[논문]LC-MS/MS를 이용한 패류 및 피낭류 중 마비성 패류독소 분석법의 유효성 검증

조성래; 김동욱; 유헌재; 조성해; 류아라; 이가정; 목종수

doi:10.5657/kfas.2020.0174

LC-MS/MS를 이용한 패류 및 피낭류 중 마비성 패류독소 분석법의 유효성 검증
Validation of LC-MS/MS Method for Analysis of Paralytic Shellfish Toxins in Shellfish and Tunicates 원문보기

한국수산과학회지 = Korean journal of fisheries and aquatic sciences, v.53 no.2, 2020년, pp.174 - 180

조성래 (국립수산과학원 식품위생가공과) , 김동욱 (국립수산과학원 식품위생가공과) , 유헌재 (국립수산과학원 식품위생가공과) , 조성해 (국립수산과학원 식품위생가공과) , 류아라 (국립수산과학원 식품위생가공과) , 이가정 (국립수산과학원 식품위생가공과) , 목종수 (국립수산과학원 식품위생가공과)

Abstract ▼ AI-Helper

The mouse bioassay has been used widely for the monitoring of paralytic shellfish toxins (PSTs) in many countries. However, this method shows low sensitivity and high limit of detection (LOD), as well as it cannot confirm toxic profiles. Recently, LC-MS/MS method was studied for the quantitative of PSTs, however, the method has any problems with unstable retention times by ionization suppression caused by high salt concentration in shellfish extracts. To establish an alternative method for PSTs analysis, we tried to original LC-MS/MS methods adding desalting operation using amorphous graphitized polymer carbon solid-phase extraction cartridges. The method validation was conducted to determine linearity, limit of detection, limit of quantification (LOQ), accuracy, and precision in quantifying PSTs. The correlation coefficients for all tested PSTs maintained over 0.999. The LODs and LOQs for all PSTs were about 0.19-1.05 ㎍/kg and 0.58-3.18 ㎍/kg, respectively. The accuracies for PSTs were 95.4-107.7% for saxitoxin group, 97.1-100.9% for gonyautoxin group, 99.0-100.8% for N-sulfocarbamoyl toxin group, and 96.8-104.6% for decarbamoyl toxin group. These results indicate that the modified LC-MS/MS method was appropriate for analyzing the PSTs in shellfish and tunicates.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. Mass spectrometry parameters
표 Table 2. LC-MS/MS operating condition for the analysis of paralytic shellfish toxins
표 Table 3. Linearity, limits of detection (LOD) and limits of quantitation (LOQ) of paralytic shellfish toxins (n=5)
표 Table 4. Accuracy, intra-day repeatability and inter-day reproducibility of analytical method for paralytic shellfish toxins (n=5)
표 Table 5. Recovery of paralytic shellfish toxins in shellfish (n=5)
표 Table 6. Recovery of paralytic shellfish toxins in tunicates (n=5)

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

, 2015). 그리고 이 분석법에 대한 유효성을 검정하 고, 우리나라 연안 주요 패류 및 피낭류의 생산품종 특성에 부합 하는지 그 타당성을 검토하고자 하였다.
본 연구에서는 우리나라 마비성 패류독소의 공인 시험법인 동 물시험법을 대체할 수 있는 최적 기기분석법을 확립하기 위하 여 liquid chromatograph-tandem mass spectrometry (LC-MS/ MS)를 이용한 분석법에 대한 선행연구를 검토하여 최적의 분 석조건을 제시하였다(Quilliam et al., 1989; Song et al., 2013; Turner et al., 2015). 그리고 이 분석법에 대한 유효성을 검정하 고, 우리나라 연안 주요 패류 및 피낭류의 생산품종 특성에 부합 하는지 그 타당성을 검토하고자 하였다.

제안 방법

시험법의 정확성을 확인하기 위해 우리나라 대표 이매패류 중 하나인 담치를 선택하였고 독이 없음을 확인하고 실험을 진행하였다. 3가지 농도의 표준용액을 첨가하여 5회 반복 측정하였고 일내(intra-day) 및 일간(inter-day)실험을 통해 정확성과 정밀성을 확인하였다. STX group의 일내 정확성과 정밀성은 각각 95.
LC-MS/MS를 이용한 마비성 패류독소 분석법 확립을 위하 여 Xevo TQ-S tandem quadrupole mass spectrometer (Waters, Milford, MA, USA)와 Acquity UPLC H-class (Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였고, column은 Acquity BEH Amide UPLC column (1.7 μm, 2.1 mm×50 mm; Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였다.
또한, LC-MS/MS 분석법이 우리나라 연안 주요 패류 및 피낭 류 생산품종특성에 부합하는지 이에 따른 타당성을 검토하기 위해 독이 없는 것으로 확인된 담치(Mussel Mytilus galloprovinciallis), 굴(Oyster Crassostrea gigas), 바지락(Short-necked clam Ruditapes philippinarum), 개조개(Butter clam, Saxidomus purpuratus), 키조개(Comb pen shell Atrina pinnata), 가리비(Scallop Argopecten irradians), 새조개(Ark shell Scapharca broughtonii) 등 패류 7종과, 멍게 (Sea squirt Halocynthia roretzi), 미더덕(Warty sea squirt Styela clava) 등 피낭류 2종의 시료에 총 12종의 마비성 패류독소 표준물질을 첨가하여 위와 동 일한 방법으로 추출 한 후 회수율을 확인하였다.
우리나라 연안 주요 패류 7종 및 피낭류 2종에 대하여 확립된 LC-MS/MS를 이용한 마비성 패류독소 분석법을 적용하여 그 타당성을 검토하였고, 일정 농도의 표준용액 제조 후 시료 에 첨가하여 위와 같은 방법으로 추출한 후 5회 반복 측정하여 품종 별 회수율을 확인하였다. 패류 7종 중 담치의 회수율은 91-115%, 굴에서 46-126%, 바지락에서 82-117%, 새꼬막에서 74-112%, 키조개에서 75-116%, 개조개에서 70-106%, 가리비 에서는 77-115%의 결과를 보였다(Table 5).
LC-MS/MS 분석법의 유효성 검증을 위하여 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantitation, LOQ), 정확성(recovery), 정밀성(precision) 등을 Codex Alimentarius Commission (2014)의 지침에 따라 검토 하였다. 정확성과 정밀성은 패류(담치)에 총 12종의 마비성패 류독소 표준물질[NRC, CRM (certified reference material)]을 3가지 농도로 조제 후 첨가하여 위와 동일한 방법으로 추출 한 다음 일내(intra-day)정밀성을 1일 5회 및 일간(inter-day)정밀 성실험을 3일 5회 반복 측정하였다. 검출한계와 정량한계는 표준용액을 5회 반복 측정한 검량선을 작성하여 검량선의 기울기 와 y절편의 표준편차를 이용하여 구하였으며, 검량선 y절편 값 의 표준편차에 3.
확립된 LC-MS/MS 분석법 유효성검증을 위하여 표준물질 12종을 섞은 mixture를 6개의 농도범위로 제조하여 직선성을 검토하였다. 시험 시 오차범위를 확인하기 위해 5회 반복 분석 한 결과 12종의 모든 표준물질의 상관계수(R2 )는 0.

대상 데이터

Louis, MO, USA)을 사용하였다. 고상 추출(solid phase extraction, SPE) 카트리지(cartridge)는 ENVI-Carb SPE cartridge (250 mg/3 mL, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하였고, 카트리지는 활성화 시킨 후 추출물을 흡착시켜 염을 정제하는 과정에 사용되었다. 정제에 사용된 용매 는 acetic acid, acetonitrile (Merck, Darmstadt, Germany) 및 ammonium hydroxide (Sigma, St.
마비성 패류독소 분석을 위한 표준독소는 인증표준물질(certified reference material) 등급의 saxitoxin (STX), decarbamoyl-saxitoxin (dcSTX), gonyautoxin (GTX) 1 & 4, GTX 2 & 3, GTX 5, decarbamoyl-gonyautoxins (dcGTX) 2 & 3, neosaxitoxin (NEO) 및 protogonyautoxin (C) 1 & 2를 National Research Council (NRC; Halifax, Canada)에서 구입하여 분석에 사용하였다.
시험법의 정확성을 확인하기 위해 우리나라 대표 이매패류 중 하나인 담치를 선택하였고 독이 없음을 확인하고 실험을 진행하였다. 3가지 농도의 표준용액을 첨가하여 5회 반복 측정하였고 일내(intra-day) 및 일간(inter-day)실험을 통해 정확성과 정밀성을 확인하였다.
Louis, MO, USA)을 사용하 였다. 이동상 제조에는 formic acid (Fluka, Buchs, Germany), ammonium hydroxide (Sigma, St. Louis, MO, USA), acetonitrile (Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였으며, 탈 이 온수는 Milli-Q water purification system (Millipore, Bedford, MA, USA)에서 정제하여 사용하였다.
1 mm×50 mm; Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였다. 이동상으로 A 용액은 0.015% formic acid와 0.06% ammonium hydroxide가 되도 록 제조하여 사용하였고, B 용액은 70% acetonitrile와 0.01% formic acid가 되도록 제조하여 사용하였다. 마비성 패류독소 의 질량분석은 electrospray ionization (ESI)법의 positive 또는 negative ion mode를 사용하였으며, multiple reaction monitoring (MRM) 조건으로 분석하였다(Table 1, 2).
Louis, MO, USA)를 사용하였고, 카트리지는 활성화 시킨 후 추출물을 흡착시켜 염을 정제하는 과정에 사용되었다. 정제에 사용된 용매 는 acetic acid, acetonitrile (Merck, Darmstadt, Germany) 및 ammonium hydroxide (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하 였다. 이동상 제조에는 formic acid (Fluka, Buchs, Germany), ammonium hydroxide (Sigma, St.

데이터처리

정확성과 정밀성은 패류(담치)에 총 12종의 마비성패 류독소 표준물질[NRC, CRM (certified reference material)]을 3가지 농도로 조제 후 첨가하여 위와 동일한 방법으로 추출 한 다음 일내(intra-day)정밀성을 1일 5회 및 일간(inter-day)정밀 성실험을 3일 5회 반복 측정하였다. 검출한계와 정량한계는 표준용액을 5회 반복 측정한 검량선을 작성하여 검량선의 기울기 와 y절편의 표준편차를 이용하여 구하였으며, 검량선 y절편 값 의 표준편차에 3.3배를 곱한 값을 기울기 평균값으로 나눈 값을 검출한계, 10배를 곱한 값에 기울기 평균값 나눈 값을 정량한계로 설정하여 평가하였다.

이론/모형

LC-MS/MS 분석법의 유효성 검증을 위하여 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantitation, LOQ), 정확성(recovery), 정밀성(precision) 등을 Codex Alimentarius Commission (2014)의 지침에 따라 검토 하였다. 정확성과 정밀성은 패류(담치)에 총 12종의 마비성패 류독소 표준물질[NRC, CRM (certified reference material)]을 3가지 농도로 조제 후 첨가하여 위와 동일한 방법으로 추출 한 다음 일내(intra-day)정밀성을 1일 5회 및 일간(inter-day)정밀 성실험을 3일 5회 반복 측정하였다.
01% formic acid가 되도록 제조하여 사용하였다. 마비성 패류독소 의 질량분석은 electrospray ionization (ESI)법의 positive 또는 negative ion mode를 사용하였으며, multiple reaction monitoring (MRM) 조건으로 분석하였다(Table 1, 2).

성능/효과

N-sulfocarbamoyl toxin group (GTX5, C1, C2)의 검출한계는 0.42, 1.03 및 0.23 μg/kg, 정량한계는 1.26, 3.11 및 0.69 μg/kg이었으며, decarbamoyl toxin group (dcSTX, dcGTX2, 3)의 검출한계 는 0.27, 0.53 및 0.23 μg/kg, 정량한계는 0.81, 1.61 및 0.69 μg/ kg으로 나타났다(Table 3).
23%의 정밀성을 나타내었다. N-sulfocarbamoyl toxin group 의 일간 정확성과 정밀성은 98.7-100.5%의 정확성과 1.06- 3.53%의 정밀성을 나타내었고, Decarbamoyl toxin group에 서의 일간 정확성과 정밀성은 98.1-103.5%의 정확성 그리고 1.04-2.93%의 정밀성의 결과를 나타내었다(Table 4). Codex Alimentarius Commission (2014)과 AOAC (2013)의 표준물질 첨가 농도에 따른 정확성 및 정밀성의 권장기준을 확인하였을 때, 정확성은 10 μg/kg에서 60-115% 그리고 100 μg/kg에 서 80-110%을 요구하고 있으며, 정밀성의 경우 10 μg/kg에서 21%보다 낮은 정밀성을 요구하며 그리고 100 μg/kg는 15%보다 낮은 정밀성을 요구하고 있다.
47%를 나타내었다. N-sulfocarbamoyl toxin group의 일내 정확성과 정밀성은 99.0-100.8% 및 0.86-3.53%를 나타내었고, decarbamoyl toxin group에서의 일내 정확성과 정밀성은 96.8-104.6% 및 0.58-2.20%의 결과를 나타내었다(Table 4). 또 한, 일간 정확성 및 정밀성은 3일간 5회 반복 측정하여 나타내었다.
또 한, 일간 정확성 및 정밀성은 3일간 5회 반복 측정하여 나타내었다. STX group의 일간 정확성과 정밀성은 각각 96.7-106.6%의 정확성과 1.89-3.85%의 정밀성을 나타내었고, GTX group의 일간 정확성과 정밀성은 각각 96.6-101.3%의 정확성과 1.40- 5.23%의 정밀성을 나타내었다. N-sulfocarbamoyl toxin group 의 일간 정확성과 정밀성은 98.
3가지 농도의 표준용액을 첨가하여 5회 반복 측정하였고 일내(intra-day) 및 일간(inter-day)실험을 통해 정확성과 정밀성을 확인하였다. STX group의 일내 정확성과 정밀성은 각각 95.4-107.7% 및 1.34-3.30%의 범위를 나타내었고, GTX group의 일내 정확성과 정밀성은 각각 97.1-100.9% 및 0.78- 4.47%를 나타내었다. N-sulfocarbamoyl toxin group의 일내 정확성과 정밀성은 99.
10 이었고, 나머지 마비성 패류독소 구 성성분과 비교해 상대적으로 낮은 값을 나타내고 있었으며 굴 에서 C1의 회수율이 비교적 낮았고, 피낭류 2종에서 C2의 회수율이 비교적 높았지만 전체 독량을 대비하여 보았을 때 큰 영향 을 미치지 않을 것으로 보인다. 따라서 본 연구에서 확립한 LCMS/MS를 이용한 마비성 패류독소 분석법은 우리나라 주요 패류 및 피낭류 분석에 있어서 문제가 없을 것으로 판단된다. 또한, LC-MS/MS를 이용한 마비성 패류독소 분석법은 비교적 낮은 검출한계와 약 12가지의 마비성 패류독소 성분을 동시에 정량할 수 있다는 장점이 있다.
피낭류 2종 중 멍게의 회수율은 77-138%, 미더덕에서는 70-141%의 결과를 나타냈다(Table 6). 본 실험결과에 따르면 굴에서 C1 값이 46%로 낮은 회수율을 보였으며, 피낭류 2종에서 C2 값이 138-141%로 높은 회수율을 보였다. Turner et al.
40이었다. 상대 비독성을 고려하였을 때, C1, C2의 상대비독성은 각각 0.01, 0.10 이었고, 나머지 마비성 패류독소 구 성성분과 비교해 상대적으로 낮은 값을 나타내고 있었으며 굴 에서 C1의 회수율이 비교적 낮았고, 피낭류 2종에서 C2의 회수율이 비교적 높았지만 전체 독량을 대비하여 보았을 때 큰 영향 을 미치지 않을 것으로 보인다. 따라서 본 연구에서 확립한 LCMS/MS를 이용한 마비성 패류독소 분석법은 우리나라 주요 패류 및 피낭류 분석에 있어서 문제가 없을 것으로 판단된다.
확립된 LC-MS/MS 분석법 유효성검증을 위하여 표준물질 12종을 섞은 mixture를 6개의 농도범위로 제조하여 직선성을 검토하였다. 시험 시 오차범위를 확인하기 위해 5회 반복 분석 한 결과 12종의 모든 표준물질의 상관계수(R2 )는 0.99이상을 유지하는 높은 직선성을 나타내었다(Table 3).
77 μg/kg이었다. 이를 보았을 때 본 시험의 결과는 양호한 수준으로 확인되었다.
우리나라 연안 주요 패류 7종 및 피낭류 2종에 대하여 확립된 LC-MS/MS를 이용한 마비성 패류독소 분석법을 적용하여 그 타당성을 검토하였고, 일정 농도의 표준용액 제조 후 시료 에 첨가하여 위와 같은 방법으로 추출한 후 5회 반복 측정하여 품종 별 회수율을 확인하였다. 패류 7종 중 담치의 회수율은 91-115%, 굴에서 46-126%, 바지락에서 82-117%, 새꼬막에서 74-112%, 키조개에서 75-116%, 개조개에서 70-106%, 가리비 에서는 77-115%의 결과를 보였다(Table 5). 피낭류 2종 중 멍게의 회수율은 77-138%, 미더덕에서는 70-141%의 결과를 나타냈다(Table 6).
패류 7종 중 담치의 회수율은 91-115%, 굴에서 46-126%, 바지락에서 82-117%, 새꼬막에서 74-112%, 키조개에서 75-116%, 개조개에서 70-106%, 가리비 에서는 77-115%의 결과를 보였다(Table 5). 피낭류 2종 중 멍게의 회수율은 77-138%, 미더덕에서는 70-141%의 결과를 나타냈다(Table 6). 본 실험결과에 따르면 굴에서 C1 값이 46%로 낮은 회수율을 보였으며, 피낭류 2종에서 C2 값이 138-141%로 높은 회수율을 보였다.

후속연구

또한, LC-MS/MS를 이용한 마비성 패류독소 분석법은 비교적 낮은 검출한계와 약 12가지의 마비성 패류독소 성분을 동시에 정량할 수 있다는 장점이 있다. 나아가 우리나라 시기 또는 해역 에 따른 마비성 패류독소 구성성분의 양상 확인 등에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	대표적인 패류독소는?	, 2000). 이들 패류독소에는 Alexandrium spp., Gymnodinium sp. 등이 생산하는 것으로 중독 시 마비를 유발하는 마비성 패류독소 (paralytic shellfish poison), 와편모조류인 Dinophysis spp.와 Prorocentrum spp.에 의해 생산되는 것으로 설사를 유발하는 설사성 패류독소(diarrhetic shellfish poison), Pseudonitzschia spp.가 생산하는 것으로 신경계 장애를 유발하는 기억상실성 패류독소(amnestic shellfish poison) 등이 대표적이며, 이 외에 도 다수의 독소 성분이 알려져 있다(Noguchi, 2003; Mok et al., 2012; Lee et al.
	마비성 패류 독소로 최초의 사망 사고는?	, 2012). 마비성 패류 독소로 인한 최초의 사망 사고는 알래스카에서 1790년 러시아의 탐험대가 홍합(Mytilus californianus)을 먹고 100여명이 사망한 사례이며, 그 후 캐나다의 대서양과 태평양 연안에서 발생하였고, 우리나라의 이웃나라인 일본, 중국 또한 이로 인한 사망사고가 보고되어있다(Noguchi, 2003). 우리나라의 경우에는 1986년 부산 감천 만에서 진주담치(Mytilus edulis)를 섭취하고 2명이 사망한 사고가 최초의 기록이며, 이후에도 경남 연안의 진해만 등에서는 매년 반복적으로 마비성 패류독소가 검출되고 있다(Chang et al.
	마비성 패류 독소로 사망한 국내 최초 기록은?	마비성 패류 독소로 인한 최초의 사망 사고는 알래스카에서 1790년 러시아의 탐험대가 홍합(Mytilus californianus)을 먹고 100여명이 사망한 사례이며, 그 후 캐나다의 대서양과 태평양 연안에서 발생하였고, 우리나라의 이웃나라인 일본, 중국 또한 이로 인한 사망사고가 보고되어있다(Noguchi, 2003). 우리나라의 경우에는 1986년 부산 감천 만에서 진주담치(Mytilus edulis)를 섭취하고 2명이 사망한 사고가 최초의 기록이며, 이후에도 경남 연안의 진해만 등에서는 매년 반복적으로 마비성 패류독소가 검출되고 있다(Chang et al., 1989; Mok et al.

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Yang X, Zhou L, Tan Y, Shi X, Zhao Z, Nie D, Zhou C and Liu H. 2017. Development and validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method coupled with dispersive solid-phase extraction for simultaneous quantification of eight paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish. Toxins 9, 206. https://doi.org/10.3390/toxins9070206.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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