상의 결과 비브리오균 중 일부는 내성인자들을 수계 침전물이나 주변 환경으로부터 획득할 수 있다는 보고(Neela et al., 2007)로 볼 때 V. parahaemolyticus의 항균제 내성율 차이는 수산물 등 시료의 종류, 생활 특성 및 해역 환경 차이에 의한 것으로 추정된다. 여러 종류의 항균제에 내성을 나타내는 균들을 다제내성균(Multiple antimicrobial resistance bacteria, MARB) 이라고 부르며, 이러한 다제내성균의 출현과 내성유전자의 확산은 질병치료를 어렵게 만들고 있어 세계적인 문제로 대두되고 있다(Den nesen et al.
- parahaemolyticus 9균주가 분리되었다. 이상의 결과, E. coli는 굴 보다는 바지락에서 많이 분리되었는데 바지락은 펄에서 바닥식으로 양식되고 있어 육상에서 유입되는 오염물질의 영향을 굴 보다는 더 쉽게 받는 서식 환경지의 특성에 기인한 것으로 보인다.
- 이상의 결과, 서해안 패류양식장에서 분리된 E. coli 및 V.parahaemolyticus 균주들의 ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid 내성율의 차이는 미비하였으나, trimethoprim에 대한 내성 율은 다소 차이가 있었다. 또한, streptomycin, chloramphenicol, tetracycline, cefotaxime, ciprofloxacin에 대해서는 E.
- parahaemolyticus 76균주를 분리하였다. 이원면 해역과 곰소만에서 생산되는 굴 및 바지락에서 E. coli는 각각 32균주 및 23균주가 분리되었고, V.parahaemolyticus의 경우 굴에서는 57균주, 바지락에서는 26균주가 분리되었다. 한편, 바지락(48개)에서는 E.
- 한편, V. parahaemolyticus 194균주는 ampicillin (41.8%)에 대한 내성율이 가장 높게 나타내었으며, amoxicillin/clavulanic acid 및 trimethoprim에 대해서는 각각 10.8% 및 2.6%의 내성 율을 보였다. 분리된 V.
- 한편, V. parahaemolyticus는 굴과 바지락에서 거의 비슷한 수준으로 분리되었으며, 이는 6월부터 11월까지는 V. parahae-molyticus이 생육하기 적당한 수온이며, 해수 중에 존재하는 V.parahaemolyticus을 여과섭식(Filter-feeding) 과정에서 패류 체내에 V. parahaemolyticus가 농축되므로 패류에서 비슷한 수준으로 분리된 것으로 추정된다. Yu et al.
후속연구
- 따라서, 수산물 생산해역에서의 항균제 내성균에 대한 지속적인 모니터링이 필요하며, 생산해역에서 내성균 확산 방지와 수산물의 안전성 확보를 위해 육상 오염물질 유입 차단을 위한 적절한 오염원 관리 대책 수립과 더불어 어류양식장에서 사용되는 항균제의 오·남용 방지를 위해 사용자에 대한 교육과 관리당국의 지속적 점검이 요구된다
- 한편, 패류는 해수 중의 세균을 체내에 농축하는 특성이 있고, 육상과 인접한 해역에서 서식하는 특성으로 육상 오염물질의 영향을 쉽게 받기 때문에 수산물 생산해역에서의 항균제 내성균의 출현과 내성 패턴의 변화 추이를 파악할 수 있는 좋은 지표 생물이 될 수 있을 것으로 사료되지만, 굴 등 일부 수산물은 가열조리 과정 없이 날 것으로 많이 섭취하기 때문에 항균제 내성균의 존재는 사회적 문제로 대두 될 수 있을 것으로 추정된다. 또한, 항균제 내성인자를 보유한 내성균이 하천이나 마을 하수를 통해 연안해역으로 유입되며 해양환경에 존재하는 이종 또는 동종 세균으로 plasmid, transposon, integron 등과 같은 이동성 인자(mobile element)의 수평적 전이(horizontal transfer)를 통해 내성균의 확산을 배제할 수 없다(Fiqueira et al.
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